مقالة منهجية

عزل هيستون من نسيج أوراق الذرة الرفيعة لقياس الطيف الكتلي العلوي لأسفل من العلامات اللاجينية المحتملة

DOI:

10.3791/61707

⸱

مارس 4, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتمي Histones إلى عائلة من البروتينات المحفوظة للغاية في eukaryotes. أنها حزمة الحمض النووي في نيوكلوزومات وحدات وظيفية من الكروماتين. إن التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) من الهستونات، التي تتسم بديناميكية عالية ويمكن إضافتها أو إزالتها بواسطة الإنزيمات، تلعب أدوارًا حاسمة في تنظيم التعبير الجيني. في النباتات، ترتبط العوامل اللاجينية، بما في ذلك PTMs هيستون، باستجاباتها التكيفية للبيئة. يمكن أن يؤدي فهم الآليات الجزيئية للتحكم في اللاجينية إلى توفير فرص غير مسبوقة لحلول الهندسة الحيوية المبتكرة. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل النوى وتنقية histones من أنسجة ورقة الذرة الرفيعة. يمكن تحليل الهستونات المستخرجة في أشكالها سليمة من خلال قياس الطيف الكتلي (MS) من أعلى إلى أسفل إلى جانب الكروماتوغرافيا السائلة (LC) على الإنترنت مع عكس المرحلة (RP). يمكن بسهولة تحديد تركيبات و قياس التشنج من PTMs متعددة على نفس بروتيوفورم الحجر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن قطع ذيل هيستون باستخدام سير العمل LC-MS من أعلى إلى أسفل، وبالتالي، مما يؤدي إلى التشكيل الجانبي PTM العالمي من الهستونات الأساسية (H4، H2A، H2B، H3). لقد طبقنا هذا البروتوكول في السابق على تعريف HISTONE PTMs من أنسجة أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها من دراسة ميدانية واسعة النطاق ، تهدف إلى تحديد العلامات اللاجينية لمقاومة الجفاف. ويمكن تكييف البروتوكول وتحسينه لتسلسل التسلسل المناعي للكروماتين (ChIP-eq)، أو لدراسة PTMs هيستون في النباتات المماثلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المتوقع أن تؤثر شدة وتواتر الجفاف المتزايد على إنتاجية محاصيل الحبوب1،2. الذرة الرفيعة هي محصول من الحبوب الغذائية والطاقة معروف بقدرته الاستثنائية على تحمل الظروف التي تحد من المياه3،4. نحن نسعى لفهم ميكانيكي للتفاعل بين الإجهاد الجفاف، والتنمية النباتية، وعلم الوراثة من الذرة الرفيعة[الذرة الرفيعة ثنائية الألوان (L.) Moench). وقد أظهرت أعمالنا السابقة صلات قوية بين النبات وrizosphere الميكروبيوم في التغلب على الجفاف والاستجابات على المستوى الجزيئي5،6،....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مادة أوراق الذرة الرفيعة

ملاحظة: تزرع نباتات الذرة الرفيعة في التربة في الحقل في بارلييه، كاليفورنيا.

  1. جمع أوراق الذرة الرفيعة من النباتات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 مل وتجميد الأنبوب فورا في النيتروجين السائل. جمع الأنسجة ورقة من قبل تمزيق قبالة ورقة الثالث والرابع ظهرت تماما من الحرث الابتدائي.
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل عن حالة الحقل ونمو العينة و المجموعة في التقرير المنشور18.
  2. طحن يترك مع النيتروجين السائل ونقلها على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي.
  3. تخزين ورقة الأرض في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. اتخاذ حوالي 4 غرام من مسحوق ورقة البرد الأرض لتحليل هيستو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد البروتوكول، يمكن استخراج الهستونات وتحديدها باستخدام تحليل LC-MS. تتوفر البيانات الأولية والنتائج المعالجة في Massive (https://massive.ucsd.edu/) عن طريق الانضمام: MSV000085770. استنادا إلى نتائج TopPIC من عينة تمثيلية (متاحة أيضا من Massive)، حددنا 303 بروتيوفورم هيستون (106 H2A، 72 H2B، 103 H3، و 22 H4 proteoforms). كما تم الكشف عن بروتويفورمات الريبوسومية المنقية، وعادة ما يتم التهيّم في وقت مبكر من LC. وعادة ما تتكون من ~ 20 ٪ من بروتيوفورمات محددة ، ولكن لا تتداخل مع بروتيوفورم هيستون يتلخص في مرحلة لاحقة من الا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المعروض يصف كيفية استخراج histones من أوراق الذرة (أو عموما ورقة النبات) عينات. ومن المتوقع أن يكون متوسط العائد من الحجر الهحي 2-20 ميكروغرام لكل 4-5 غرام من مادة أوراق الذرة الرفيعة. المواد هي نقية بما فيه الكفاية لتحليل المصب هيستون من قبل LC-MS (في الغالب histones مع ~ 20٪ تلوث البروتين الريبوسومي). قد يتم الحصول على عائد أقل بسبب تباينات العينات أو سوء معالجة/فشل محتمل خلال البروتوكول. الحفاظ على سلامة النوى قبل خطوة الانحلال هو أمر بالغ الأهمية; لذلك، يجب تجنب دوامة العدوانية و pipetting قبل إضافة NLB. ب.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر رونالد مور وتوماس فيلمور للمساعدة في تجارب الطيف الشامل، وماثيو مونرو لترسب البيانات. تم تمويل هذا البحث من خلال منح من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) البحوث البيولوجية والبيئية من خلال مكافحة اللاجينية لمكافحة الجفاف في مشروع SORGHUM (EPICON) تحت رقم المنحة DE-SC0014081، من وزارة الزراعة الأمريكية (وزارة الزراعة الأمريكية( CRIS 2030-21430-008-00D)، ومن خلال معهد الطاقة الحيوية المشترك (JBEI)، وهو مرفق برعاية DOE (العقد DE-AC02-05CH11231) بين مختبر لورانس بيركلي الوطني و DOE. وقد أُجري البحث باستخدام مختبر العلوم الجزيئية البيئية (EMSL) (grid.436923.9)، وهو مرفق تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسيتونيتريلفيشر كيميكالA955-4L
Dithiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA ، محلول 500 ملي متر ، درجة الحموضة 8.0EMD Millipore Corp324504-500 مل
حمض الفورميكالحراري العلمي28905
جوانيدين هيدروكلوريدسيجماG3272-100G
MgCl2< / sub>سيجماM8266-100G
فوسفات البوتاسيوم ،سيجماP3786-100G
، أقراص cOmpleteRoche5892791001
زبدات الصوديومSigma303410-5Gتستخدم لمثبط هيستون ديستيلاز
كلوريد الصوديوم (NaCl)SigmaS1888
الصوديوم الفلورايدسيجماS7020-100Gيستخدم لمثبط الفوسفاتيز
الصوديوم أورثوفاناديتسيجما450243-10Gيستخدم لمثبط الفوسفاتيز
السكروزسيجماS7903-5KG
تريس-حموك الهيدروكلوريكفيشر العلميBP153-500 جم
تريتون X-100سيجماT9284-100ML
راتنج تبادل الكاتيون الضعيف ، شبكة 100-200 تحليلي (BioRex70)Bio-Rad142-5842
<قوي > المستهلك < / قوي >
عمود الكروماتوغرافيا (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
شبكة 100 قماش مرشحMillipore SigmaNY1H09000هذا جزء من مجموعة Sigma (كتالوج # CELLYTPN1) لاستخراج نوى النبات. يمكن استخدام مرشحات مماثلة بنفس حجم الشبكة.
أطراف الماصات الدقيقة (P20 ، P200 ، P1000)سيجما
، 50 مل / 15 مل ، جهاز طرد مركزي ، أنبوب مخروطيجينيسي Scientific28-103
، جهاز طرد مركزي دقيق ، 1.5 / 2 ملسيجما
< قوي > المعدات < / قوي >
الميزان التحليليفيشر Scientific01-912-401
أكواب ( 50 مل &ndash ؛ 2L)
جهاز طرد مركزي دقيق مع تبريدفيشر Scientific13-690-006
ماصات
متأرجحة دلو الطرد المركزي مع التبريدفيشر Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
حمام مائي SonicatorFisher Scientific15-336-120
كوكتيل مثبط ثنائي القاعدة أنبوب دقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة