مقالة منهجية

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

DOI:

10.3791/61680

⸱

سبتمبر 20, 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH) هو وسيلة لتحديد مستويات بدقة وتوطين الحمض النووي الريبي محددة على مستوى الخلية الواحدة. هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات المختبر المعتمدة لدينا لمعالجة مقاعد البدلاء الرطبة والتصوير وتحليل الصور للقياس الكمي لخلايا واحدة من RNAs محددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النسخ الجيني هو عملية أساسية في بيولوجيا الخلايا، ويسمح للخلايا بتفسير الإشارات الداخلية والخارجية والاستجابة لها. تفتقر الطرق السكانية السائبة التقليدية (البقعة الشمالية، PCR، وRNAseq) التي تقيس مستويات الحمض النووي الريبي إلى القدرة على توفير معلومات عن الاختلاف بين الخلايا في الاستجابات. خلية واحدة دقيقة والتصور allelic والتحديد الكمي ممكن عن طريق جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH). يتم تنفيذ RNA-FISH عن طريق تهجين الحمض النووي الريبي المستهدف مع مسابير أوليغونوكليوتيد المسماة. ويمكن تصوير هذه الأساليب في طرائق متوسطة/عالية الإنتاجية، ومن خلال خطوط أنابيب تحليل الصور، توفر بيانات كمية عن كل من الرنانات الناضجة والناضجة، وكلها على مستوى الخلية الواحدة. وقد تم تحسين التثبيت، permeabilization، التهجين وخطوات التصوير في المختبر على مدى سنوات عديدة باستخدام نظام النموذج الموصوف هنا، مما يؤدي إلى تحليل خلية واحدة ناجحة وقوية من وسم سمك البحر المتوسط. الهدف الرئيسي مع إعداد العينات ومعالجتها هو إنتاج صور عالية الجودة تتميز بنسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء للحد من الإيجابيات الكاذبة وتوفير بيانات أكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكول يصف خط الأنابيب من إعداد العينات إلى تحليل البيانات بالتزامن مع الاقتراحات وخطوات التحسين لتكييفها مع عينات محددة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النسخ الجيني والترجمة هما عمليتان رئيسيتان تشاركان في العقيدة المركزية لعلم الأحياء ، من تسلسل الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين1. في هذه الدراسة، ونحن نركز على إنتاج الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) أثناء النسخ. جزيء الحمض النووي الريبي الوليدة يتضمن كل من introns غير الترميز وإكسونات الترميز. Introns هي مقسمة نسخا قبل أن ينتقل إلى الخلايا مرنا للترجمة على ريبوسوم2,3.

تقليديا، يتم إجراء قياس الحمض النووي الريبي في مجموعات كبيرة من الخلايا (مئات إلى ملايين) مع المقايسات الكلاسيكية مثل RT-qPCR أو النشاف الشمالي. في حين قوية جدا، وهذه الأساليب محدودة لأنها لا توفر رؤى في الاختلاف من خلية إلى خلية (التغايرية الظاهري)، وتحديد عدد الأليل النشطة نسخيا، وربما الأهم من ذلك، تفتقر إلى المعلومات المكانية. وفي الآونة الأخيرة، بدأت تقنيات الجينوم واسعة تسمح لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (RNAseq) لسد الفجوة بين أساليب التصوير والتسلسل4. ومع ذلك، يعاني RNAseq من كفاءات الكشف منخفضة نسبيا وخطوات المعالجة تؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية5. على الرغم من أن RNAseq خلية واحدة يمكن أن توفر رؤى في التغايرية phenotypic بين مجموعة من الخلايا متساوية المنشأ، RNA مضان في التهجين الموقعي (RNA-FISH) يمكن أن تسهل استكشاف أكثر اكتمالا للتعبير الجيني الهدف على المستوى المكاني، وعلى أساس أليل من قبل أليل6،7.

RNA FISH هي تقنية تسمح باكتشاف وتوطين جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة في الخلايا الثابتة. وخلافا لأساليب سابقة شاقة، الحالية للدولة من بين الفن الجيش الملكي النيبالي-FISH يستخدم مسابير الحمض النووي المتاحة تجاريا التي هي مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي الهدف، وهذه المسابير تهجين لأهدافها من قبل قاعدة واتسون كريك الاقتران8. وشملت تقنيات التهجين في وقت مبكر في الموقع بروتوكول مماثل أنشأته غال وPardue في عام 1969، كما تم تجهيز عينة مع مسابير الحمض النووي التي هجينت على وجه التحديد إلى هدف الجيش الملكي النيبالي9. في الأصل تم إجراء الفحص باستخدام الكشف الإشعاعي أو colorimetric; ومع ذلك ، في 1980s ، وتطوير الفلورسينس في الموقع بروتوكولات التهجين (FISH) لسمك الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت لاحق الأسماك فتحت الطريق نحو الكشف أكثر حساسية ، واحتمال تعدد10،11.

وقد أدت التطورات الأخرى في RNA FISH إلى القدرة على الكشف عن وقياس جزيئات الحمض النووي الريبي واحد (smFISH)12،13. الكشف المباشر هو الطريقة التي يتم تسمية المسابير نفسها مع الفلوروفوريس. ويتمثل أحد التحديات التي تواجهها هذه الأسماك في أن هناك حاجة إلى ما يكفي من المسابير/الأهداف المهجنة لتيسير الكشف عن الإشارات الفلورية باعتبارها بقعا متميزة محدودة الحيود. لمعالجة هذه المسألة، يمكن للمرء استخدام مجموعة من التحقيق قصيرة وحيدة تقطعت بهم السبل Oligonucleotides الحمض النووي التكميلية لمختلف المناطق من RNA الهدف8،12،14. الربط بين مسابير متعددة يزيد من كثافة الفلوروفور المحلية، مما يجعل الحمض النووي الريبي مرئية كقعة متميزة، وكثافة عالية عن طريق المجهر الفلوري. هذه الطريقة مفيدة لأن الربط خارج الهدف من oligonucleotides في مجموعة التحقيق تجمع يمكن تمييزها عن إشارة بقعة الحمض النووي الريبي الحقيقي عن طريق تحليل كمي حجم بقعة وكثافة للتمييز بين إشارة حقيقية وملزمة oligonucleotide زائفة، وبالتالي تسهيل تحليل أكثر دقة عن طريق الحد من الإيجابيات كاذبة12.

طرق بديلة للكشف عن مرنا هي الكلاسيكية BAC استنساخ القائم على طريقة الترجمة ونظام الحمض النووي المتفرعة التي تم تطويرها مؤخرا. في BAC المستنسخة، طريقة الترجمة، والحمض النووي أن يكون المسمى هو انزيميا ويتم إضافة نيوكليوتيد جديدة إلى نهاية 3 'المكشوفة. نشاط بوليمرات الحمض النووي أضيف النيوكليوتيدات المسمى مما أدى إلى التحقيق المطلوب15،16. تقنية الحمض النووي المتفرعة ينطوي على مسابير أوليغونوكليوتيد التي تهجين في أزواج لأهداف الجيش الملكي النيبالي ويتم تضخيم هذه المسابير باستخدام جزيئات تضخيم إشارة متعددة. هذه الطريقة يمكن أن تحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن التضخيم يمكن أن ينحرف كمية دقيقة منذ البقع الفلورية يمكن أن تكون مختلفة بعنف في الحجم والكثافة17.

كنظام نموذجي لهذا البروتوكول، الذي يعمل بكامل العاملين كجزء من مشاركة برنامج أبحاث NIEHS Superfund لتحديد آثار المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء في خليج غالفستون / قناة هيوستن للسفن، استخدمنا مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) خط خلايا سرطان الثدي الإيجابي MCF-7 المعالجة بين عشية وضحاها مع ناهض ER، 17β-استراديول (E2)7،18،19. E2 ينظم العديد من الجينات المستهدفة ER، بما في ذلك الجين الأولي ER الهدف، GREB17،20،21،22. يستخدم بروتوكول smFISH الموصوف هنا مجموعة من مجموعتين مسابير مفصولتين طيفيا تستهدفان GREB1؛ واحد أن تهجين إلى exons والآخر إلى introns، مما يسمح لقياس كل من الجيش الملكي النيبالي ناضجة والناضجة7. ثم نستخدم المجهر epifluorescence مقرونة deconvolution لصورة smFISH المسمى عينات، ومن ثم تطبيق إجراءات تحليل الصور لتحديد عدد الأليل النشطة ورنا ناضجة لكل خلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لضمان أفضل النتائج، يتطلب جزء المعمل الرطب من هذا البروتوكول احتياطات قياسية خالية من RNase في جميع الخطوات. على سبيل المثال، يتم تشجيع استخدام نصائح ماصة المصفاة والأوعية العقيمة والمخازن المؤقتة الخالية من RNase. كما يقترح استخدام مثبطات RNase مثل مجمعات فاناديل ريبونوكليوسيد، وخاصة بالنسبة لرناس منخفضة الوفرة المستهدفة.

1. ثقافة الخلية والإعداد التجريبي

  1. الحفاظ على الخلايا السرطانية الثدي MCF-7 (ATCC #HTB-22) في قارورة زراعة الأنسجة T75 مع فينول الأحمر مجانا (مطلوب فقط لتجارب التحفيز الهرموني) دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، 1 nM بيروفات الصوديوم، 50 I.U./mL البنسلين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
  2. ضع أغطية مستديرة مطلية بالأحماض ومتعددة الدهون والليوزين (سمكها من 0.16 إلى 0.19 مم وقطرها 12 مم) في لوحة زراعة أنسجة متعددة 24 مل.
    ملاحظة: استخدام 1 M HCl لحمض حفر الأغطية ومعطف مع محلول 1 ملغ / مل من بولي-د-ليسين إعادة تشكيلها في برنامج تلفزيوني معقم (ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا دون Ca++ ومغ++) وفقا للبروتوكولات القياسية.
  3. إزالة وسائل الإعلام النمو من الخلايا ويغسل مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم (الفوسفات العازلة المالحة دون Ca++ و Mg++). فصل خلايا MCF-7 باستخدام 2-3 مل من حل تريبسين-EDTA 0.25٪. بمجرد فصل الخلايا، قم بتحييد حل Trypsin-EDTA 0.25٪ مع حجم متساو من وسائط النمو.
  4. نقل الخلايا في تعليق وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 15 مل, تدور أسفل في 391 × ز لمدة 1 دقيقة بيليه خارج الخلايا. إزالة وسائل الإعلام بعناية من أنبوب مخروطي دون إزعاج بيليه الخلية وإعادة إنفاق الخلايا في كمية مناسبة من وسائل الإعلام العلاج.
    ملاحظة: وسائل الإعلام العلاج هو phenol الأحمر خالية DMEM تستكمل مع 5٪ الفحم dextran جردت وDFBS dialyzed، 2 MM L-الجلوتامين، 1 nM بيروفات الصوديوم، 50 I.U./mL البنسلين و 50 ميكروغرام / مل streptomycin. هذه الوسائط ضرورية لتجارب تحفيز هرمون الستيرويد كما هو استنفدت إلى حد كبير مكون المصل من المنشطات عن طريق الفحم تجريد وسائل الإعلام, وخفضت عوامل النمو عن طريق غسيل الكلى.
  5. بذور الخلايا على coverlips في لوحة متعددة الآبار 24 في 60،000 إلى 70،000 خلية لكل بئر في 500 ميكروغرام من وسائل الإعلام العلاج. لهذه التجربة، ينبغي أن يكون التقاء الخلايا حوالي 70-80٪ عند بدء العلاج. تحسين كثافة بذر الخلايا اعتمادا على نوع الخلية ومعدل النمو وطول التجربة لتجنب الالتقاء ، مما يعقد تحليل الصورة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل تصوير وتحليل للصور، تجنب تكتل الخلايا. لهذا الغرض، مزيج aliquot من الخلايا بدقة عن طريق pipetting (أو دوامة لفترة وجيزة) الخلايا عدة مرات قبل الاستغناء في الآبار. قبل وضع الخلايا المطلية مرة أخرى في الحاضنة، والسماح للخلايا يستقر في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة لمدة 20 دقيقة يساعد على الحد من تكتل الخلايا.
  6. احتضان الخلايا لمدة يومين على الأقل قبل العلاجات لضمان تزامن دورة الخلية والحد من الخلفية بسبب أي جزيئات الإشارات التي تبقى في مصل تجريد / dialyzed من وسائل الإعلام النمو.
  7. بعد حضانة لمدة 48 ساعة في وسائل الإعلام العلاج، وعلاج خلايا MCF-7 مع 10 nM 17β استراديول (E2) والتحكم في السيارة (DMSO)، المخفف في وسائل الإعلام العلاج لمدة 24 ساعة. يستخدم هذا العلاج جرعة مشبعة من E2 للحث على استجابة قصوى. إجراء دورات زمنية وتجارب الاستجابة للجرعة لتحديد تجريبيا للظروف لمختلف الجينات المستهدفة ونماذج الخلايا ونوع العلاجات. كمثال، انظر منشورنا الأخير7.

2. إعداد المخازن المؤقتة

  1. لإعداد العازلة التثبيت، تمييع تنقية، الفورمالديهايد أحادية (تباع من قبل الموردين المجهر الإلكتروني كما 16٪ بارافورمالديهايد) إلى 4٪ في برنامج تلفزيوني عقيم Ca++/ ملغ++ (الفوسفات المخزنة المالحة بالإضافة إلى Ca++ ومغ++). إضافة مجمعات فاناديل ريبونوكليوسيد (VRC) إلى حاجز التثبيت لتركيز نهائي قدره 2 mM لتأخير تدهور الحمض النووي الريبي.
    1. حساب المبلغ الإجمالي للتثبيت العازلة على أساس تتطلب 300-500 ميكرولتر من التثبيت لكل بئر من لوحة متعددة 24. تخزين 4٪ الفورمالديهايد على الجليد حتى المطلوبة في خطوة التثبيت.
      ملاحظة: جعل المخزن المؤقت التثبيت جديدة لكل تجربة.
      تنبيه: الفورمالديهايد هو المسخ الذي يمتص من خلال الجلد. استخدام هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفقا للوائح المؤسسية الخاصة بك.
  2. لخطوة permeabilization، وإعداد الإيثانول 70٪ في المياه الخالية من النيوكليز. خيار بديل هو 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني عقيم Ca++/ ملغ++ بالإضافة إلى 2 mM من VRC. حساب المبلغ الإجمالي للحاجز permeabilization اللازمة باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر.
  3. لإعداد 9 مل من العازلة التهجين، إضافة 2 مل من المخزون 50٪ كبريتات ديكتران، و 1 مل من 20x SSC (سترات الصوديوم المالحة) العازلة إلى 6 مل من المياه الخالية من النيوكليز. دوامة لخلط تماما المخزن المؤقت التهجين. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  4. هناك خمس خطوات غسيل منفصلة تتطلب 2x الصوديوم المالحة سيترات (SSC) العازلة. حساب الحجم النهائي لل2x SSC العازلة اللازمة من خلال توقع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل غطاء لكل خطوة غسل. تمييع الكمية المطلوبة من المخزون 20x SSC العازلة في المياه الخالية من النيوكليز. يمكن إضافة 2 mM VRC لغسل الخطوات كإجراء وقائي إضافي. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة طوال مدة خطوات المعالجة.

3. تثبيت لسمك الحمض النووي الريبي

  1. بعد العلاج، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار ويغسل مرة واحدة مع عقيمة، باردة PBS Ca++/ مغ++. إذا تم استخدام نموذج خلية الالتزام منخفضة، لا تستخدم فراغ لتنشق السائل. استخدام pipetting اليدوي لإزالة وسائل الإعلام بعناية من جانب البئر وحذف خطوة غسل الأولية. أضف 500 ميكرولتر تثبيت العازلة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: إذا كانت العينة عرضة لتدهور الحمض النووي الريبي، استخدم برنامج تلفزيوني معقم مع 2 mM VRC لخطوة الغسيل في هذه المرحلة.
  2. إزالة المثبت والتخلص منه في النفايات الكيميائية وفقا للوائح المؤسسية. غسل الخلايا مرتين مع البرد العقيمة PBS Ca++/ مغ++ لمدة 3 دقائق.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ إلى كل بئر. ختم لوحة بئر 24 مع فيلم من البلاستيك البارافين. ضعه على دوار عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن أربع ساعات. فمن الأفضل أن تترك العينات في الإيثانول 70٪ بين عشية وضحاها. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة ويمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع في الإيثانول بنسبة 70٪.
    ملاحظة: يمكن استخدام 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني مع 2 MM VRC الحل كبديل. احتضان العينات في 500 ميكرولتر من هذا العازلة permeabilization لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الدوار. إذا كان استخدام هذا المخزن المؤقت permeabilization لا يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة ثم يجب متابعة خلال خطوة التهجين.

4. التهجين لسمك الجيش الملكي النيبالي

  1. إزالة المخزن المؤقت permeabilization وغسل مرة واحدة في 500 ميكرولتر من العازلة 2X SSC بالإضافة إلى 10٪ formamide لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الدوار.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتهجين الكامل. حساب ما يقرب من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت التهجين الكامل لكل غطاء. إضافة formamide إلى المخزن المؤقت التهجين للوصول إلى النسبة المئوية المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل للتهجين، فإنها ستتألف من 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين الذي تم صنعه سابقا بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من الفورماميد الجزيئي للوصول إلى 10٪ فول/فول. دوامة لفترة وجيزة لخلط.
    تنبيه: الفورماميد هو المسخ الذي يمتص من خلال الجلد. استخدام هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفقا للوائح المؤسسية.
  3. تمييع intron GREB1 (المسمى مع Atto 647N) و GREB1 exon (المسمى مع Quasar 570) تحقيقات 1:300 في المخزن المؤقت التهجين. مزيج عن طريق pipetting. حماية هذا المخزن المؤقت من الضوء واستخدامها على الفور.
    ملاحظة: تم تصميم وتصنيع المسابير كما هو مفصل في ستوسي وآخرون7. وعادة ما يتم توفير المسابير كما بركة التحقيق oligonucleotide المجففة التي يجب إعادة تشكيلها في العازلة TE خالية من RNAse وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة14. ولذلك، كان حل المخزون لهذه المسابير 12.5 ميكرومتر؛ تركيز العمل للمسابير هو 42 nM.
  4. إعداد غرفة الترطيب لخطوة التهجين بين عشية وضحاها. وضع قطعة من فيلم من البلاستيك البارافين، الجانب غير المكشوفة حتى، في طبق بيتري الزجاج تنظيفها مع إزالة التلوث السطحي لإزالة RNases. تشبع اثنين من المناشف الورقية مع الماء العقيم ووضعها على طول حواف طبق بيتري لتوفير الرطوبة، والتجفيف يمكن أن تدمر وضع العلامات محددة.
  5. Aliquot المسابير عن طريق التنقيط 30 ميكروغرام من المسابير في العازلة التهجين على الجانب النظيف من الفيلم البلاستيك البارافين. توزيع aliquots من المسابير بحيث coverslips لا تتلامس مع بعضها البعض.
  6. باستخدام ملقط معقم، الوجه بلطف الجانب خلية coverslips وصولا الى المسابير في طبق بيتري الزجاج. تجنب فقاعات الهواء ولا تضغط على الأغطية.
    ملاحظة: لا تتخلص من لوحة زراعة الأنسجة مع المخزن المؤقت SSC 2x، حيث ستكون هناك حاجة إليه للخطوات اللاحقة.
  7. ختم طبق بيتري الزجاج مع فيلم من البلاستيك البارافين وتغطية لوحة مع احباط لمنع التعرض للضوء إلى الفلوروفوريس. حضانة بين عشية وضحاها، تصل إلى 16 ساعة، في 37 درجة مئوية على سطح مسطح غير الدورية. يمكن أن يختلف وقت الحضانة تجريبيا ، ولكن يوصى ب 4 ساعات على الأقل.
    ملاحظة: تكون الأغطية عرضة للانزلاق عند احتضانها في المخزن المؤقت للتهجين ، مما قد يؤدي إلى بقع جافة على الغطاء وتلف العينة.

5. إعداد عينات للتصوير

  1. في اليوم التالي، قم بإزالة الأغطية من غرفة الترطيب باستخدام ملقط وإعادتها إلى لوحة البئر ال 24 مع جانب الخلية لأعلى. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة SSC 2x الطازجة بالإضافة إلى 10٪ formamide لغسل المسبار الزائد والتهجين غير محددة.
    ملاحظة: حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  2. غسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر من العازلة 2X SSC بالإضافة إلى 10٪ formamide لمدة 15 دقيقة لكل منهما في 37 درجة مئوية على الدوار ساخنة.
  3. مضادةالحمض النووي مع DAPI في 1 ميكروغرام / مل في 2x SSC العازلة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الدوار.
  4. اغسل مرة واحدة مع 2x SSC العازلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتركيب الأغطية على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائط التركيب غير المتصلبة بعد إزالة أي حاجز SSC 2x زائد بمنشفة ورقية وغسل سريع في ماء خالي من النيوكليز للقضاء على الأملاح الزائدة. وأخيرا، ختم الأغطية مع طلاء الأظافر واضحة.

6. عالية الدقة المجهرية ومعالجة الصور

  1. صورة العينات على المجهر epifluorescence واسعة المجال باستخدام هدف النفط 60x أو 100x وكاميرا sCMOS. انظر جدول المواد للمجهر المحدد والهدف المستخدم لهذه التجربة.
    1. التصوير الكامل بمجرد معالجة العينات بالكامل لتجنب تدهور الإشارة المعتمد على الوقت.
      ملاحظة: يتم استخدام زيت الغمر مع مؤشر الانكسار (RI) من 1.516 في هذه التجربة. يجب إجراء الاختبار التجريبي لمطابقة RI الزيت إلى عينات معينة، كما سوف يؤدي عدم تطابق RI في انحرافات وظيفة انتشار نقطة التي ستؤثر على deconvolution الصورة.
  2. يتم التقاط الصور بحجم بكسل الجانبية من 0.10827 ميكرومتر.
  3. تحسين مقدار الإضاءة من مصدر الضوء (أي الإرسال في المائة) وأوقات التعرض لكل قناة (مرشحات DAPI و TRITC و CY5 في هذا المثال بالذات) باستخدام العينة التي من المتوقع أن يكون لها أعلى كثافة (أي الضوابط الإيجابية). في هذه التجربة، من المتوقع أن يكون للعينة المعالجة E2 كثافة أعلى لكل من مجموعات مسبار GREB1. عموما، فإن الإرسال في المئة للمسابير GREB1 intron و exon هو 50 - 100٪، وأوقات التعرض تتراوح بين 0.25 - 0.60 ثانية.
  4. بالإضافة إلى ذلك، الحصول على الصور في ظل الظروف التي تجنب photobleaching و / أو أي تشبع بكسل الكاميرا. في تجربتنا، يجب أن يكون هناك فرق ~ عشرة أضعاف الحد الأدنى بين الخلفية وكثافة الإشارة. يمكن أن يحدث تشبع عدد قليل من وحدات البكسل / الحقل بسبب إشارات غير محددة في العينة (أي الأوساخ على الغطاء ، وتجميعات المسبار خارج الخلية) ، والتي يمكن أن تكون مقبولة ، ولكن فقط إذا لم يتم تضمين المناطق المشبعة في الكمية.
  5. لتعيين اقتناء مكدس z، ركز على العينة في قناة DAPI. حدد الجزء العلوي والسفلي من المكدس z عند المسافات حيث تصبح نواة DAPI الملطخة خارج التركيز. حجم خطوة z-stack الذي استخدمناه هو 0.25 ميكرومتر لكل شريحة وينبغي أن يمتد إجمالي z-stack على الخلية بأكملها (حوالي 10 ميكرومتر في خلايا MCF-7). ومع ذلك، فإن حجم الخطوة z-كومة تغيير وفقا للهدف المستخدم، وينبغي اتباع معيار أخذ العينات Nyquist.
    ملاحظة: Introns عادة ما تكون موجودة فقط في النواة; ومع ذلك ، exons على حد سواء في النواة والسيتوبلازم. لذلك، تعيين المكدس z كما هو موضح أعلاه سوف التقاط معظم التسمية إينترون exon كما يشمل المكدس z الخلية بأكملها.
  6. عادة، صورة ما لا يقل عن 200 خلية للتحليل الكمي في التجارب الأولية لالتقاط لقطة لحجم الاستجابة والاختلاف بين الخلايا.
  7. يتم استبعاد بعض الخلايا المصورة من التحليل النهائي (أي معدل التسرب) لأنه سيتم تصفيتها بواسطة خط أنابيب التحليل (أي الخلايا التي تلمس حدود الصورة ، الخلايا المبرمجة / الميتوتيكية).
    ملاحظة: عند تحديد مناطق الصورة، هناك بعض العوامل التي يجب وضعها في الاعتبار. اختر المناطق ذات الخلايا المنتشرة بالتساوي وغير المتداخلة على النحو المحدد من قبل DAPI المسمى، مضان النووية. بالإضافة إلى ذلك، حاول تحديد المناطق التي تحتوي على أقل عدد من النوى على طول حواف منطقة الصورة لتجنب عد الخلايا الجزئية. يفضل التصوير الآلي غير المتحيز دائما للتجارب التي تتطلب تحليلا إحصائيا.
  8. بعد الحصول على الصور التفكيكية باستخدام خوارزمية التصالحية العدوانية باستخدام 10 دورات (أي عدد التكرارات). إنشاء إسقاطات ذات كثافة قصوى لتحليل الصور (احذف هذه الخطوة إذا كان هناك حاجة إلى تحليل ثلاثي الأبعاد محدد). حفظ جميع الصور الإسقاط وفقا لعمق بت من الكاميرا المستخدمة؛ في حالتنا تم حفظ الصور الرمادي TIFF 16 بت. تحتوي صور RGB على عمق بت منخفض مما يؤدي إلى فقدان المعلومات؛ لذلك، صور RGB غير مناسبة لتحليل الصور.

7. تحليل الصور

  1. قراءة التعليمات وتحميل دفتر jupyter من github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. تثبيت بيثون أناكوندا التوزيع (https://www.anaconda.com/distribution/) الإصدار 3.6 أو أعلى.
  3. فتح أناكوندا موجه واكتب في الأمر التثبيت لتثبيت ITK بسيطة أناكوندا (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. فتح الملاح أناكوندا وإطلاق دفتر jupyter. وسوف تفتح متصفح ويب تظهر الدلائل والملفات. تصفح من خلال هياكل الدليل للوصول إلى الدليل الذي يحتوي على دفتر jupyter تحميلها من github.
  5. افتح دفتر الملاحظات وافتح كل خلية بالضغط على Shift و Enter في نفس الوقت.
  6. اتبع تفاصيل كل وظيفة وخطوة مقدمة في دفتر الملاحظات. لمجموعة مختلفة من الصور، قد يتعين على المرء تغيير بعض قيم المعلمات.
    ملاحظة: باختصار، يتم تقسيم النوى من قناة DAPI باستخدام العتبات المحلية بحجم كتلة 251 بكسل، تم تعبئة الثقوب وإزالة الكائنات التي تقل عن 100 بكسل. تم تقسيم لمس النوى باستخدام خوارزمية مستجمعات المياه. ثم تم توسيع القناع النووي بمقدار 100 بكسل وتم استخدام مستجمعات المياه لفصل الأجسام المؤثرة باستخدام النوى كأحواض. لتحديد حالة ثابتة الجيش الملكي النيبالي (exons)، تم استخدام عتبة أوتسو؛ للنسخ الأليل النشط (intron) ، أولا طمس الغاوسية (سيغما = 1) تم تطبيقها ثم تم استخدام عتبة الانتروبيا القصوى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحليل الاستجابات الهرمونية عبر smFISH ، على سبيل المثال ، اخترنا نموذج مستقبلات الإستروجين (ER) المستخدم في فحوصات الإنتاجية العالية لتحديد وجود مواد كيميائية معطلة للغدد الصماء في الكوارث البيئية في سياق المشاركة في برنامج أبحاث NIEHS Superfund7. في هذه التجربة، عولجت خلايا سرطان الثدي MCF-7 الملتصقة بناهض الرضة 17β-استراديول (E2، 10 nM) أو السيارة (DMSO) لمدة 24 ساعة. مجموعات التحقيق المنفصلة أطيافا ضد GREB1 intronic (Atto 647N، الأحمر في الشكل 1)و exonic (Quasar 5...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستند منهجية smFISH الموصوفة إلى البروتوكولات المنشورة سابقا7و12و14. في هذا البروتوكول، نشرح الخطوات الحرجة التي تم تحسينها من المختبر الرطب (بما في ذلك كثافة البذر، ووقت التثبيت، والبيرمابيلية، وتركيز المسبار)، إلى التصوير وتحليل الصور، وتوفير خط أنابيب تجريبي كامل للمختبرات المهتمة بإجراء تحليل خلية واحدة للنسخ الجيني.

لتسهيل تحليل الخلية الواحدة، من المهم أن تكون الخلايا تحت السائل ولا تتداخل بحيث ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل MAM و FS و MGM من قبل NIEHS (المشروع 4 ، P42ES027704 ، PI ، Rusyn). يتم دعم MAM و FS و RMM و MGM و PKS من قبل مركز دول مجلس التعاون الخليجي الممول من CPRIT للتنظير المتقدم والمعلوماتية بالصور (RP170719). كما يدعم التصوير من قبل الأساسية المجهر المتكاملة في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد القومية للصحة (DK56338، وCA125123)، CPRIT (RP150578)، ومركز دان ل. دنكان الشامل للسرطان، واتحاد جون س. دان ساحل الخليج لعلم الجينوم الكيميائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
17 وبيتا ؛ استراديولسيجما-ألدريتشE2257رقم CAS 50-28-2
Ambion SSC (20X) عازلة ، خال من RnaseThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM مع L-Glutamine و 4.5 جم / لتر جلوكوزفيشر ScientificMT10017CVالمصنعة بواسطة Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417بدون كبريتات بيروفات الصوديوم
ديكستران ، محلول معقم بنسبة 50٪سيجما ألدريتش3730-100 مل
فولبيكو فوسفات مخزن ملحي Ca ++ / MG ++Corning21030CVصنع بواسطة Calbiochem
Ethanol ، 200 دليل (100٪)فيشر Scientific07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat bottom معالج TC لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبارCorning353047المصنعة من قبل Decon Laboratories
Fetal مصل الأبقار (FBS) ، 500 ملفيشر ساينتفيك50-753-2978المصنعة بواسطة Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE مجهر إزالة الالتفاف عالي الدقةGE Healthcare Hyclone
Water ، بيولوجيا جزيئية درجةفيشر SH3053802
الغمر 1.516GE Healthcare LifeSciences 29162940المصنعة بواسطة GE محلول
L-glutamineFisher ScientificMT25005Clتم تصنيعها بواسطة خلايا Corning
MCF-7ATCCHTB-22
Molecular Grade FormamidePromegaPAH5051
Olympus 60x / 1.42 NA ObjectiveOlympus
ParafilmBemis Company، Inc.52858-076تم توزيعه بواسطة VWR
Paraformaldehyde ، محلول 16٪ ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15710
حل Penicilin-StreptomycinFisher ScientificMT3001Clالمصنعة بواسطة Corning
Ribonucleoside Vanadyl ComplexVWR101229-716المصنعة من قبل New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
بيروفات الصوديوم ، 100 ملمفيشر سيانتيفيك11-360-070المصنعة من قبل جيبكو
ثيرمو ساينتيفيك أغطية زجاجية ، # 1.5فيشر سيانتيفيك12-545-81P
تريتون X-100 ، 100 ملفيشر ساينتفيكBP151-100المصنعة بواسطة فيشر بيوالكواشف الحيوية
محلول تريبسين-EDTA 0.25٪سيجما-ألدريتشT4049-500ML
Vectashield تركيب مضاد للبهتان متوسط 10 ملNC9265087فيشر Scientificالمصنعة من قبل Vector Laboratories
فول للرعاية الصحية BioScience من الدرجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA FISH GREB1 DAPI

مقالات ذات صلة