مقالة منهجية

توليد نماذج تجريبية حادة ومزمنة للتعبير الحركي في الفئران

DOI:

10.3791/61743

⸱

مايو 27, 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكولات لتوليد نماذج تجريبية حادة ومزمنة للتعبير عن التشنج اللاستيكي في الفئران التي تتصرف بحرية. وتستند النماذج على زرع القنية سترياتال و GABAاللاحقة تطبيق خصم. يستخدم النموذج الحاد الحقن العابرة في حين يستخدم النموذج المزمن التسريبات المطولة عبر مضخة صغيرة التناضح المزروعة تحت الجلد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشنجات اللاإرادية الحركية هي حركات مفاجئة وسريعة ومتكررة هي الأعراض الرئيسية لمتلازمة توريت وغيرها من الاضطرابات اللاإرادية. يرتبط الفيزيولوجيا المرضية للجيل اللاتكي بتثبيط غير طبيعي للغنجلية القاعدية ، وخاصة هيكل الإدخال الأساسي ، المخطط. في النماذج الحيوانية من كل من القوارض والرئيسيات غير البشرية, التطبيق المحلي للخصوم GABAA, مثل بيكوكلين وpicrotoxin, في الأجزاء الحركية من المخطط يحفز التثبيط المحلي مما أدى إلى التعبير عن التشنجات اللاإرادية الحركية.

هنا، نقدم نماذج حادة ومزمنة من التشنجات اللاإرادية الحركية في الفئران. في النموذج الحاد ، تثير الميكروبات البيكوكلينية من خلال قنية مزروعة في المخطط الظهري التعبير عن العرات التي تستمر لفترات زمنية قصيرة تصل إلى ساعة. النموذج المزمن هو بديل يمكن من تمديد التعبير اللاستيكي لفترات عدة أيام أو حتى أسابيع ، وذلك باستخدام التسريب المستمر للبيكوكلين عبر مضخة صغيرة التناضح تحت الجلدي.

تمكن النماذج من دراسة الآليات السلوكية والعصبية للجيل اللاتكي في جميع أنحاء مسار العقد القاعدية القشرية. تدعم النماذج زرع أجهزة تسجيل وتحفيز إضافية بالإضافة إلى قنية الحقن ، مما يسمح بمجموعة واسعة من الاستخدامات مثل التحفيز الكهربائي والبصري والتسجيلات الكهربية. كل طريقة لها مزايا وأوجه قصور مختلفة: النموذج الحاد يتيح مقارنة الخصائص الحركية للحركة والتغيرات الكهربية المقابلة قبل وأثناء وبعد التعبير اللاستيكي وآثار المغيرات قصيرة الأجل على التعبير اللاجي. وهذا النموذج الحاد بسيط التثبت؛ ومع ذلك، يقتصر على فترة قصيرة من الزمن. النموذج المزمن ، على الرغم من تعقيده ، يجعل من الممكن دراسة الديناميكيات اللاتكية والآثار السلوكية على التعبير اللاتشيكي على مدى فترات طويلة. وهكذا، فإن نوع الاستعلام التجريبي يدفع الاختيار بين هذين النموذجين التكميليين للتعبير اللاستيك.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشنجات اللاإرادية هي الأعراض المميزة لمتلازمة توريت (TS) وغيرها من الاضطرابات اللاإرادية. وتوصف التشنجات اللاإرادية والحركات المفاجئة والسريعة والمتكررة (التشنجات اللاإرادية الحركية) ، أو غناء (التشنجات اللاإرادية الصوتية)1. يتقلب التعبير التشغي عادة في الصدغي (التردد)2 والمكاني (الكثافة، موقع الجسم)3 خصائص على نطاقات زمنية متعددة (ساعات وأيام وأشهر وسنوات). تتأثر هذه التغيرات بعوامل مختلفة، مثل السمات البيئية4و5و الحالات السلوكية6و7و القمع الطوعي و المؤقت8.

على الرغم من أن آلية الخلايا العصبية التي تحكم التشنجات اللاإرادية الحركية لا تزال غير مفهومة تماما ، فقد قدم عدد متزايد من الدراسات النظرية والتجريبية أدلة جديدة على طبيعتها9. حاليا، ويعتقد أن الفيزيولوجيا المرضية للجيل تيك لإشراك حلقة العقدة القشرية القاعدية (CBG)، ويرتبط على وجه التحديد مع تثبيط غير طبيعي للم المخطط، والنوة الأساسية مدخلات العقد القاعدية10،11،12. وقد أظهرت الدراسات السابقة في القوارض والرئيسيات أن المخطط يمكن أن يكون مثبطا من خلال التطبيق المحلي لمختلف الخصوم GABAA, مثل بيكوكلين وpicrotoxin13,14,15,16,17,18. هذا التدخل الدوائي يؤدي إلى التعبير الحركي العابر في الجانب المقابل للحقن ، وبالتالي إنشاء نموذج حاد قوي للاضطرابات اللاإرادية مع صحة الوجه والبناء. النموذج الحاد بسيط للحث ويجعل من الممكن دراسة آثار التشكيل على المدى القصير مثل التحفيز الكهربائي والبصري المتزامن مع التسجيلات الكهربية والحركية قبل وأثناء وبعد التعبير اللاستيك. ومع ذلك ، يقتصر النموذج الحاد على الفترة الزمنية القصيرة التالية للحقن. استنادا إلى النموذج الحاد، اقترحنا مؤخرا نموذجا مزمنا من توليد التشنج اللاستيك في الفئران التي تستخدم ضخ طويلة، ومعدل ثابت من بيكوكلين إلى المخطط عن طريق مضخة صغيرة التناضح تحت الجلد المزروعة19. هذا النموذج يمتد فترة التعبير عن تيك لعدة أيام / أسابيع. الإفراج المستمر من بيكوكلين على مدى فترة طويلة من الزمن يسمح لفحص آثار مجموعة متنوعة من العوامل مثل العلاجات الدوائية والدول السلوكية على التعبير عن التشنج اللاستيك.

هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد النماذج الحادة والمزمنة للتعبير عن التشنج اللاستيك في الفئران. كدالة لمسألة البحث المحددة ، تمكن البروتوكولات من ضبط المعلمات بما في ذلك الزرع الأحادي مقابل الثنائي ، وموقع العرات (وفقا للتنظيم السوماتاتونية للمرحلة)18 وزاوية قنية الزرع (اعتمادا على موقع الأجهزة المزروعة الإضافية). وتستند الطريقة المستخدمة في النموذج المزمن جزئيا على المنتجات التجارية ولكن مع تعديلات حاسمة لتناسب نموذج تيك. هذه المقالة تفاصيل التعديلات اللازمة لتخصيص هذه النماذج تيك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت اللجنة المؤسسية المعنية برعاية الحيوان واستخدامه وأشرفت على جميع الإجراءات والتزمت بالدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات والمبادئ التوجيهية لجامعة بار إيلان بشأن استخدام الحيوانات المختبرية في البحوث ورعايتها. وقد وافقت اللجنة الوطنية للتجارب على الحيوانات المختبرية بوزارة الصحة على هذا البروتوكول.

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الفئران الطويلة إيفانز الإناث (نماذج حادة ومزمنة) والجرذان سبراغ داولي الإناث (نموذج حاد) الذين تتراوح أعمارهم بين 3-10 أشهر، 280-350 غرام. وينبغي اختبار تنفيذ هذه النماذج في سلالات أخرى، والأوزان أو الأعمار بعناية لرد فعل مختلف.

1. نموذج حاد

  1. تحضير ما قبل الجراحة
    1. إعداد زرع القنية
      ملاحظة: يمكن غرسة القنية حقن بيكوكلين المحلية في المخطط.
      1. قطع الفولاذ المقاوم للصدأ، 25 G (OD 0.02'' ، معرف 0.015'') أنبوب نقص للحصول على زرع قنية(الشكل 1، #1 الجهاز). استخدام أداة دوارة لتحقيق حواف مستقيمة. طول القنية يعتمد على عمق الهدف زرع، وزاوية زرع القنية، وارتفاع الغطاء عزز النهائي. يجب أن يكون عمق هدف الزرع أعلى من هدف الحقن النهائي لمنع تلف الأنسجة ب 2 مم (0.079').
        ملاحظة: يحدد أعلى كائن مزروع ارتفاع الغطاء.
      2. الرمل وسلس حواف زرع قنية، ومنع الاحتكاك ميكانيكي إضافية إلى الدماغ. أدخل إبرة 30 G (0.01') من خلالها لإزالة أي عوائق داخلية.
    2. إعداد وهمية
      ملاحظة: الدمية هي سلك داخلي قابل للإزالة يوضع داخل القنية المزروعة. الدمية الأختام القنية المزروعة، وبالتالي منع عرقلة لها.
      1. جعل دمية عن طريق قطع سلك 0.013 '' مع أداة دوارة. يجب أن تكون الدمية 3 مم (0.118') أطول من طول غرسة القنية(الشكل 1، الجهاز #2).
      2. أدخل الدمية في قنية الزرع حتى تصل إلى النهاية. ثني السلك الزائد عن طريق قرصه ضد القنية. يجب أن يكون الجزء المنحني دافقا مع قنية الزرع لمنع الدمية من السقوط من القنية المزروعة ، ومنع الجرذ من إزالتها.
    3. إعداد حاقن
      ملاحظة: حاقن, تتألف من أنبوب مرن وحقن-cannula (الشكل 1, جهاز #3), تمكن حقن بيكوكلين مباشرة في المخطط.
      1. قطع 70 سم (27.559') مرنة البوليمر أنبوب ميكروبوري (OD 0.06'' ، معرف 0.02') (الشكل 1، جهاز #3.1).
        ملاحظة: يتم تعريف طول الأنبوب المرن من خلال المسافة بين القفص التجريبي وموقع جهاز ضخ المضخة. يجب أن تكون طويلة بما يكفي لتمكين حرية حركة الفئران خلال فترة الحقن ، ولكن ليس طويلا ، لتجنب الحصول على الفئران متشابكة في ذلك (انظر الشكل 3A).
      2. قطع الفولاذ المقاوم للصدأ، 30 G (OD 0.012'' ، معرف 0.007'') أنبوب نقص للحصول على حقن القنية(الشكل 1، جهاز #3.2). استخدام أداة دوارة لتحقيق حواف مستقيمة. يجب أن قياس 5 مم (0.197'') أطول من قنية زرع: 2 مم (0.079'') أطول من القنية المزروعة داخل الدماغ للوصول إلى هدف الحقن النهائي، و 3 ملم (0.118') لإدراجه في أنبوب مرن.
      3. الرمل وسلس غيض من الحقن قنية, منع الاحتكاك ميكانيكي إضافية إلى الدماغ. أدخل سلكا قياس قطره 0.005'' للتحقق من أنه دون عائق.
      4. إدراج 3 مم (0.118'' من قنية الحقن في أنبوب مرن والغراء المفصل بينهما, للحصول على حاقن. استخدام سيانواكريلات (CA) الغراء ومسرع كاليفورنيا.
      5. إرفاق حقنة مع إبرة 25 G (0.018'' مليئة بالماء المعقم إلى حاقن وغسلها من خلال. وهذا يضمن أن اتجاه التدفق الخروج من قنية الحقن هو مستقيم وجهد. الأهم من ذلك، إذا كان التدفق غير مستقيم، استخدم طرف إبرة 30 G (OD 0.01'') لإزالة أي عوائق وتكبير ثقب قنية الحقن، وإعادة التحقق من التدفق.
    4. إعداد حامل الكانولا
      ملاحظة: يتم توصيل حامل القنية بالذراع المجسمة ويحمل قنية الزرع أثناء الزرع. يتكون حامل القنية من قاعدة حامل القنية والرصاص حامل القنية ، والتي يتم لصقها معا(الشكل 1، #4 الجهاز). أثناء عملية الزرع ، يتم إرفاق قاعدة حامل القنية بالذراع المجسمة ، ويتم إرفاق الرصاص الحامل للقنية بقنية الزرع.
      1. قاعدة حامل القنية: قطع 10 سم (3.947') من الفولاذ المقاوم للصدأ، 22 G (OD 0.028'' ، معرف 0.017'' أنبوب نقص (الشكل 1، الجهاز #4.1).
      2. الرصاص حامل القنية: قطع 0.013 '' سلك بطول 3 ملم (0.118') أطول من زرع القنية المطلوبة (الشكل 1, جهاز #4.2).
      3. إدراج الرصاص حامل القنية في قاعدة حامل القنية والغراء المفصل بينهما، وذلك باستخدام الغراء كاليفورنيا ومسرع كاليفورنيا. يجب أن يكون الرصاص 1 مم (0.039') أقصر من قنية الزرع ، لتجنب تلف الأنسجة أثناء الزرع.
    5. إعداد بيكوكلين: حل الميثيويد بيكوكلين في السائل النخاعي المالح الفسيولوجي أو الاصطناعي (ACSF) إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر. تقسيم bicuculline المذاب إلى 1 مل المحاقن، وتغطي مع رقائق الألومنيوم، وتجميد في -20 درجة مئوية حتى الحاجة. عند الضرورة، إذابة المحقنة قبل الاستخدام.
  2. جراحة
    1. حث التخدير الأولي عن طريق وضع الفئران في غرفة مصممة وتقديم 4-5٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين بمعدل 0.5-1 لتر / دقيقة. ثم، حقن الفئران العضلي (IM أو IP) مع الكيتامين وXylazine (100 و 10 ملغ / كغ، على التوالي) خليط.
    2. حلق رأس الجرذ باستخدام مقص كهربائي.
    3. ضع جل الليدوكائين في آذان الجرذ. وضع هلام البترول على عيون الفئران لمنع تجفيف القرنية والصدمات النفسية.
    4. تأمين الفئران في الإطار المجسم باستخدام قضبان الأذن وشريط الأسنان.
    5. مسح فروة رأس الجرذ باليود بوفيدوني ومن ثم مع مسح الكحول لتعقيم المنطقة. التسلل على طول خط شق المطلوب مع 0.5 - 1٪ حل الليدوكائين تحت الجلد (SC). باستخدام شفرة مشرط، إجراء شق على طول فروة الرأس.
    6. سحب اللفافة نحو حواف لفتح المنطقة الجراحية.
    7. تنظيف الجمجمة مع المالحة المعقمة، وذلك باستخدام مسحات القطن. في حالة النزيف، استخدم الكي لتكوية الشعيرات الدموية. هذه الخطوة حاسمة لاستقرار الحد الأقصى مع مرور الوقت.
    8. المشبك اللفافة مع أربعة hemostats المنحني (اثنين من الأمامي، واثنين من الخلفي) لتكبير الموقع الجراحي.
    9. قياس إحداثيات البريغما ولامدا. مستوى إحداثيات دورسوفينترال (DV) من النقطتين، بحيث تكون ضمن نطاق 100 ميكرومتر.
    10. باستخدام جهاز ستيريوتاكسيك، وقياس ووضع علامة على إحداثيات المناطق ذات الاهتمام ومسامير مرساة لزرعها. إحداثيات قنية الزرع المستقيم للتحريض على التشنج اللاستيكي في منطقة الأطراف الأمامية هي: AP: +1 إلى +1.5، مل: ±2.5، DV: 3؛ منطقة hindlimb: AP: -0.4 إلى -0.5، مل: ±3.5، DV:318،20.
      ملاحظة: في حالة زرع أجهزة متعددة تمنع زرع القنية مباشرة، قم بتغيير زاوية زرع القنية وإحداثياتها وفقا لذلك (إحداثيات الأطراف الأمامية: AP: +2.7، مل: ±2.5، DV: 3، الزاوية 15 درجة من الأمامي إلى الخلفي).
    11. حفر ثقوب في الجمجمة تحت المجهر. استخدام آلة حفر الأسنان مع 1/4-1/2 حجم بت كربيد جولة الجراب. لتقليل مخاطر إصابة الدماغ، قم بضبط سرعة الحفر وفقا لمهارات الحفر وتجنب أي ضغط ميكانيكي. حفر حتى الدماغ مرئيا، لحوالي 1 ملم. امتصاص أي دم مع مسحة القطن ويغسل مع المالحة المعقمة.
      ملاحظة: مسامير مرساة تعمل على تحقيق الاستقرار في الغطاء. تأكد من وجود مسامير في نصفي الكرة الأرضية وعلى طول المحور الأمامي الخلفي.
    12. زرع القنية
      1. المسمار مسامير مرساة في الثقوب. استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ #0 × 1/8 مسامير الحجم.
        ملاحظة: يعتمد عدد مسامير المرساة على العدد الإجمالي للأجهزة المزروعة. يجب أن تصل البراغي الأرضية (مثل التسجيلات الكهربائية أو التحفيز الكهربائي) إلى سطح الدماغ.
      2. إرفاق حامل القنية إلى الذراع ستيريوتاكسيك.
      3. الشريحة زرع قنية على حامل القنية. ضع قنية الزرع ببطء فوق الثقب حتى تصل إلى الدماغ.
      4. قياس إحداثيات DV بدءا من سطح الدماغ. خفض قنية الزرع حتى هدف الزرع. امتصاص أي دم يخرج من الحفرة بمسحة قطنية، وغسل مع المالحة المعقمة ومن ثم تجف جيدا.
      5. الغراء القنية المزروعة إلى الجمجمة باستخدام هلام الغراء. انتظر حتى يجف.
      6. تطبيق الاسمنت الأسنان على طول القنية المزروعة لإرفاقه إلى الجمجمة. اترك 2 مم (0.079') تمتد من نهايتها العليا لتمكين الإدراج الوهمي. انتظر حتى يجف.
        ملاحظة: لا تضع الاسمنت على حامل القنية.
      7. ارفع حامل القنية، تاركا القنية المزروعة في مكانها.
      8. أدخل الدمية في القنية المزروعة.
      9. زرع جميع الأجهزة الأخرى مثل تسجيل صفائف، والألياف البصرية، والأقطاب التحفيز الخ. تطبيق الاسمنت الأسنان على بقية الجمجمة، وتغطي جميع يزرع.
      10. حقن 3 مل من محلول رينغر درجة حرارة الغرفة وكاربروفين 5 ملغم / كغ SC21.
      11. مراقبة الفئران حتى يستعيد وعيه (الحيوان تستقيم، والسيطرة على مجرى الهواء وليس في خطر الطموح). أعد الجرذ إلى قفصه المنزلي للتعافي التام.
  3. الميكروبيكشنات
    ملاحظة: أثناء الحقن، من المهم التحقق من أن تدفق بيكوكلين سليم. ويمكن القيام بذلك عن طريق السماح لفقاعة الهواء الصغيرة شكل في حاقن ورصد حركتها. يمكن ملء الحجم المتبقي من المحقن بالمحلول الملحي ، بحيث لا يضيع البيكوكلين.
    1. إرفاق حاقن لحقنة بيكوكلين مع إبرة 25 G (OD 0.018''). ملء ~ 1/3-1/2 من حاقن وإزالة الحقنة، مما يسمح لتشكيل فقاعة الهواء الصغيرة.
    2. قم بإرفاق المحقن بحقنة معقمة مملوءة بالمحلول الملحي بإبرة 25 G (OD 0.018'). ملء حاقن حتى يصل إلى نهاية بيكوكلين وصغيرة قطرة يخرج منه.
    3. إزالة المكبس من 10 ميكرولتر الدقيقة الزجاج microsyringe.
    4. قطع وإرفاق أنبوب البوليمر قصيرة مرنة (~ 3 سم، 1.181'' إلى microsyringe الزجاج الدقة.
    5. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب القصير المرونة بحقنة 1 مل، إبرة 25 G (OD 0.018') مليئة بالماء العقيم.
    6. حقن الماء من خلال أنبوب قصير مرن في microsyringe الزجاج الدقيق حتى يخرج الماء منه. افصل الأنبوب قصير المرونة.
    7. أعد إدخال المكبس حتى يصل إلى علامة ~7 ميكرولتر على الميكروسرينج الزجاجي الدقيق.
    8. أدخل microsyringe الزجاج الدقة في فتحة متجهة في جهاز ضخ مضخة.
    9. إرفاق حاقن إلى microsyringe الزجاج الدقة وتكوين إعدادات بمعدل 0.35 ميكرولتر / دقيقة وحجم إجمالي قدره 0.35 ميكرولتر.
    10. ضع مسحة ورقية تحت طرف الحقن. وضع علامة على موقع فقاعة الهواء على حاقن، بدء تشغيل جهاز ضخ مضخة والتحقق من أن قطرة بيكوكلين يظهر. بعد الحقن، ضع علامة على موقع فقاعة الهواء مرة أخرى.
      ملاحظة: الفرق بين علامتين يتوافق مع الفرق المطلوب أثناء الحقن التجريبي.
    11. ضع الجرذ في القفص التجريبي وأزل الدمية
    12. أدخل المحقن في القنية المزروعة حتى النهاية (انظر الشكل 3A).
    13. بدء تشغيل جهاز ضخ مضخة. تحقق من أن فقاعة الهواء تتحرك. بدء ساعة توقيت لتتبع بدء التشنج اللاتي وأوقات الإنهاء.
    14. دقيقة واحدة بعد الحقن، وإزالة حاقن وإعادة إدراج الدمية ببطء.
      ملاحظة: إدراج دمية بعد الحقن يدفع بيكوكلين في هدف الحقن.
  4. بعد الحقن
    1. افصل المحقن عن الحقن المجهري الزجاجي الدقيق.
    2. اغسل المحلول المتبقي من المحقن، باستخدام حقنة مملوءة بالهواء. تنظيف حاقن بالماء العقيم ومن ثم استنزاف عن طريق حقن الهواء من خلال حاقن.
    3. قطع microsyringe الزجاج الدقة من جهاز ضخ مضخة وتنظيفه بالماء العقيم.

2. نموذج مزمن

  1. تحضير ما قبل الجراحة
    1. إعداد دليل الكانولا
      ملاحظة: دليل القنية هو جزء من أنبوب التسريب ويستخدم لإرفاق التسريب-كانولا إلى حامل القنية أثناء الزرع.
      1. قطع 12 ملم (0.472') من الفولاذ المقاوم للصدأ، 25 G (OD 0.02'' ، معرف 0.015'') أنبوب نقص للحصول على دليل القنية(الشكل 2، #1 الجهاز). استخدام أداة دوارة لتحقيق حواف مستقيمة.
      2. إعداد حامل القنية كما هو موضح في الخطوة 1.1.4. أدخل حامل القنية في دليل القنية للتحقق من توصيله بشكل صحيح وإزالته.
    2. إعداد التسريب والقنية
      ملاحظة: التسريب-cannula هو أيضا جزء من أنبوب التسريب. يتم زرعه في الهدف النهائي للم المخطط ويسمح بالتسريب البؤري للبيكوكلين.
      1. قطع الفولاذ المقاوم للصدأ، 30 G (OD 0.012'' ، معرف 0.007'') أنبوب نقص للحصول على ضخ قنية. استخدام أداة دوارة لتحقيق حواف مستقيمة. إجمالي طول التسريب والقنية هو مجموع عمق الزرع المطلوب بالإضافة إلى عامل أمان (~ 1-2 مم ، 0.039'-0.079'' ، الجزء المنحني التسريب القنية (2 مم ، 0.079') ، التداخل مع دليل القنية (3 مم ، 0.118') ، والجزء الأفقي (4 مم ، 0.157')(الشكل 2، #2 الجهاز).
        ملاحظة: على عكس النموذج الحاد ، فإن عمق الزرع يساوي هدف التسريب النهائي.
      2. إدراج سلك قطرها 0.005 '' في ضخ cannula وثنيها في شكل L في الموقع المقصود. الجزء العمودي يتوافق مع عمق الزرع المطلوب بالإضافة إلى 4-5 مم (0.157'-0.197'' ، والجزء الأفقي هو 4 مم (0.157'') طويلة.
        ملاحظة: إن إدخال السلك الداخلي يمنع انسداد القنية أثناء الانحناء.
    3. إعداد أنابيب قسطرة مرنة
      ملاحظة: بل هو أيضا عنصر من ضخ أنبوب. وهو يربط بين ضخ قنية إلى مضخة صغيرة التناضح عن طريق محول أنابيب.
      1. قطع 8 سم (3.149') من البولي ايثيلين (PE) - 10 أنابيب (معرف 0.011'' ، OD 0.025'' (الشكل 2، #3 الجهاز).
        ملاحظة: يتم تحديد طول القسطرة من خلال المسافة بين هدف الزرع وموقع المضخة، مما يسمح بحرية حركة رأس الجرذ ورقبته (انظر الشكل 3B).
    4. تجميع أنبوب التسريب
      ملاحظة: أنبوب التسريب تجري بيكوكلين من مضخة صغيرة التناضح إلى الدماغ. وهو يتألف من القنية دليل، ضخ-cannula، وأنابيب القسطرة مرنة، ومحول الأنابيب وتدفق مشرف(الشكل 2).
      1. إزالة السلك الداخلي من ضخ القنية. فحص القنية تحت المجهر للتأكد من حوافها مفتوحة ونظيفة على كلا الجانبين. إذا لم يكن كذلك، استخدم إبرة 30 G (OD 0.01') لفتحه.
      2. الغراء كانولا دليل إلى القسم الرأسي من التسريب- cannula، بالقرب من الجزء عازمة، على التداخل 3 ملم (0.118'' ، وذلك باستخدام الغراء كاليفورنيا ومسرع كاليفورنيا.
      3. أدخل الجزء الأفقي من قنية التسريب في أنابيب القسطرة المرنة. يجب أن يكون التداخل على الأقل 2 مم (0.079').
      4. إخراج الغطاء الشفاف لمشرف تدفق المضخة. وهذا سوف تكشف قصيرة الفولاذ المقاوم للصدأ أنبوب قنية (الشكل 2, جهاز #5.1).
        ملاحظة: وسيط التدفق هو جزء من مجموعة المضخات المصغرة التناضحية. وتتكون من غطاء شفاف، وغطاء قصير من القنية، وشفة بيضاء وجزء قنية طويلة. يتم إدخال جزء القنية الطويل في المضخة التناضحية الصغيرة ويتم توصيل جزء القنية القصير بأنابيب القسطرة عبر محول الأنابيب.
      5. تزج أنابيب محول(الشكل 2، #4 الجهاز) في الكحول 70 ٪. انتظر عدة دقائق للسماح للمواد بالانتفاخ.
      6. إرفاق أنبوب محول إلى الجزء cannula قصيرة من تدفق مشرف، حتى يمس شفة بيضاء(الشكل 2،جهاز #5.2). سوف يتقلص محول الأنابيب في الهواء لتشكيل اتصال محكم مختوم.
      7. أدخل أنابيب القسطرة المرنة في الطرف المفتوح لمحول الأنابيب، حتى يلمس الجزء القصير من وسيط التدفق.
      8. عقد طويل cannula جزء (الشكل 2، #5.3 الجهاز) باستخدام موقف كليب والغراء جميع الاتصالات. الاتصالات هي بين محول الأنابيب وشفة بيضاء، ومحول الأنابيب وأنابيب القسطرة مرنة، وأخيرا أنابيب القسطرة مرنة والجزء الأفقي من ضخ قنية. انتظر عدة ساعات حتى يجف الغراء تماما (اعتمادا على نوع الغراء).
        ملاحظة: استخدم لاصق متوافق مع PE لمنع الاتصالات من الارتخاء.
      9. حقن الماء المعقم من خلال جزء القنية الطويل من أنبوب التسريب، وذلك باستخدام حقنة مع إبرة حادة 27 G (0.014').' تحقق من أن المياه تتدفق بسلاسة من خلال ضخ القنية. حقن الهواء من خلال أنبوب التسريب لتصريف المياه.
    5. فتيلة مضخة صغيرة التناضح
      ملاحظة: فتيلة هو إجراء بدء التشغيل التي تمكن المضخة لبدء ضخ مباشرة بعد زرع.
      1. ملء حمام التدفئة بالماء في درجة حرارة الجسم (~ 37 °C). ملء كوب صغير مع المالحة المعقمة ووضعها في حمام التدفئة.
      2. قم بلف المضخة التناضحية المصغرة بمسح الورق، وأصلحها عموديا مع الفتحة المواجهة لأعلى، باستخدام حامل مشبك.
      3. ملء المضخة مع ACSF باستخدام حقنة مع 27 G (0.014'') إبرة حادة. أثناء إزالة الحقنة، استمر في حقن ACSF لمنع الهواء من الدخول. ستظهر فقاعة ACSF في فتحة المضخة.
        ملاحظة: يتيح ضخ ACSF الأولي للفئران التعافي الكامل من الجراحة قبل تحريض التشنجات اللاإرادية. اختياريا، يمكن زرع مضخة مملوءة بيكوكولين أثناء الجراحة الأولية لتجنب استبدال المضخة التالية، ولكنها ليست الأمثل19.
      4. إرفاق حقنة, 27 G (0.014'') إبرة حادة إلى القنية طويلة جزء من أنبوب التسريب وحقن ACSF من خلال ذلك. أثناء إزالة الحقنة ، استمر في حقن ACSF ، لمنع الهواء من الدخول. ستظهر فقاعة ACSF في الجزء الطويل من القنية.
      5. إدراج قنية طويلة جزء في المضخة، فقاعة لفقاعة. يجب أن تظهر فقاعة ACSF في طرف قنية التسريب.
      6. ضع المضخة في الكأس. رئيس المضخة، تعلق على ضخ أنبوب، لمدة 4-6 ساعات على الأقل (في ~ 37 درجة مئوية) السابقة زرع مضخة. تأكد من أن المضخة فقط تتصل بالمحلول الملحي.
    6. جراحة زرع المضخة
      1. تخدير الفئران وفقا لبروتوكول التخدير. انظر الخطوة 1.2.1.
      2. حلق رأس الجرذ وظهره، وذلك باستخدام مقص كهربائي، الخلفي قليلا إلى الكتف.
      3. قم بتنفيذ الخطوات الأساسية في الجراحة، كما هو موضح في الخطوات 1.2.3-1.2.11. يجب أن يكون الشق على طول فروة الرأس حتى العظم القذالي.
      4. تعقيم hemostat كبيرة (~ 14 سم طويلة، 5.512'' في الأوتوكلاف. أدخل الهموستات من خلال الشق واصنع جيبا تحت الجلد في ظهر الجرذ عن طريق فتحه وإغلاقه بالتناوب تحت الجلد من خلال الخط المتوسط.
        ملاحظة: يجب أن يكون الجيب كبيرا بما يكفي لاحتواء المضخة والسماح لها بالتحرك قليلا.
    7. مضخة صغيرة التناضح وزرع أنبوب التسريب
      1. إرفاق حامل القنية إلى الذراع ستيريوتاكسيك ووضعه في الموقف المطلوب لزرع.
      2. إزالة المضخة من حمام التدفئة ووضعها على ظهر الجرذ مغطاة مسح ورقة.
      3. الشريحة القنية دليل أنبوب التسريب على حامل القنية.
      4. عقد المضخة مع hemostat وإدراجه بلطف في جيب تحت الجلد.
      5. زرع مسامير مرساة.
        ملاحظة: زرع مسامير مرساة بعد إدخال المضخة، لتجنب انسداد فتحة الجيب، وقبل زرع القنية لتجنب النزوح القنية.
      6. زرع التسريب- cannula في الهدف والغراء على الجمجمة باستخدام هلام الغراء. انتظر حتى يجف. إحداثيات التعريفي الأمامية tic هي: AP: +1 إلى +1.5، مل: ±2.5، DV: 5.
      7. تطبيق الاسمنت الأسنان على طول ضخ قنية لإصلاحه على الجمجمة. انتظر حتى يجف.
      8. ارفع حامل القنية تاركا القنية المزروعة في مكانها.
      9. زرع جميع الأجهزة الأخرى. تطبيق الاسمنت الأسنان على بقية الجمجمة، وتغطي جميع يزرع. اترك ما يكفي من أنابيب القسطرة المرنة في الجيب تحت الجلد غير مثبتة لتمكين حرية حركة الجرذ.
        ملاحظة: تأكد من عدم وجود مناطق مكشوفة بين الجمجمة وفتح الجيب، وأن القسطرة غير منحنية.
      10. إنهاء الجراحة كما هو مفصل في الخطوات 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. جراحة استبدال المضخة
    ملاحظة: كل نوع مضخة صغيرة التناضح له فترة ضخ التسليم المحددة مسبقا. وبالتالي، ينبغي إجراء جراحة استبدال المضخة قبل تاريخ انتهاء الصلاحية.
    1. تحضير ما قبل الجراحة
      1. كرر الخطوات 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. ملء المضخة مع bicuculline باستخدام حقنة مع 27 G (0.014'') إبرة حادة. أثناء إزالة الحقنة ، استمر في حقن بيكوكلين ، لمنع الهواء من الدخول.
      3. أدخل وسيط التدفق (المرفق بغطاء شفاف) داخل المضخة.
      4. ضع المضخة في الكأس. رئيس المضخة لمدة 4-6 ساعات على الأقل (في ~ 37 درجة مئوية) استبدال المضخة السابقة.
    2. جراحة
      1. تخدير الجرذ (انظر الخطوة 1.2.1.1) وحلق ظهره باستخدام مقص كهربائي.
      2. مسحة ظهر الجرذ مع اليود بوفيدوني ومن ثم مع مسح الكحول لتعقيم المنطقة. التسلل على طول خط شق المطلوب مع حل الليدوكائين 0.5-1٪ (SC).
      3. إجراء شق على الجلد فوق مضخة مزروعة. غسل الجيب مع درجة حرارة الغرفة ACSF والجافة مع منصات الشاش. استخدم الستائر القابلة للتصرف المعبءة تلقائيا لتغطية المنطقة القريبة من الشق.
      4. فصل مضخة ACSF مملوءة من تدفق مشرف باستخدام hemostat وتجاهل.
      5. إزالة مضخة مليئة بيكوكلين من حمام التدفئة. فصل وتجاهل تدفق مشرف من مضخة مليئة bicuculline.
      6. قم بإرفاق المضخة المملوءة بالبيكوكلين برفق بمشرف التدفق المزروع. تجنب لمس الجلد المحيط.
        ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 2.2.2.4-2.2.2.6 بسرعة لمنع فقاعات الهواء. ومع ذلك ، ينبغي إدخال المضخة ببطء لمنع الدخول السريع للبيكوكلين إلى الدماغ.
      7. اضغط على هامشي الشق معا عن كثب، باستخدام ملقط. الغراء خط شق مع لاصقة الأنسجة. كبديل، أغلق الشق باستخدام الغرز.
      8. مسح المنطقة باليود بوفيدوني ووضع اللمسات الأخيرة على الجراحة كما هو مفصل في الخطوات 1.2.12.10-1.2.12.11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقدمت أعلاه بروتوكولات لتوليد النماذج الحادة والمزمنة للتحريض على التشنج اللاتيني في الفئران. تغطي البروتوكولات الإعداد الكامل للجراحة والتجارب(الشكل 1 للنموذج الحاد ، الشكل 2 للنموذج المزمن). تطبيق بيكوكلين في المناطق الحركية للم المخطط يؤدي إلى التعبير عن العرات الحركية الجارية. التشنجات اللاإرادية تظهر على الجانب المقابل للتطبيق وتتميز تقلصات العضلات قصيرة ومتكررة. بعد تطبيق بيكوكلين على الأجزاء الأمامية من المخطط ، يتم التعبير عن العرات عادة في الأمامية للجر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، قمنا بتفصيل بروتوكولات النماذج الحادة والمزمنة للتحريض اللاتكي في فأر يتصرف بحرية. تصف هذه البروتوكولات إعداد جميع المكونات والجراحة والعملية التجريبية التي يمكن تكييفها للتخصيص لتلبية احتياجات بحثية محددة. المبدأ الأساسي الكامن وراء هذه النماذج هو التطبيق المحلي المباشر للبيكوكلين إلى المناطق الحركية للمرحلة ، والتي من المعروف أنها تلعب دورا رئيسيا في الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات اللاإرادية10،11،12. في كلا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا بمنحة من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (297/18). يشكر المؤلفان م. برونفيلد على تأسيس نموذج القوارض الحادة والسيد إسرائيلاشفيلي على تعليقاتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسامير التثبيتالسحابات الدقيقةSMPPS0002# 0 × 1/8 - مسامير الصفائح المعدنية ذات الرأس
Bicuculline methiodideSigma Aldrich14343
مسرع Cyanoacrylate (CA)ZapPT29
Cyanoacrylate (CA) الغراءBSIIC-2000العثور على هذا الغراء أقوى من غيره
أسمنتالأسنان ColteneH00322Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue GelLoctiteUltra Gel Control
HemostatWPI501242أي رقيق بحجم 14 سم تقريبا سيكون كافيا
أنبوب هيبوبو ، جدار رقيق جدا 25Gشركة توريدمكونات HTX-25X
Hypo-tube ، جدار عادي 22Gشركة توريد مكوناتHTX-22R
أنبوب هيبوب، الجدار العادي 30Gشركة توريد المكوناتHTX-30R
آلة مضخة التسريبعصر جديد أنظمة مضخةNE-1000
مضخة تناضحية صغيرةALZET20011.0 & ل في الساعة ، 7 أيام
لاصق متوافق مع PECEYSبلاستيك صعب خاص (مناسب ل PE)
PE-10 أنابيب القسطرةALZETPE-10ID = 0.28 مم ، OD = 0.61 مم
حقنة زجاجية دقيقة ، 10 & micro ؛ لهاميلتون800651701 RNR 10 & micro; l syr (22s / 51/3)
لاصق الأنسجة3M1469SbVetbond
Tubing-adapterCMA3409500
Tygon أنابيب التجويف الصغيرة ، 0.02 بوصة معرف * 0.06 ODشركة توريد المكوناتTND80-020
سلك 0.005 بوصةشركة توريد المكوناتGWX-0050
سلك 0.013 بوصةتوريد المكوناتGWX-0130
تم شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50(2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120(2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Motor TicsBicuculline MicroinjectionStriatal DisinhibitionChronic Infusion ModelAcute Tic ModelCannula ImplantationMini Osmotic PumpCortico Basal GangliaElectrophysiological RecordingsBehavioral Analysis

مقالات ذات صلة