وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.
مقالة منهجية
وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.
تنتمي Histones إلى عائلة من البروتينات المحفوظة للغاية في eukaryotes. أنها حزمة الحمض النووي في نيوكلوزومات وحدات وظيفية من الكروماتين. إن التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) من الهستونات، التي تتسم بديناميكية عالية ويمكن إضافتها أو إزالتها بواسطة الإنزيمات، تلعب أدوارًا حاسمة في تنظيم التعبير الجيني. في النباتات، ترتبط العوامل اللاجينية، بما في ذلك PTMs هيستون، باستجاباتها التكيفية للبيئة. يمكن أن يؤدي فهم الآليات الجزيئية للتحكم في اللاجينية إلى توفير فرص غير مسبوقة لحلول الهندسة الحيوية المبتكرة. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل النوى وتنقية histones من أنسجة ورقة الذرة الرفيعة. يمكن تحليل الهستونات المستخرجة في أشكالها سليمة من خلال قياس الطيف الكتلي (MS) من أعلى إلى أسفل إلى جانب الكروماتوغرافيا السائلة (LC) على الإنترنت مع عكس المرحلة (RP). يمكن بسهولة تحديد تركيبات و قياس التشنج من PTMs متعددة على نفس بروتيوفورم الحجر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن قطع ذيل هيستون باستخدام سير العمل LC-MS من أعلى إلى أسفل، وبالتالي، مما يؤدي إلى التشكيل الجانبي PTM العالمي من الهستونات الأساسية (H4، H2A، H2B، H3). لقد طبقنا هذا البروتوكول في السابق على تعريف HISTONE PTMs من أنسجة أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها من دراسة ميدانية واسعة النطاق ، تهدف إلى تحديد العلامات اللاجينية لمقاومة الجفاف. ويمكن تكييف البروتوكول وتحسينه لتسلسل التسلسل المناعي للكروماتين (ChIP-eq)، أو لدراسة PTMs هيستون في النباتات المماثلة.
ومن المتوقع أن تؤثر شدة وتواتر الجفاف المتزايد على إنتاجية محاصيل الحبوب1،2. الذرة الرفيعة هي محصول من الحبوب الغذائية والطاقة معروف بقدرته الاستثنائية على تحمل الظروف التي تحد من المياه3،4. نحن نسعى لفهم ميكانيكي للتفاعل بين الإجهاد الجفاف، والتنمية النباتية، وعلم الوراثة من الذرة الرفيعة[الذرة الرفيعة ثنائية الألوان (L.) Moench). وقد أظهرت أعمالنا السابقة صلات قوية بين النبات وrizosphere الميكروبيوم في التغلب على الجفاف والاستجابات على المستوى الجزيئي5،6،7. وسيمهد هذا البحث الطريق لاستخدام الهندسة اللاجينية في تكييف المحاصيل مع سيناريوهات المناخ في المستقبل. كجزء من الجهود المبذولة لفهم علم الوراثة اللاجينية، نهدف إلى دراسة علامات البروتين التي تؤثر على التعبير الجيني داخل الكائن النباتي.
تنتمي Histones إلى عائلة عالية الحفظ من البروتينات في نوى النياريوتيات التي تحزم الحمض النووي في النويات كوحدات أساسية من الكروماتين. يتم تنظيم التعديلات اللاحقة لترجمات (PTMs) من الهستونات بشكل ديناميكي للتحكم في بنية الكروماتين والتأثير على التعبير الجيني. مثل غيرها من العوامل اللاجينية، بما في ذلك ال DNA methylation، PTMs هيستون تلعب أدوارا هامة في العديد من العمليات البيولوجية8،9. وقد استخدمت على نطاق واسع المقايسات المضادة المستندة إلى مثل البقع الغربية لتحديد وقياس PTMs histone. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون التفاعل بين PTMs histone والحمض النووي بحث فعال من قبل كروماتين المناعي – تسلسل (ChIP-eq)10. في ChIP-seq، يتم إثراء الكروماتين مع محددة المستهدفة هيستون PTM من قبل الأجسام المضادة ضد PTM محددة. ثم، يمكن أن تتحرر شظايا الحمض النووي من الكروماتين المخصب وتسلسل. يتم الكشف عن مناطق الجينات التي تتفاعل مع PTM هيستون المستهدفة. ومع ذلك، تعتمد جميع هذه التجارب بشكل كبير على الأجسام المضادة عالية الجودة. بالنسبة لبعض المتغيرات هيستون / homologs أو مجموعات من PTMs ، يمكن أن يكون تطوير الأجسام المضادة القوية صعبة للغاية (خاصة بالنسبة لـ PTMs متعددة). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير الأجسام المضادة فقط إذا كان من المعروف PTM هيستون المستهدفة. 11 ولذلك، من الضروري إيجاد طرق بديلة لأساليب غير مستهدفة، والتنميط العالمي لـ HISTONE PTMs.
قياس الطيف الكتلي (MS) هو طريقة تكميلية لتوصيف PTMs histone ، بما في ذلك PTMs غير معروف التي الأجسام المضادة غير متوفرة11،12. يستخدم سير عمل MS "من أسفل إلى أعلى" الراسخة البروتيازات لهضم البروتينات إلى ببتيدات صغيرة قبل فصل الكروماتوغرافيا السائلة (LC) والكشف عن التصلب المتعدد. لأن histones لديها أعداد كبيرة من المخلفات الأساسية (ليسين والأرجينين)، والهضم التربسين (البروتياز محددة لايسين والأرجينين) في سير العمل من أسفل إلى أعلى القياسية تخفيضات البروتينات في الببتيدات قصيرة جدا. الببتيدات القصيرة يصعب تحليلها من الناحية الفنية بواسطة LC-MS القياسية، ولا تحافظ على المعلومات حول الاتصال والقياس الرصين لـ PTMs متعددة. استخدام الإنزيمات الأخرى أو وضع العلامات الكيميائية لمنع lysines يولد الببتيدات الأطول التي هي أكثر ملاءمة لتوصيف PTMs هيستون13,14.
بدلا من ذلك، يمكن حذف خطوة الهضم تماما. في هذا النهج "من أعلى إلى أسفل"، يتم إدخال أيونات البروتين سليمة في التصلب العصبي المتعدد عن طريق التأين الكهربائي (ESI) بعد فصل LC على الانترنت، مما أسفر عن أيونات من بروتيوفورم هيستون سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل الأيونات (أي بروتيوفورمات) ذات الأهمية وتفتيتها في مطياف الكتلة لتسفر عن أيونات التسلسل لتحديد الهوية وتوطين PTM. ومن ثم، فإن MS من أعلى إلى أسفل لديه ميزة للحفاظ على المعلومات على مستوى البروتيفورم والتقاط الاتصال متعددة PTMs والقتابات الطرفية على نفس البروتيوفورم15،16. ويمكن أيضا أن توفر التجارب من أعلى إلى أسفل معلومات كمية وتقديم رؤى من المؤشرات الحيوية في مستوى البروتين سليمة17. هنا، ونحن وصف بروتوكول لاستخراج هيستون من ورقة الذرة البيضاء وتحليل histones سليمة من أعلى إلى أسفل LC-MS.
والبيانات التي تظهر في الشكل 1 والشكل 2 هي من أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها في الأسبوع الثاني بعد الزراعة. على الرغم من توقع اختلاف العائد، فإن هذا البروتوكول غير ملحد لظروف عينة محددة. وقد تم استخدام البروتوكول نفسه بنجاح لالأنسجة نبات الذرة الرفيعة التي تم جمعها من 2، 3، 5، 8، 9، و 10 أسابيع بعد زرع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. إعداد مادة أوراق الذرة الرفيعة
ملاحظة: تزرع نباتات الذرة الرفيعة في التربة في الحقل في بارلييه، كاليفورنيا.
2. إعداد المخازن المؤقتة والمواد (3-4 ساعة)
ملاحظة: يمكن إجراء حلول الأسهم تركيز عالية في وقت مسبق وتخزينها حتى استخدامها. ولكن يجب أن تكون جميع المخازن المؤقتة العاملة طازجة في يوم الاستخراج (عن طريق التخفيف من المخزون والاختلاط مع المحتويات الأخرى) وأن توضع على الجليد أثناء العملية. وينبغي أن يتم تنفيذ التجربة بأكملها عند 4 درجات مئوية ما لم يوصَ بخلاف ذلك.
| الكواشف | تركيز المخزون | EB1 | EB2A | EB2B |
| حجم الصوت (مل) | حجم الصوت (مل) | حجم الصوت (مل) | ||
| السكروز | 2.5 مليون | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| تريس HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| DTT | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| مثبطات البروتياز (PI) اللوحي | 0.5 حبة | 0.5 حبة | 0.5 حبة | |
| مثبطات إضافية (اختياري) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| تريتون X100 | 10% | 1.25 | ||
| الحجم الإجمالي | 25 مل | 12.5 مل | 5 مل | |
الجدول 1: تركيب مخازن الاستخراج المؤقتة (EBs).
| Nlb | تركيز المخزون | حجم الصوت (مل) |
| NaCl | 5M | 0.4 |
| تريس HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| تريتون X100 | 10% | 0.5 |
| EDTA | 0.5 مليون | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| أقراص PI | 0.5 حبة | |
| مثبطات إضافية (اختياري) | 33mM | 0.05 |
| الحجم الإجمالي | 5 مل |
الجدول 2: تكوين العازلة للتحلل النووي (NLB).
3. إجراء عزل النوكلي
ملاحظة: يوصى بإجراء الخطوات 3.1-3.3 من اليوم الأول (2-3 ساعة)، وحفظ النوى في المخزن المؤقت NLB عند -80 درجة مئوية واستئناف اليوم التالي (أو في وقت لاحق) لتنقية البروتين (4 ساعات). تم تكييف خطوات عزل النوى في هذا البروتوكول من بروتوكول chip-chip الذرة الرفيعة المستخدمة في معهد الجينوم المشترك. قد تكون هناك حاجة إلى غسلات إضافية وفصل تدرج السكروز لضمان نقاء النوى لتطبيقات ChIP-seq.
4. قياس الطيف الشامل من histones النقية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
بعد البروتوكول، يمكن استخراج الهستونات وتحديدها باستخدام تحليل LC-MS. تتوفر البيانات الأولية والنتائج المعالجة في Massive (https://massive.ucsd.edu/) عن طريق الانضمام: MSV000085770. استنادا إلى نتائج TopPIC من عينة تمثيلية (متاحة أيضا من Massive)، حددنا 303 بروتيوفورم هيستون (106 H2A، 72 H2B، 103 H3، و 22 H4 proteoforms). كما تم الكشف عن بروتويفورمات الريبوسومية المنقية، وعادة ما يتم التهيّم في وقت مبكر من LC. وعادة ما تتكون من ~ 20 ٪ من بروتيوفورمات محددة ، ولكن لا تتداخل مع بروتيوفورم هيستون يتلخص في مرحلة لاحقة من الا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول المعروض يصف كيفية استخراج histones من أوراق الذرة (أو عموما ورقة النبات) عينات. ومن المتوقع أن يكون متوسط العائد من الحجر الهحي 2-20 ميكروغرام لكل 4-5 غرام من مادة أوراق الذرة الرفيعة. المواد هي نقية بما فيه الكفاية لتحليل المصب هيستون من قبل LC-MS (في الغالب histones مع ~ 20٪ تلوث البروتين الريبوسومي). قد يتم الحصول على عائد أقل بسبب تباينات العينات أو سوء معالجة/فشل محتمل خلال البروتوكول. الحفاظ على سلامة النوى قبل خطوة الانحلال هو أمر بالغ الأهمية; لذلك، يجب تجنب دوامة العدوانية و pipetting قبل إضافة NLB. ب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نشكر رونالد مور وتوماس فيلمور للمساعدة في تجارب الطيف الشامل، وماثيو مونرو لترسب البيانات. تم تمويل هذا البحث من خلال منح من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) البحوث البيولوجية والبيئية من خلال مكافحة اللاجينية لمكافحة الجفاف في مشروع SORGHUM (EPICON) تحت رقم المنحة DE-SC0014081، من وزارة الزراعة الأمريكية (وزارة الزراعة الأمريكية( CRIS 2030-21430-008-00D)، ومن خلال معهد الطاقة الحيوية المشترك (JBEI)، وهو مرفق برعاية DOE (العقد DE-AC02-05CH11231) بين مختبر لورانس بيركلي الوطني و DOE. وقد أُجري البحث باستخدام مختبر العلوم الجزيئية البيئية (EMSL) (grid.436923.9)، وهو مرفق تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أسيتونيتريل | فيشر كيميكال | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA ، محلول 500 ملي متر ، درجة الحموضة 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500 مل | |
| حمض الفورميك | الحراري العلمي | 28905 | |
| جوانيدين هيدروكلوريد | سيجما | G3272-100G | |
| MgCl2< / sub> | سيجما | M8266-100G | |
| فوسفات البوتاسيوم ، | سيجما | P3786-100G | |
| ، أقراص cOmplete | Roche | 5892791001 | |
| زبدات الصوديوم | Sigma | 303410-5G | تستخدم لمثبط هيستون ديستيلاز |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| الصوديوم الفلورايد | سيجما | S7020-100G | يستخدم لمثبط الفوسفاتيز |
| الصوديوم أورثوفاناديت | سيجما | 450243-10G | يستخدم لمثبط الفوسفاتيز |
| السكروز | سيجما | S7903-5KG | |
| تريس-حموك الهيدروكلوريك | فيشر العلمي | BP153-500 جم | |
| تريتون X-100 | سيجما | T9284-100ML | |
| راتنج تبادل الكاتيون الضعيف ، شبكة 100-200 تحليلي (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| <قوي > المستهلك < / قوي > | |||
| عمود الكروماتوغرافيا (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| شبكة 100 قماش مرشح | Millipore Sigma | NY1H09000 | هذا جزء من مجموعة Sigma (كتالوج # CELLYTPN1) لاستخراج نوى النبات. يمكن استخدام مرشحات مماثلة بنفس حجم الشبكة. |
| أطراف الماصات الدقيقة (P20 ، P200 ، P1000) | سيجما | ||
| ، 50 مل / 15 مل ، جهاز طرد مركزي ، أنبوب مخروطي | جينيسي Scientific | 28-103 | |
| ، جهاز طرد مركزي دقيق ، 1.5 / 2 مل | سيجما | ||
| < قوي > المعدات < / قوي > | |||
| الميزان التحليلي | فيشر Scientific | 01-912-401 | |
| أكواب ( 50 مل &ndash ؛ 2L) | |||
| جهاز طرد مركزي دقيق مع تبريد | فيشر Scientific | 13-690-006 | |
| ماصات | |||
| متأرجحة دلو الطرد المركزي مع التبريد | فيشر Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| حمام مائي Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن