مقالة منهجية

عزل الأنسجة عالية النقاء عن زراعة بذور الشعير

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

أكتوبر 26, 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا للعزل اليدوي عالي النقاء ومراقبة جودة أنسجة الأم للأجنة والسويداء والبذور أثناء نمو بذور الشعير بالكامل.

الملخص

يعد فهم الآليات التي تنظم تطور بذور الحبوب أمرا ضروريا لتربية النباتات وزيادة الغلة. ومع ذلك ، فإن تحليل بذور الحبوب يمثل تحديا نظرا للحجم الدقيق ، والطابع السائل لبعض الأنسجة ، والوصلات الضيقة بين الأنسجة. هنا ، نوضح بروتوكولا مفصلا لتشريح أنسجة الجنين والسويداء وبذور الأم في المراحل المبكرة والمتوسطة والمتأخرة من نمو بذور الشعير. يعتمد البروتوكول على تشريح الأنسجة يدويا باستخدام أدوات مدببة دقيقة ومجهر مجهر ، متبوعا بالتحكم في النقاء القائم على تحليل ploidy. أنسجة وأجنة بذور الأم ثنائية الصبغيات ، في حين أن السويداء عبارة عن نسيج ثلاثي الصبغيات. هذا يسمح بمراقبة نقاء العينة باستخدام قياس التدفق الخلوي. كشفت القياسات الإضافية عن الجودة العالية للحمض النووي الريبي المعزول من هذه العينات وقابليتها للاستخدام في تحليل عالي الحساسية. في الختام ، يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح الأنسجة النقية عمليا من حبوب الشعير المزروعة وربما الحبوب الأخرى أيضا.

المقدمة

البذور عبارة عن هياكل معقدة تتكون من عدة أنسجة من أصل الأم والأبناء1. تمثل حبوب الحبوب نوعا خاصا من البذور ، يتكون الجزء الأكبر منها من السويداء ، وهو نسيج ثلاثي الصبغيات متخصص يحمي ويغذي الجنين. توفر الحبوب حوالي 60٪ من الموارد الغذائية العالمية وهي أثمن الناتج من الإنتاج النباتي2. تعد معرفة العمليات الجزيئية التي تتحكم في نمو بذور الحبوب مهمة نظرا لأهميتها الاقتصادية ودورها المركزي في تكاثرالنبات 1،3.

الشعير المزروع (Hordeum vulgare subsp. vulgare ؛ 2n = 2x = 14 ؛ 1C = 5.1 Gbp) هو رابع أهم محصول للحبوب في جميع أنحاء العالم. يتم استخدامه لتغذية والأغذية والتكنولوجياالحيوية 4. إلى جانب ذلك ، فهي أيضا نوع كلاسيكي من محاصيل الحبوب في المنطقة المعتدلة ذات أهميةمتزايدة 5. تشمل الموارد الجينومية للشعير الخرائط الجينية ، ومجموعات الأصناف ، والسلالات المحلية والطفرات ، وتجميعات الجينوم عالية الجودة والتعليقات التوضيحية بالإضافة إلى البيانات النسخية لمراحل النمو الرئيسية5،6،7. أيضا ، تستخدم جينات الشعير للتحسينات الجينية للحبوب الأخرى. مقاومة الضغوط اللاأحيائية مثل الجفاف والملوحة ، ومسببات الأمراض المحددة ، والمحتوى العالي من المركبات المفيدة (على سبيل المثال ، β-جلوكان) تجعل الشعير مصدرا قيما للسمات لتربية القمح8.

يبدأ تطوير البذور عن طريق الإخصاب في يوم التلقيح (DOP). يتم تعريف DOP من خلال تقييم مورفولوجيا وصمة العار والأنثرات وفقا لمقياس Waddington (W10.0) 9. تميزت المسامير التي تحتوي على أزهار غير ملقحة بوصمة عار مضغوطة (غير متفرعة) وأنثرات خضراء ، في حين أن المسامير الملقحة تحتوي على شقيقات ممتدة ، وصمة عار ممتدة ومتفرعة على نطاق واسع ، وبويضة منتفخة ، وأنثرات مفتوحة وحبوب لقاح حرة. تمثل الأزهار في DOP نمطا ظاهريا وسيطا. كان للأنثرات لون أصفر ، وتعطلت بسهولة ثم أطلقت حبوب اللقاح. انتشرت وصمة العار على نطاق واسع في فروع المدقة (الشكل 1 ج).

يتضمن تطوير بذور الشعير ثلاث مراحل متداخلة جزئيا1،10. المرحلة الأولى (0 - 6 أيام بعد التلقيح ؛ DAP) عن طريق الإخصاب المزدوج ، الذي يتمثل في تكاثر الخلايا وغياب تخليق النشا ؛ المرحلة الثانية (7 - 20 DAP) تشتمل على التمايز واكتساب كبير للكتلة الحيوية مصحوبة بإنتاج جزيئات تخزين النشا والبروتين. المرحلة الثالثة (بعد 21 DAP) تتوافق مع نضوج البذور وتقليل الوزن عن طريق الجفاف وبداية السكون. بدلا من ذلك ، تسمى المراحل مبكرة ومتوسطة ومتأخرة ، على التوالي11.

حبوب الشعير مغطاة بالهياكل ، والتي تتكون من الليما والباليا والجلومس12. في معظم الأنماط الجينية للشعير ، تلف القشور البذور الجافة بإحكام. تتكون البذرة نفسها من أنسجة الأم الجنينية والسويداء والبذور (الشكل 1 أ). ينشأ الجنين ثنائي الصبغيات من إخصاب خلية البويضة بواسطة نواة خلية حيوانية منوية واحدة. في البذرة المطورة بالكامل ، يتكون الجنين من المحور الجنيني مع القولون المحيط بالجذور ، والغمة التي تحيط بالنسيج الإنشائي للنبتة والأوراق الأولية ، والصفن (الفلقة) 1،10،13،14. السويداء ثلاثي الصبغيات هو نتيجة إخصاب الخلية المركزية ثنائية الصبغيات بواسطة نواة خلية المنوية الثانية. يبدأ تكاثر السويداء بالمرحلة المخلوية (الخلايا الخبية) ، حيث يتم دفع النوى المنقسمة إلى المحيط بواسطة الفجوة المركزية. في نهاية المرحلة المخلوية ، تشكل الأنابيب الدقيقة شبكة شعاعية حول النوى وتشير إلى تكوين جدار الخلية المضادة للصحة وبداية خلية السويداء. يحدث تمايز السويداء في وقت واحد مع الخلوية وينتج عنه خمسة أنسجة رئيسية: السويداء النشوي ، وخلايا النقل ، وطبقات اليوروون وتحت اليورون ، والمنطقة المحيطة بالجنين. أنسجة الأم النباتية هي بنية ثنائية الصبغيات متعددة الطبقات من أصل أمومي تحتوي على قشرة ومعاطف البذور10،12. تشتمل أنسجة الأم البذرية على نتوء نوسيلاري على الجانب الظهري من الحبوب التي لها وظيفة مرتبطة بالنقل ، وتصبح جزءا لا يتجزأ من السويداء في مراحل لاحقة من نمو البذور15.

figure-introduction-1
الشكل 1: تطوير بذور الشعير. (أ) الرسم التخطيطي لحبوب الحبوب في المخطط السهمي مع أنسجة الأم المشار إليها بالبذور (SMTs ، خضراء) ، السويداء (END ، الأصفر) ، الجنين (EMB ، البرتقالي) والهياكل (H ، رمادي). (ب) مورفولوجيا ارتفاع الشعير بالقرب من التشريح. شريط المقياس = 1 سم (ج) مورفولوجيا وصمة العار والأنثرات في المراحل التي تسبق التلقيح وأثناءه وبعده. يظهر الجزء الداخلي تفاصيل وصمة العار بحبوب اللقاح (رؤوس الأسهم). شريط المقياس = 5 مم ، شريط داخلي = 200 ميكرومتر. (د) المقاطع السهمية والعرضية من 4 و 8 و 16 و 24 بذور DAP. (NP ، الإسقاط الجديد) شريط المقياس = 5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوفر التقدم الأخير في علم الجينوم عالي الإنتاجية الأدوات اللازمة لدراسة تطور أنسجة البذور الفردية. ومع ذلك ، فإن العقبة الرئيسية لهذا الغرض هي الهيكل المدمج والالتصاق المحكم لأنسجة البذور1. قمنا بتطوير بروتوكول لتشريح أنسجة البذور عالي النقاء من زراعة بذور الشعير مع إمكانية الاستخدام اللاحق للتحليلات عالية الحساسية ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول المقدم بسهولة مع الحبوب الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. زراعة النباتات

ملاحظة: بالنظر إلى أن نبات الشعير الفردي يحتوي عادة على 5 إلى 6 حراثة ويجب استخدام 5 إلى 6 سنيبلات متوسطة فقط من كل سنبلة للتشريح ، فإن الحد الأقصى للمحصول لكل نبات هو 72 بذرة لصفين و 216 بذرة للأصناف المكونة من ستة صفوف.

  1. لإنبات بذور الشعير ، قم بإعداد طبق بتري مبطن بثلاث طبقات من المناديل الورقية السليلوز المغطاة بطبقة واحدة من ورق الترشيح. رطبه بالماء المقطر ، حتى لا يكون هناك ماء زائد ، ضع البذور على السطح وأغلق طبق بتري. يتجنب ورق الترشيح نمو الجذور من خلال أنسجة السليلوز. تنبت البذور لمدة 3 أيام عند 25 درجة مئوية في الظلام.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإنبات البذور عن طريق وضعها مباشرة في خليط تربة رطب (انظر الخطوة 1.2).
  2. انقل البذور النابتة بجذع مرئي وأطلق النار على شكل حوالي 5 سم إلى أواني الخث مقاس 5 سم × 5 سم بمزيج من التربة والرمل (3: 1 ، حجم / حجم). اسق بانتظام. بعد 10 أيام ، انقل النباتات إلى أواني مقاس 12 سم × 12 سم مملوءة بنفس خليط التربة.
  3. قم بزراعة النباتات في غرفة مناخية تحت نظام النهار الطويل الخاضع للرقابة (16 ساعة في النهار 20 درجة مئوية ، 8 ساعات في الليل 16 درجة مئوية ؛ شدة الضوء 200 ميكرولتر م -2 ثانية -1 ؛ الرطوبة 60٪).
    ملاحظة: يتطلب الشعير الربيعي ما يقرب من 8-10 أسابيع من البذر إلى بداية التشريح ، مع عدم الحاجة إلى التبخير. يحتاج الشعير الشتوي إلى 7-8 أسابيع من التبخير (ظروف النهار القصير ، 8 ساعات في اليوم 4 درجات مئوية ، 16 ساعة في الليل 4 درجات مئوية ؛ شدة الضوء 200 ميكرولتر م -2 ثانية -1 ؛ الرطوبة 85٪) للحث على الإزهار.

2. تحديد التلقيح

ملاحظة: هناك حاجة إلى التحديد الدقيق للتلقيح من أجل التقدير الصحيح لتقدم النمو. الشعير من الأنواع ذاتية التلقيح. لتحديد يوم التلقيح (DOP) ، قمنا بمراقبة يوم التلقيح الذاتي. هذه السمة خاصة بالصنف ، لكن بدء نتوء المظلات من غمد الأوراق يعد مؤشرا جيدا على الاقتراب من DOP (الشكل 1 ب).

  1. افتح غمد الأوراق الذي يغطي السنبل. استخدم ملاقط مدببة دقيقة للتحقق من الأنثرات والمبيض داخل السنيبلات في الجزء المركزي من السنبلة. سوف يتم تلقيح السنيبلات ذات الأنثرات الصفراء والوصمة "الرقيقة" في غضون ساعاتقليلة 16 وتعتبر DOP (الشكل 1 ب).
  2. قم بقص السنبلة بالقرب من طرف السنيبلات الأخيرة ، وقم بإزالة ورقة العلم والجزء العلوي من المظلات. بعد ذلك ، قم بقص الجزء العلوي من 1/3 من الهياكل في كل spikelet. هذا يجفف الأنثرات ويؤدي إلى فتحها وإطلاقها بشكل أكثر تزامنا لحبوب اللقاح.
  3. قم بتغطية السنبلة بكيس زجاجي مع معرف السنبلة ورقم النبات وتاريخ DOP المحدد. هذا يمنع أيضا التلقيح المتبادل ، مما قد يضر بتجارب معينة.
  4. لاحظ المعلومات لمحرر جدولي. استخدم الصيغة التالية لحساب اليوم التالي للتلقيح (DAP) الذي يجب أن يتم فيه عزل الأنسجة.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP المتوقع
    ملاحظة: يجب أن تحتوي القيم على تنسيق "البيانات".
  5. لتشريح أنسجة البذور ، اجمع المسامير في DAP وفقا للتقويم الجدولي المعد.

3. تشريح أنسجة البذور

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية باستخدام مجهر مجسم. قم بإزالة الهياكل قبل التشريح باستخدام الملقط. لاحظ أن الهياكل تصبح أكثر جفافا وأكثر التصاق من حوالي 16 DAP. للحفاظ على الظروف الفسيولوجية وتجنب تجفيف المواد النباتية أثناء التشريح ، قم بترطيب العينات عن طريق وضعها في قطرة 1x PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي سيوم2HPO4 ، 1.8 ملي هيلو هيلو سمبير2PO4 ، الرقم الهيدروجيني = 7.4). استخدم بذرة جديدة لتشريح كل نسيج لتجنب تحلل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين بسبب وقت جمع العينة الممتد. لعزل الحمض النووي الريبي عن المواد التي تم تشريحها ، استخدم فقط المواد والمواد الكيميائية الخالية من RNase. لا تتجاوز إجمالي وقت التشريح 15 دقيقة لعينة واحدة تتكون عادة من الأنسجة التي تم تشريحها من 5-10 بذور لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي.

  1. قم بإزالة باقي الهياكل باستخدام ملاقط مدببة دقيقة قبل تشريح الأنسجة. يساعد الترطيب باستخدام 1× PBS لمدة 1 دقيقة على إزالة البقايا الجافة من السنيبلات.
  2. ضع البذور المقشرة على طبق بتري بقطرة 1× PBS وقم بتشريح الأجزاء الفردية باستخدام ملاقط مدببة وإبرة دقيقة وماصة شعرية دقيقة. يتم تطبيق استراتيجية مختلفة قليلا لتشريح الأنسجة الفردية: أنسجة الأم البذرة (الخطوة 3.3) ، والجنين (الخطوة 3.4) والسويداء (الخطوة 3.5).
  3. تشريح أنسجة الأم البذرية
    1. تشريح البذور حتى 8 DAP
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري وقطع البذرة برفق على طول محور طولي ، وقشر أنسجة الأم بالبذور باستثناء الطبقة الأخيرة المتاخمة للبذور من الجزء القمي إلى الجزء القاعدي باستخدام الملقط.
      2. اجمع أنسجة الأم البذرة من 5 إلى 10 بذور في أنبوب سعة 1.5 مل مع 50 ميكرولتر من 1× PBS ، وتخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة ، واشطف الأنسجة مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من PBS ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق سحب العينات وإغلاق الأنبوب وتجميده في النيتروجين السائل أو استخدمه مباشرة لقياس التدفق الخلوي. كمية المادة كافية لتطبيق واحد عادة في اتجاه مجرى النهر (على سبيل المثال ، عزل الحمض النووي الريبي أو قياس ploidy التدفق الخلوي).
    2. تشريح البذور بعد 8 DAP
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري ، وقطعها برفق في منتصف الجانب البطني من أنسجة الأم للبذور وقم بتقشير الأنسجة المحيطة بالبذور الكاملة تدريجيا بما في ذلك الإسقاط الجديد. لكل تطبيق نهائي ، اجمع واغسله من 5 إلى 10 بذور كما هو موضح في الخطوة 3.3.1.
  4. تشريح الجنين
    1. تشريح البذور عند 8 DAP وأصغر
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري واقطع 1/3 من البذرة القاعدية. قم بتقسيم الجزء المنفصل بعناية إلى نصفين وإطلاق الجنين. لكل تطبيق نهائي ، اجمع وغسل الأجنة من 10 إلى 20 بذرة كما هو موضح في 3.3.1.
    2. تشريح البذور بعد 8 DAP
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري وقم بإزالة أنسجة الأم من الجزء القاعدي من الجانب البطني. قم بإزعاج الطبقة الرقيقة من السويداء برفق حول محيط الجنين بواسطة إبرة رفيعة أو ملاقط دقيقة مدببة وقم بتقشير الجنين. لكل تطبيق نهائي ، اجمع وغسل الأجنة من ما يصل إلى 5 بذور كما هو موضح في 3.3.1.
  5. تشريح السويداء
    1. تشريح السويداء المخلوي من 4 بذور DAP.
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري ، وقم بإزالة أنسجة الأم بذرة باستثناء الطبقة الأخيرة من الخلايا المتاخمة للذناء. ثقب طبقة بلطف في منتصف الجانب البطني بإبرة رفيعة ، وامتص السويداء المخلوي عن طريق العمل الشعري باستخدام ماصة شعرية دقيقة.
      2. لكل تطبيق نهائي ، اجمع السويداء السائل من 10 إلى 15 بذرة في أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع مخزن مؤقت مناسب لتحليل المصب المخطط له (على سبيل المثال ، 1x PBS ، عازلة عزل الحمض النووي الريبي ، المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي). يجب أن يعكس حجم المخزن المؤقت بروتوكول التطبيق المخطط له للمتنكب. جمد في النيتروجين السائل.
    2. تشريح السويداء السماني من 5 إلى 8 بذور DAP
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري ، وقم بإزالة جميع أنسجة الأم والأجنة البذور. لكل تطبيق نهائي ، اجمع واغسله السويداء من 10 إلى 15 بذرة في أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع 1x PBS وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.
    3. تشريح السويداء السلولاري من البذور بعد 8 DAP
      1. ضع بذرة على الجانب الظهري ، وقم بإزالة جميع أنسجة الأم والجنين بذور. لكل تطبيق نهائي ، قم بجمع وغسل السويداء من بذرة واحدة لكل أنبوب كما هو موضح في الخطوة 3.3.1.
  6. قم بتخزين الأنابيب بمادة معزولة عند - 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

4. التحكم في نقاء الأنسجة باستخدام قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يمكن التحقق من نقاء العينة باستخدام قياس التدفق الخلوي قبل عزل الحمض النووي الريبي. تعد معايرة الجهاز المناسبة أمرا بالغ الأهمية لتحليل العينة البيولوجية. يجب ضبط بصريات مقياس التدفق الخلوي / محلل البلويد باستخدام حبات المعايرة (كريات البوليسترين المجهرية الملطخة بالفلورسنت موحدة للغاية فيما يتعلق بحجمها وشدتها الفلورية) حتى أقصى حدة ذروة ، وعادة ما تصل إلى معامل التباين (CV) < 2٪. تحتوي أنسجة بذور الحبوب بشكل أساسي على مجموعات من G1 و G2 والنوى المكررة. لذلك ، يوصى باستخدام مقياس لوغاريتمي. ابدأ بأنسجة الأوراق التي تحتوي في الغالب على نوى G1 وتعمل كعنصر تحكم في الصيغة الصبغية القاعدية.

  1. استخدم العينات المحضرة حديثا المحفوظة على الثلج (انظر الخطوة 3.3.1) أو الأنسجة المجمدة كما هو موضح17.
    ملاحظة: نظرا لأن عينة < 8 DAP بأكملها تستخدم لقياس التدفق الخلوي ، فإن هذا لا يمثل سوى تحكم غير مباشر. نوصي الباحثين بإجراء عزل وقياسات متعددة حتى الوصول إلى نسبة عالية من العينات النقية (>90٪) قبل الشروع في عزل الحمض النووي الريبي مع < 8 عينات DAP.
  2. حرر النوى من عينات الأجنة 4 و 8 DAP (للعينات الأخرى انظر الخطوة 4.4) عن طريق تجانس الأنسجة بمقدار 5 إلى 10 لفات من المدقة البلاستيكية في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 300 ميكرولتر من عازلة أوتو I (0.1 M أحادي هيدرات حامض الستريك ، 0.5٪ (حجم / حجم) Tween 20 ، تمت ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) 18.
  3. قم بتصفية المعلق الخام من خلال شبكة نايلون 50 ميكرومتر في أنبوب تحليل قياس التدفق الخلوي وأضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت Otto II (0.4 M Na2HPO4 · 12H2O) الذي يحتوي على 2 ميكروغرام مل -1 DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) 18 لتلطيخ الحمض النووي.
  4. ضع جميع الأنسجة الأخرى (بما في ذلك 16 DAP أو أجنة أقدم) على طبق بتري يحتوي على 500 ميكرولتر من عازلة Otto I وتجانسها عن طريق التقطيع بشفرة حلاقة. قم بتصفية التعليق كما في الخطوة 4.3 وصمة عار ب 1 مل من المخزن المؤقت Otto II الذي يحتوي على DAPI.
    ملاحظة: يتطلب التلاعب بشفرة حلاقة حادة مزدوجة الحواف اهتماما خاصا. لتقليل مخاطر الإصابة ، تتوفر شفرات حلاقة ذات حافة واحدة أو حوامل شفرات خاصة.
  5. تقدير محتوى الحمض النووي للعينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. مطلوب ما لا يقل عن 2000 جسيم لكل عينة لتحليل نقاء العينة.

5. عزل الحمض النووي الريبي وقياس الجودة

  1. استخدم الأنسجة المجمدة لمنع تحلل الحمض النووي الريبي عن طريق الريبونوكلياز الداخلي. من أنسجة الأم وعينات الأجنة من البذور ، عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا أو كاشف TRIzol19. نظرا لوجود نسبة عالية من النشا في أنسجة السويداء ، قم بعزل الحمض النووي الريبي الكلي من جميع العينات باستخدام بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية على العمود للأنسجة التي بها مشكلات (على سبيل المثال ، مجموعة الحمض النووي الريبي الكلي لمصنع الطيف الطيفي) باستخدام علاج DNase I على العمود20.
  2. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي وسلامته باستخدام بروتوكول مخصص للرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي الريبي أو Agilent 2100 Bioanalyzer.
    ملاحظة: يحتوي إجمالي الحمض النووي الريبي السليم على نطاقات / قمم واضحة 18S و 25S rRNA بحجم حوالي 1.9 و 3.7 كيلو بايت على التوالي. يجب أن يكون نطاق 25S rRNA أكثر كثافة بمرتين تقريبا من نطاق 18S rRNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإجراء تحليل نسخي خاص بالأنسجة لنمو بذور الشعير ، أنشأنا بروتوكولا لعزل الأنسجة عالية النقاء. يعتمد البروتوكول على التشريح اليدوي للجنين والسويداء وأنسجة الأم البذرية من الحبوب المقشرة (بعد إزالة الهيكل اليدوي) (الشكل 1 أ). تم استخدام البروتوكول بنجاح لعزل المواد من العديد من أصناف الشعير الربيعي المكونة من صفين وستة صفوف ، وتم حصاد المسامير في DAP معين واستخدمت مباشرة للاستخراج دون تثبيت (الشكل 1 د).

كان تعريف DOP معلمة حاسمة يجب تقد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، نقدم بروتوكولا يسمح بعزل عالي النقاء لأنسجة بذور الشعير. على الرغم من أنه تم تطويره واختباره بحثا عن الشعير ، إلا أنه يمكن اعتماده بسهولة لأعضاء آخرين من قبيلة Triticeae مثل القمح أو الشوفان أو الجاودار أو triticale27. لا يتطلب الجزء الأول من البروتوكول ، الذي يركز على تشريح أنسجة البذور ، أي معدات غير قياسية أو باهظة الثمن ، وبالتالي يجب أن يكون في متناول العديد من العلماء. مطلوب أداة عالية التخصص مثل مقياس التدفق الخلوي لتحليل شامل لمراقبة الجودة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور جان فرانا والدكتور محمود سعيد على صيانة مقاييس التدفق الخلوي ، وإيفا جهنوفا لإعداد المخازن المؤقتة ماري سيفيرتوفا لقائمة المواد وزدينكا بورسوفا للعناية بالنبات. تم دعم هذا العمل بشكل أساسي من منحة مؤسسة العلوم التشيكية 18-12197S. كما حظيت A.P. بدعم من زمالة J. E. Purkyně من الأكاديمية التشيكية للعلوم ومشروع ERDF "النباتات كأداة للتنمية العالمية المستدامة" (No. CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 16_019 / 0000827).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 ميكرومتر فلترميركSLGSV255F
1.5 مل أنبوب إيبندورفSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phenylindoleInvitrogenD21490
50 um شبكة نايلونالحرير A Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Bulb Assemblyشركة دروموند العلمية1-000-9000
حبات المعايرةInvitrogenA16502
مناديل ورقية
أحادي هيدرات حمض الستريكبنتا13830-31000
غرفة مناخيةمرشح Weiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter ورقةFagron
ملاقط مدببة دقيقةأدوات العلوم الدقيقة11254-20
مقياس التدفق الخلويSysmex-Partec
أنبوب قياس التدفقالخلوي Sarstedt55.484
كيس
زجاجي للفريزر
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
النيتروجين السائلليند
ماصة الشعيرات الدمويةالدقيقة Fivephoton الكيمياء الحيويةMGM 1C-20-30
دبابيس دقيقةأدوات العلوم الدقيقة26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
أواني الخثJiffy5x5 سم
حامل دبوس طبق
أدوات العلوم الدقيقة26016-12
مدقة بلاستيكيةp-LabA199001
الأواني12x12 سم
شفرة حلاقةجيليت
RNAse zapInvitrogenAM9780
مقص الرمل
أدوات العلوم الدقيقة14060-11
طيف
التربة نبات إجمالي الحمض النووي الريبيكيت سيجما ألدريتشSTRN50
مجهر مجسمأوليمبوس
توين 20سيجما ألدريتشكاشف P2287
TRIzolInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
سليلوزبتري

المراجع

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة