مقالة منهجية

التنميط الخلوي عالي الإنتاجية لمركبات تحلل البروتين المستهدفة باستخدام خطوط خلايا HiBiT CRISPR

DOI:

10.3791/61787

⸱

نوفمبر 9, 2020

 ,  ,  , 
1Promega Corporation

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الكشف الكمي عن الانارة لحركية تحلل البروتين في الخلايا الحية التي تم هندستها باستخدام CRISPR / Cas9 للتعبير عن علامة الكشف عن البروتين الداخلي الخالي من الأجسام المضادة المنصهرة في البروتين المستهدف. يتم تضمين تعليمات مفصلة لحساب والحصول على معلمات التدهور الكمي ، والمعدل ، و Dmax ، و DC50 ، و Dmax50 .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مركبات تحلل البروتين المستهدفة ، بما في ذلك المواد اللاصقة الجزيئية أو التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم ، هي طريقة علاجية جديدة ومثيرة في اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة. تحفز هذه الفئة من المركبات تدهور البروتين عن طريق تقريب البروتين المستهدف وبروتينات آلية الربط E3 اللازمة لانتشار البروتين المستهدف في كل مكان وتحلله في النهاية من خلال مسار ubiquitin-proteasomal (UPP). ومع ذلك ، لا يزال تحديد سمات تحلل البروتين المستهدف بطريقة عالية الإنتاجية يمثل تحديا كبيرا نظرا لتعقيد المسارات الخلوية المطلوبة لتحقيق التحلل. نقدم هنا بروتوكولا واستراتيجية فحص تعتمد على استخدام وضع العلامات الداخلية CRISPR / Cas9 للبروتينات المستهدفة باستخدام علامة HiBiT المكونة من 11 حمضا أمينيا والتي تكملها تقارب عال مع بروتين LgBiT ، لإنتاج بروتين مضيء. يمكن استخدام خطوط الخلايا المستهدفة بتقنية كريسبر ذات العلامات الداخلية لقياس التدهور الناجم عن المركب في أوضاع الخلية الحية الحركية أو نقطة النهاية في الوقت الفعلي أو في النهاية من خلال مراقبة إشارة الإنارة باستخدام قارئ قائم على لوحة الإنارة. نحدد هنا بروتوكولات الفحص الموصى بها للتنسيقات المختلفة ، ونصف أيضا حساب معلمات التدهور الرئيسية للمعدل ، Dmax، DC 50 ، Dmax50 ، بالإضافة إلى تعدد الإرسال مع فحوصات صلاحية الخلية. تتيح هذه الأساليب الاكتشاف السريع وفرز مركبات المرحلة المبكرة مع الحفاظ على التعبير الداخلي وتنظيم البروتينات المستهدفة في الخلفيات الخلوية ذات الصلة ، مما يسمح بالتحسين الفعال للمركبات العلاجية الرصاصية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز تدهور البروتين المستهدف كواحد من أسرع المناطق نموا في اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة ، مدعوما بشكل كبير بالنجاح العلاجي لمركبات الغراء الجزيئي المناعية (على سبيل المثال ، IMiD) لعلاج السرطان ، وبيانات التجارب السريرية المبكرة الواعدة للتحلل البروتيني الذي يستهدف مركبات الوهم1،2،3،4،5،6،7،8 ، 9،10،11،12. تعمل مركبات تحلل البروتين المستهدفة عن طريق تقريب البروتين المستهدف مع بروتينات آلية E3 ligase1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 . يؤدي هذا التجنيد الناجم عن المركب للبروتين المستهدف إلى E3 ligase إلى انتشار البروتين المستهدف وتدهوره عبر مسار البروتيازوم يوبيكويتين (UPP)1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 . تاريخيا ، اعتمدت برامج فحص اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة على المقايسات الكيميائية الحيوية الأولية لتقييم النشاط وترتيب المركبات. ومع ذلك ، فقد شكل هذا تحديا كبيرا لمتحلل البروتين المستهدف الذي يعتمد نشاطه النهائي ، التحلل عبر البروتيازوم ، على سلسلة من الأحداث الخلوية1،2،4،5،6،11،12،13،14،15،16،17 ، 18- إن المسارات المتعددة وتعقيد معقدات البروتين اللازمة لنجاح التحلل المستهدف تتطلب نهج الفحص الخلوي للفحص المبكر وفرز المركبات الأولية. في الوقت الحالي ، فإن توافر التقنيات لرصد تدهور البروتين المستهدف بطريقة عالية الإنتاجية في سياق البيئة الخلوية غير موجود بشدة14. سنقدم هنا بروتوكولات لتقييم نشاط تحلل الخلايا الحية الحركية في الوقت الفعلي أو نقطة النهاية باستخدام خطوط الخلايا المستهدفة HiBiT الموسومة داخليا CRISPR / Cas9 18،19،20 لمراقبة فقدان البروتين المستهدف عن طريق قياس الإنارة بعد العلاج بمركبات التحلل 10،11،18،19.

لتحقيق تدهور ناجح للأهداف العلاجية وتوسيع البروتين القابل للدواء ، ظهرت العديد من الأساليب وأنواع المزيلات التي يمكن أن تستهدف مجموعة واسعة من البروتينات لتدميرها ، بما في ذلك تلك الموضعية في أو في غشاء البلازما ، والليزوزومات ، وأغشية الميتوكوندريا ، والسيتوبلازم ، والنواة21-57. الفئتان الأساسيتان من المركبات التي تمت دراستها على نطاق واسع هما الغراء الجزيئي والبروتين الذي يستهدف السيميرا2،4،5،6،7،12،26. المواد اللاصقة الجزيئية أحادية التكافؤ ، وبالتالي عادة ما تكون أصغر حجما ، وتسهل واجهة تفاعل البروتين الجديدة مع البروتين المستهدف عند الارتباط بمكون E3 ligase2،12،26. هم الأكثر شيوعا المحللات التي ترتبط بمكون Cereblon (CRBN) E3 ligase2،12،26،55،56،57. في الآونة الأخيرة ، على الرغم من الأمثلة الجديدة المثيرة التي تستخدم آلات الربط E3 الأخرى مثل DCAF1558،59،60 وتوظيف CDK / Cyclin إلى DDB145 تظهر إمكانية توسيع هذه الفئة من المركبات. في المقابل ، فإن PROTACs هي جزيئات أكبر ثنائية التكافؤ ، تتكون من رابط ربط الهدف ، وغالبا ما يكون مثبطا ، يتم ربطه عبر رابط كيميائي بمقبض E3 ligase1،3،4،5،7،13. على هذا النحو ، فإن هذه المركبات قادرة على الارتباط المباشر بكل من E3 ligase والبروتين المستهدف1،3،4،5،7،13. وقد تبين أن العديد من البروتينات تتحلل عبر هذه الجزيئات ثنائية التكافؤ ، وتجند مقابض E3 ligase الأكثر استخداما إما CRBN أو Von Hippel Lindau (VHL) 1،3،4،5،7،13. ومع ذلك ، فإن عدد المقابض المتاحة لتجنيد E3 ligase في الوهم الذي يستهدف تصميم التحلل البروتيني يتزايد بسرعة ، مما يوسع قدرات هذه الفئة من المركبات مع إمكانية تحلل الفئات المستهدفة المتنوعة بالإضافة إلى تعزيز خصوصية نوع الخلية أو الأنسجة24،48،61،62 . إلى جانب الحد الأدنى من المتطلبات لإشراك البروتين المستهدف ، حتى مع التقارب الهامشي ، فإن مركبات التحلل تبشر بتوسيع البروتين القابل للتخدير.

يعد توصيف الديناميات الخلوية لفقدان البروتين ، وكذلك استعادة البروتين المحتملة بعد العلاج ، أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفة مركب التحلل وفعاليته. في حين أنه من الممكن دراسة التغيرات في مستوى البروتين الداخلي في الأنظمة الخلوية ذات الصلة باستخدام مقايسات الأجسام المضادة للبقع الغربية أو قياس الطيف الكتلي ، فإن هذه الأساليب يصعب تكييفها مع تنسيقات الفحص عالية الإنتاجية ، أو لديها قدرة محدودة على القياس الكمي ، أو القدرة على قياس التغيرات الحركية في العديد من النقاط الزمنية14. ولمواجهة هذه التحديات، قمنا بتطوير نظام إنارة خلوي قائم على الصفائح لمراقبة التغيرات في مستويات البروتين الذاتية، والذي يستخدم الإدخال الجينومي عبر كريسبر/كاس9 لعلامة الأحماض الأمينية ال 11، HiBiT، إلى مواضع أي أهداف تحلل رئيسية18،19،20. يكمل هذا الببتيد بتقارب عالي مع شريكه في الربط ، LgBiT ، لإنتاج تلألؤ ساطع في وجود ركيزته 18،19،20،63 ، مما يجعل هذه البروتينات الداخلية الموسومة مضيئة في الخلايا أو المحللة18،19،20،63 . تتناسب وحدات الضوء النسبية (RLUs) المقاسة باستخدام أداة مقياس الإنارة طرديا مع مستويات البروتين المستهدفة الموسومة18،19،20،63. مع تطوير ركائز لوسيفيراز المستقرة ، يمكن إجراء قياسات مستوى البروتين الحركي في الوقت الفعلي على مدى 24-48 ساعة من الأطر الزمنية18،53،64. وهذا يسمح بتحديد ملف تعريف تحلل كامل لأي هدف معين عند أي تركيز مركب معين ، بما في ذلك التحليل الكمي لمعدل التحلل الأولي ، والحد الأقصى للتحلل (Dmax) ، والاسترداد بعد المعالجة المركبة18,53. ومع ذلك ، إذا تم فحص مكتبات كبيرة من مركبات التحلل ، يمكن أيضا إجراء تحليل نقطة النهاية بسهولة في شكل 384 بئرا بتركيزات دوائية مختلفة وأوقات محددة.

تمثل البروتوكولات المعروضة في هذه المخطوطة استراتيجيات الفحص الخلوي لمركبات تحلل البروتين المستهدفة ، والتي تنطبق على جميع أنواع مواد التحلل. ومع ذلك ، فإن استخدام خطوط خلايا HiBiT CRISPR جنبا إلى جنب مع هذه البروتوكولات لا يقتصر على تدهور البروتين ، بل هي أدوات عامة لمراقبة أي مستوى بروتين مستهدف داخلي المنشأ يمكن تعديله بعد المعالجة لدراسة تأثير المركبات أو حتى آليات المقاومة20،65،66. الشرط المسبق لطرق الكشف القائمة على الإنارة هذه هو خط الخلايا المستهدفة HiBiT الموسوم داخليا بتقنية CRISPR ، وهو أمر بالغ الأهمية لأنه يتيح الكشف عن الإنارة الحساسة ، مع الحفاظ على التعبير المستهدف الداخلي وتنظيم المروج الأصلي18،19،20. تم إحراز تقدم كبير في استخدام CRISRP / Cas9 لإدخال العلامات الجينومية ، لا سيما في قابلية التوسع 20 ومع الحساسية العالية للكشف ، في أشكال مختلفة بما في ذلك تجمعات CRISPR أو الحيوانات المستنسخة مع إدخالات أليلية متغايرة الزيجوت أو متماثلة الزيجوت18،19،20. من الممكن استخدام التعبير الخارجي ل HiBiT أو اندماجات المراسلين الأخرى في الخلايا بدلا من وضع العلامات الداخلية ، ولكن يجب توخي الحذر الشديد باستخدام أنظمة ذات تعبير مفرط للبروتين14،18. يمكن أن يؤدي ذلك إلى قطع أثرية في فهم الفعالية المركبة الحقيقية وديناميكيات استعادة البروتين14،18 ، بما في ذلك حلقات التغذية الراجعة النسخية المحتملة التي يتم تنشيطها بعد تدهور الهدف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تفويت مركبات المرحلة المبكرة ذات الفعالية المنخفضة ، وتقديم نفسها على أنها سلبيات كاذبة في الفحص. نظرا لأن فقدان البروتين يمكن أن ينتج عن السمية التي يسببها المركب وموت الخلايا ، فإن البروتوكولات الموصوفة هنا تحتوي على مقايسات مضيئة أو فلورية موصى بها للغاية ، ولكنها اختيارية لصلاحية الخلية مقترنة ببروتوكول التحلل. هناك قسمان رئيسيان للبروتوكول ، نقطة النهاية lytic ، والفحص الحركي للخلية الحية. داخل كل قسم من هذه الأقسام ، يتم تضمين خيارات لقياسات صلاحية الخلية متعددة الإرسال في نقطة النهاية أو التنسيقات الحركية. تتطلب مراقبة التغيرات في البروتين الداخلي الموسوم تكملة مع LgBiT في الخلايا. لذلك ، يشير قسم الفحص الحركي إلى بروتوكولات مهمة لإدخال هذا ، والتي يمكن تحقيقها من خلال التعبير العابر أو المستقر وهو ضروري لإجراء قياسات إضاءة الخلايا الحية. تسمح جميع النهج المقدمة هنا بالترتيب السريع للرتب وتقييم نشاط المركبات ، مما يتيح جهود فحص المركبات في المرحلة المبكرة والتعرف بشكل أسرع على عوامل تحلل الرصاص.

تم تصميم هذا البروتوكول لدراسة مركبات التحلل بالتزامن مع خط خلايا HiBiT CRISPR. تم تحديد بروتوكولات توليد إدخالات HiBiT CRISPR للعديد من الأهداف في العديد من المنشورات الحديثة18،19،20.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. دراسات تدهور نقطة النهاية باستخدام البروتينات المستهدفة HiBiT CRISPR في شكل lytic مع تحليل مضان صلاحية الخلية الاختياري

  1. إعداد وطلاء خط الخلايا الملتصقة أو المعلقة في الثدييات
    1. اضبط كثافة الخلية إلى 2.22 × 105 / مل عن طريق التخفيف في وسائط الخلية المناسبة المستخدمة للتمرير ونمو الخلايا.
    2. توزيع الخلايا في ألواح بحد أدنى 3 آبار لكل حالة تجريبية ومراقبة. قم بتوزيع 90 ميكرولتر (20000 خلية) لكل بئر من تعليق الخلية في 96 لوحة بيضاء جيدة. للحصول على تنسيق 384 بئرا ، قم بتوزيع 36 ميكرولتر (8000 خلية) لكل بئر من تعليق الخلية في 384 لوحة بيضاء جيدة.
  2. تحضير وإضافة المركبات
    1. قم بإعداد ألواح مركب اختبار PROTAC أو المتحلل المخفف بشكل متسلسل بتركيز نهائي 1000x في 100٪ DMSO. ثم قم بتخفيفه إلى تركيز نهائي 10x في وسط زراعة الخلية. أضف حجما متساويا من DMSO إلى الوسيط ، لاستخدامه كعنصر تحكم DMSO بدون مركب.
    2. بالنسبة لتنسيق 96 بئرا ، أضف 10 ميكرولتر من 10x من المحاليل المركبة والتحكم إلى 90 ميكرولتر من الخلايا. بالنسبة لتنسيق 384 بئرا ، أضف 4 ميكرولتر من 10x من المحاليل المركبة والتحكم إلى 36 ميكرولتر من الخلايا.
    3. احتضان الألواح في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للفترة الزمنية المطلوبة أو في الظروف المثلى لنموها.
      ملاحظة: نظرا لأن هذا اختبار نقطة نهاية ، فإن اختبار نقاط زمنية متعددة سيتطلب إعداد لوحات تدهور منفصلة لكل نقطة زمنية ، كما هو موضح في الخطوة 1.1.2 أعلاه. أوقات الحضانة للكشف عن التدهور بوساطة المركبة متغيرة للغاية ومن المحتمل أيضا أن تعتمد على تركيز المركب. ستكون النقاط الزمنية الأولية المقترحة هي 6 ساعات و 24 ساعة.
    4. في حالة قياس اكتشاف الإنارة لنقطة النهاية بدون قياس صلاحية الخلية الاختياري ، فانتقل مباشرة إلى الخطوة 1.3 أدناه. في حالة إجراء تعدد الإرسال مع قياس صلاحية الخلية ، انتقل إلى القسم التالي 1.4 أدناه.
  3. القياس الليتيكي للخلايا
    1. مباشرة قبل قياسات HiBiT lytic ، قم بإعداد كاشف الكشف عن lytic 2x عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الركيزة lytic و 10 μL من بروتين LgBiT لكل 1 مل من المخزن المؤقت lytic. قم بإعداد كاشف كشف 2x كاف لعدد الآبار المراد فحصها ، بما في ذلك الحجم الإضافي لحساب خطأ السحب (أي عدد الآبار + 10٪).
    2. أضف كاشف الكشف عن التحلل المحضر إلى الخلايا. بالنسبة لتنسيق 96 بئرا ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن lytic 2x إلى كل بئر يحتوي على 100 ميكرولتر من الخلايا. بالنسبة لتنسيق 384 بئرا ، أضف 40 ميكرولتر من كاشف الكشف عن lytic 2x إلى كل بئر يحتوي على 40 ميكرولتر من الخلايا. امزج الطبق على خلاط دوامة ميكروبلات لمدة 10-20 دقيقة عند 350 دورة في الدقيقة.
    3. قم بقياس التلألؤ على مقياس لمعان قادر على قراءة التلألؤ في لوحة 96 أو 384 بئرا.
  4. تعدد إرسال صلاحية الخلية الاختياري
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة CellTiter-Fluor (CTF) المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. قبل 30-40 دقيقة من قياس نقطة النهاية المطلوب ، قم بإعداد محلول كاشف الكشف عن جدوى الخلية 6x عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الركيزة إلى 2 مل من المخزن المؤقت للفحص. قم بإعداد كاشف 6x كاف لكل بئر ليتم فحصه ، بما في ذلك الحجم الإضافي لخطأ السحب (أي عدد الآبار + 10٪).
    2. أضف الكاشف المحضر إلى الآبار. بالنسبة لتنسيق 96 بئرا ، أضف 20 ميكرولتر من كاشف 6x إلى كل بئر يحتوي بالفعل على حجم 100 ميكرولتر. بالنسبة لتنسيق 384 بئرا ، أضف 8 ميكرولتر من كاشف 6x إلى كل بئر يحتوي على 40 ميكرولتر من الخلايا. امزج لفترة وجيزة على خلاط دوامة ميكروبلات ، ثم احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    3. عند نقطة النهاية المرغوبة للقياس (أي 6 أو 24 ساعة بعد المعالجة ، الخطوة 1.2.3) ، قم بقياس التألق على أداة قادرة على قراءة التألق (380-400 نانومترEx / 505nmEm) بتنسيق بئر 96 أو 384.
    4. قم بإعداد كاشف الكشف عن الحالة 2x عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الركيزة الليتية و 10 ميكرولتر من بروتين LgBiT لكل 1 مل من المخزن المؤقت لليتيك. قم بإعداد كاشف كشف 2x كاف لعدد الآبار المراد فحصها ، بما في ذلك الحجم الإضافي لحساب خطأ السحب (على سبيل المثال ، عدد الآبار + 10٪).
    5. أضف كاشف الكشف عن التحلل المحضر إلى الآبار. بالنسبة لتنسيق 96 بئرا ، أضف 120 ميكرولتر من كاشف الكشف عن lytic 2x إلى كل بئر يحتوي بالفعل على حجم 120 ميكرولتر. بالنسبة لتنسيق 384 بئرا ، أضف 48 ميكرولتر من كاشف الكشف عن التحلل 2x إلى كل بئر يحتوي بالفعل على حجم 48 ميكرولتر. امزج الطبق على خلاط دوامة ميكروبلات لمدة 10-20 دقيقة.
    6. قم بقياس التلألؤ على مقياس الإنارة القادر على قراءة التلألؤ في ألواح بئر 96 أو 384.
  5. القياس الكمي للتدهور وبقاء الخلية
    1. متوسط وحدات الضوء النسبية (RLU) من عنصر تحكم DMSO عند النقطة الزمنية المقاسة. استخدم هذه القيمة كمستوى بروتين أساسي للهدف لحساب التدهور الجزئي عن طريق تطبيع جميع العلاجات الأخرى التي تم اختبارها في نفس النقطة الزمنية لهذه القيمة. على سبيل المثال ، إذا كان متوسط RLU لآبار التحكم DMSO عند 6 ساعات هو 10,000 ، وكان RLU لمعالجة مركبة معينة عند 6 ساعات 5,000 ، حساب التحلل الجزئي على أنه 5,000 ÷ 10,000 = 0.5 (المعادلة 1).
      المعادلة 1: معادلة RLU الكسرية لتحليل بيانات PROTAC ؛ رسم تخطيطي لحساب التلألؤ النسبي.
    2. تحديد النسبة المئوية للتدهور من Fractional RLU:
      المعادلة 2: معادلة حساب النسبة المئوية للتحلل باستخدام RLU الكسري في التحليل الكيميائي الحيوي.
    3. ارسم RLU الجزئي أو ٪ التدهور في نقاط زمنية محددة لترتيب نشاط المركبات.
    4. اختياريا ، قم بتحليل بيانات وحدة الفلور النسبية (RFU) لقياس مقايسة صلاحية الخلية من خلال مقارنة القيم من جميع العلاجات بعنصر تحكم DMSO. إذا لوحظ انخفاض كبير في RFU لأي علاج يتعلق بتحكم DMSO ، فيمكن تطبيع بيانات التدهور بشكل إضافي مع بيانات فحص صلاحية الخلية لتحديد التغيرات في مستوى البروتين بالنسبة للخسائر في صلاحية الخلية.

2. التدهور الحركي في الوقت الحقيقي للبروتينات المستهدفة HiBiT CRISPR ومقايسة التلألؤ الاختيارية لبقاء الخلية

ملاحظة: تتطلب القدرة على إجراء الفحص الحركي والتدهور التعبير المشترك لبروتين LgBiT في الخلية ، والذي تم وصفه سابقا18،19،63. يمكن تحقيق ذلك عن طريق النقل العابر لمتجه LgBiT ، أو استخدام BacMam LgBiT ، أو عن طريق إجراء إدخال HiBiT CRISPR في خط خلية مستقر LgBiT.

  1. طلاء خطوط الخلايا الملتصقة.
    1. قم بإزالة الوسط من قارورة الخلية عن طريق الشفط ، واغسل الخلايا باستخدام DPBS ، وافصل الخلايا التي تحتوي على 0.05٪ من التربسين-EDTA ، واسمح للخلايا بالانفصال عن قاع القارورة. بالنسبة لخطوط الخلايا المعلقة ، انتقل إلى القسم 2.2.
    2. تحييد التربسين باستخدام وسط زراعة الخلايا المحتوي على المصل ، واخلطه لجمع الخلايا وإعادة تعليقها ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي.
    3. قم بتدوير الخلايا لأسفل بمعدل 125 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من وسط زراعة الخلية وأعد تعليقه في حجم متساو من وسط زراعة الخلايا الطازجة.
    4. خلايا الصفيحة في ألواح الفحص مع الحد الأدنى من الآبار الثلاثية لكل حالة تجريبية ومراقبة. بالنسبة لعدد تنسيق 96 بئرا لتقدير كثافة الخلية ، اضبط الكثافة على 2 × 105 خلايا / مل في وسط الفحص ووزع 100 ميكرولتر (20000 خلية) لكل بئر في لوحة 96 بئرا. بالنسبة لعدد تنسيقات 384 بئرا لتقدير كثافة الخلية ، اضبط الكثافة على 4.44 × 105 خلايا / مل في وسط الفحص ووزع 18 ميكرولتر (8000 خلية) لكل بئر.
    5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها أو في الظروف المثلى لنموها.
  2. طلاء الخلايا المعلقة
    1. اضبط كثافة الخلية على 2.22 × 105 خلايا / مل في وسط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون مكمل ب 10٪ FBS و 1x Endurazine (تخفيف 1: 100 من كاشف المخزون).
    2. خلايا الصفيحة في ألواح الفحص بحد أدنى 3 آبار لكل حالة تجريبية ومراقبة. لتنسيق 96 بئر ، قم بتوزيع 90 ميكرولتر (20000 خلية) لكل بئر. بالنسبة لتنسيق 384 بئرا ، قم بتوزيع 36 ميكرولتر (8000 خلية) لكل بئر.
      ملاحظة: بالنسبة لخطوط الخلايا المعلقة التي تحتوي على إشارة منخفضة إلى تلألؤ الخلفية (S: B) ، على سبيل المثال ، عند العمل مع تجمعات كريسبر بدلا من الحيوانات المستنسخة ، من الممكن زيادة التلألؤ عن طريق زيادة عدد الخلايا المطلية ، حتى 100000 خلية / بئر في شكل 96 بئرا ، أو 40000 خلية / بئر بتنسيق 384 بئرا.
  3. مقايسات التدهور الحركي باستخدام خلايا HiBiT CRISPR التي تعبر عن LgBiT
    1. بالنسبة لخلايا التعليق التي تحتوي بالفعل على Endurazine ، والتي تم تضمينها في خطوة الطلاء في 2.2 ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.3.3. لخطوط الخلايا الملتصقة إعداد حل نانو غلو إندورازين. للحصول على تنسيق 96 بئرا ، قم بإعداد محلول 1x من Endurazine عن طريق تخفيف كاشف المخزون 1: 100 إلى وسيط مستقل عن CO2 مكمل بنسبة 10٪ FBS. للحصول على تنسيق 384 بئرا ، قم بإعداد محلول 2x من Endurazine عن طريق تخفيف كاشف المخزون 1:50 إلى وسيط مستقل عن CO2 مكمل بنسبة 10٪ FBS.
    2. أضف محلول Endurazine إلى كل بئر من الخلايا الملتصقة. للحصول على 96 بئرا شكل نضح المتوسطة وإضافة 90 ميكرولتر من محلول 1x Endurazine. لتنسيق 384 بئر ، أضف 18 ميكرولتر من محلول إندورازين 2x إلى 18 ميكرولتر من الخلايا. لا تستنشق الوسط حيث يتم إجراء فحص التحلل في خليط 50:50 من وسط الاستزراع ووسط CO2 المستقل بتنسيق 384 بئر.
    3. احتضان لوحات الخلايا المعلقة أو الملتصقة التي تحتوي على Endurazine لمدة 2.5 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح للتألق بالتوازن.
    4. قم بإعداد تركيز 10x من معايرة PROTAC الاختبارية في وسط مستقل عن CO2 وأضف 10 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة 96 بئر أو 4 ميكرولتر للوحة 384 بئر. بالنسبة للمركبات ذات الفعالية غير المعروفة ، يوصى بتركيز نهائي من 1-10 ميكرومتر عند أعلى نقطة كنقطة انطلاق.
    5. جمع القياسات الحركية للتلألؤ في مقياس الإنارة المتوازنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 0-48 ساعة. يمكن تخصيص الزيادات الزمنية للقياس لكل تجربة ، ولكن التجربة الأولية الموصى بها ستكون قياسات التلألؤ كل 5-15 دقيقة لمدة 24 ساعة أو مقدار الوقت المطلوب.
  4. تحليل مضاعف الإرسال الاختياري لصلاحية الخلية بعد القياس الحركي النهائي
    ملاحظة: يتم إجراء هذا الفحص باستخدام مجموعة CellTiter-Glo (CTG) المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. موازنة كاشف CTG إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. بعد قياس التدهور في آخر نقطة زمنية للتحليل الحركي ، أضف 100 ميكرولتر (لوحة 96 بئر) أو 40 ميكرولتر (لوحة 384 بئر) من الكاشف لكل بئر من اللوحة ، واخلطها على شاكر لوحة عند 500-700 دورة في الدقيقة (لوحة 96 بئر) أو خلاط دوامة ميكروبورد (لوحة بئر 384) لمدة 5 دقائق.
    3. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بتحلل الخلية وتبريد إشارة HiBiT.
    4. قم بقياس التلألؤ الكلي على مقياس الإنارة باتباع توصية الشركة المصنعة.
  5. القياس الكمي لملامح التدهور الحركي
    1. باستخدام قياسات التلألؤ الحركي التي تم جمعها ، قم بتطبيع RLUs الخام لكل تركيز PROTAC إلى حالة DMSO المتوسطة المتماثلة في كل نقطة زمنية لحساب التغيرات في تركيز الفوريمازين الحر بمرور الوقت. احسب RLU الكسري باستخدام المعادلة 1.
      المعادلة 1: معادلة RLU الكسرية لتحليل بيانات PROTAC ؛ رسم تخطيطي لحساب التلألؤ النسبي.
    2. من منحنيات التدهور ، قم بتركيب نموذج اضمحلال أسي أحادي المكون باستخدام المعادلة 2 لجزء التدهور الأولي لكل منحنى إلى النقطة التي تصل فيها البيانات إلى هضبة.
      ملاحظة: قد يكون من المفيد استبعاد نقاط البيانات القليلة الأولى من الملاءمة حيث قد يكون هناك تأخر قصير قبل ملاحظة التدهور.
      المعادلة 2: صيغة الاضمحلال الأسي ، y = (y₀-Plateau) e ^ (-λt) + الهضبة ، رسم تخطيطي رياضي.
    3. من المعادلة 2 ، حدد المعلمة ƛ ، والتي تمثل ثابت معدل التحلل والهضبة ، والتي تمثل أقل كمية متبقية من البروتين.
    4. احسب Dmax ، وهو الحد الأقصى للكمية الكسرية للبروتين المتحلل ويتم حسابه على أنه 1-Plateau.
    5. ارسم Dmax لكل تركيز من PROTAC لتحديد منحنى قوة التدهور المستقل عن الوقت.
    6. حدد قيمة Dmax50 للمؤامرة في 2.3.5 لتحليل فعالية المركبات.
      ملاحظة: لتحديد DC50 في نقطة زمنية محددة ، ارسم النسبة المئوية المحسوبة للتدهور لكل تركيز في الوقت المختار. يمكن تحديد ذلك على أنه DC 50 t = 4 h أو DC50 t = 12 h.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات تحليل التحلل الليفي لنقطة نهاية التركيز الفردي ، العديد من البروتينات المستهدفة CDK ؛ تم تمييز CDK2 و CDK4 و CDK7 و CDK10 داخليا باستخدام HiBiT في نهايتها C في خلايا HEK293 وعولجت بتركيز 1 ميكرومتر من PROTAC القائم على عموم كيناز Cereblon ، TL12-18654 (الشكل 1 أ). تم قياس مستوى بروتين CDK في نقاط زمنية مختلفة وتم تحديد RLU الكسري بالنسبة إلى عنصر تحكم DMSO (الشكل 1 أ). أظهر كل بروتين CDK درجات مختلفة من التحلل استجابة للمعالجة المركبة والنقاط الزمنية المختلفة (الشكل 1 أ). لفهم كيفية مقارنة بروتينات CDK مع بعضها البعض مباشرة من حيث فقدان البروتين ، تم حساب RLUs الكسرية في الشكل 1A على أنها إجمالي النسبة المئوية للتحلل وتم رسمها لكل نقطة زمنية في الشكل 1B. هذا يدل على أنه حتى في نقاط الوقت المبكرة ، 2 أو 4 ساعات ، يظهر بعض أفراد عائلة CDK مستويات عالية من التدهور الذي يستمر في الاتجاه التصاعدي بمرور الوقت (الشكل 1 ب).

لإثبات تحليل التدهور الحركي ، كل من بروتينات أفراد عائلة BET ؛ تم تمييز BRD2 و BRD3 و BRD4 داخليا باستخدام HiBiT في نهايتها N في خلايا HEK293 التي تعبر بثبات عن بروتين LgBiT18. ثم عولجت هذه بثلاثة تركيزات مختلفة من بروتاك عموم البيت. dBET650 القائم على Cereblon (الشكل 2A) و ARV-77141 المستند إلى VHL (الشكل 2B). تم جمع القياسات الحركية على مدى فترة 24 ساعة ، ومن الملامح في كل تركيز ، فإن الاختلافات في استجابة أفراد عائلة BET واضحة بسهولة. وقد لوحظت سابقا قدرة BRD2 على بدء استجابة أسرع للتعافي بعد المعالجة المركبة للتحلل (الشكل 2أ ، ب) مع بروتاك عموم BET الأخرى ومن المحتمل أن يكون ذلك بسبب استجابة ردود الفعل النسخية المنافسة لعملية التدهور18.

يمكن إجراء كل من نقطة النهاية والتحليل الحركي مع علاجات الاستجابة الكاملة للجرعة المركبة. يظهر في الشكل 3 ملامح تدهور استجابة الجرعة الحركية لعلاج خلايا Ikaros / IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat التي تعبر بثبات عن بروتين LgBiT بأربعة مركبات غراء جزيئية مختلفة2،26،55،57 ؛ ليناليدوميد (الشكل 3 أ) ، إيبردوميد (CC-220) (الشكل 3 ب) ، الثاليدومايد (الشكل 3 ج) ، وبوماليدوميد (الشكل 3 د). تظهر هذه المحللات اختلافات كبيرة في استجابة التحلل بين المركبات وكذلك عبر سلسلة التركيز (الشكل 3).

لتقييم التحلل كميا وترتيب المركبات في الشكل 3 ، تم استخدام ملفات تعريف الاستجابة للجرعة لحساب معلمات التحلل الرئيسية بما في ذلك معدل التحلل (الشكل 4 أ) ، وقيم Dmax (الشكل 4B) ، و Dmax50 (الشكل 4B). تظهر هذه التحليلات أن إيبردوميد (CC-220) وبوماليدوميد لهما معدلات تحلل أولية سريعة متشابهة جدا (الشكل 4 أ) ، ومع ذلك فإن إيبردوميد (CC-220) لديه أعلى فعالية كما شوهد سابقا في الدراسات المتعامدة55,57 (الشكل 4 ب). نظرا لأن Iberdomide يظهر مثل هذه الفعالية العالية ، وتظهر جميع التركيزات التي تم اختبارها تدهورا أكبر من 50٪ ، فإن قيمة Dmax50 التي تم الحصول عليها ل Iberdomide تمثل تقديرا يعتمد على القيود في ملاءمة البيانات بدقة. من الرسوم البيانية في الشكل 3C و D والشكل 4B ، لا يؤدي lenalidomide أو thalidomide إلى تدهور هدف Ikaros / IKZF1 حتى يكتمل عند أعلى تركيزات تم اختبارها. نظرا للتحلل القليل جدا الذي لوحظ مع الثاليدومايد ، لا يمكن أن تكون آثار التحلل مناسبة بدقة لنموذج الاضمحلال الأسي ، وبالتالي ، لم يتم تحديد معدل التحلل لهذا العلاج. بالنسبة لأقوى عامل تحلل ، إيبردوميد (CC-220)55,57 (الشكل 4 ب). لم تظهر مقايسات تعدد الإرسال لصلاحية الخلية أي خسارة في صلاحية الخلية للتركيزات التي تم اختبارها (الشكل 4C).

حركية تدهور CDK ، الرسم البياني ل RLU الجزئي مقابل الوقت والمخطط الشريطي للنسبة المئوية للتدهور ، مقايسة HiBiT.
الشكل 1: تدهور نقطة النهاية CDK والسمية مع عموم كيناز PROTAC ، TL12-18654. (أ) حدد لوحة من البروتينات المستهدفة CDK الذاتية المنشأ المنصهرة مع HiBiT على المحطة C عبر CRISPR / Cas9 وتم تقييمها للتحلل مع 1 ميكرومتر TL12-186 PROTAC 54 عند 2 ساعة و 4 ساعات و 8 ساعات و24 ساعة. يتم تمثيل القيم على أنها RLU كسري بالنسبة إلى عنصر تحكم DMSO الذي تم قياسه في كل نقطة زمنية. تمثل أشرطة الخطأ SD لمتوسط 3 نسخ مكررة تقنية. (ب) النسبة المئوية لتدهور لوحة البروتينات المستهدفة CDK المحسوبة من (A) تمثل مقدار تدهور كل فرد من أفراد الأسرة لوحظ عند النقاط الزمنية 2 و 4 و 8 و 24 ساعة. تمثل أشرطة الخطأ SD لمتوسط 3 نسخ مكررة تقنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملامح تدهور الأسرة BET ؛ الرسم البياني للجرعة والاستجابة. HiBiT-BRD2 / BRD3 / BRD4 ؛ مقارنة مركبة.
الشكل 2: تنميط انتقائية التدهور الحركي لأفراد عائلة BET باستخدام محللات BET ، dBET650 و ARV-77141. ملامح التحلل الحركي لأفراد عائلة BET الذاتية ، BRD2 و BRD3 و BRD4 ، الموسومة ب HiBiT على المحطة N عبر CRISPR / Cas9 مع معالجة تركيزات مفردة من 1 نانومتر (يسار) أو 10 نانومتر (وسط) أو 100 نانومتر (يمين) dBET650 (A) أو ARV-77141 (B) PROTACs. يتم تمثيل القيم على أنها RLU كسري محسوب من عنصر تحكم DMSO في كل نقطة زمنية حركية. تمثل أشرطة الخطأ SD لمتوسط 4 نسخ مكررة تقنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط استجابة جرعة Ikaros IKZF1-HiBiT; ليناليدوميد ، إيبردوميد ، ثاليدوميد ، بوماليدوميد.
الشكل 3: ملامح استجابة جرعة التحلل الحركي للخلايا الحية ل Ikaros / IKZF1-HiBiT مع لوحة الغراء الجزيئي2،26،55،57. تم تصميم خلايا Jurkat التي تعبر بثبات عن بروتين LgBiT باستخدام CRISPR / Cas9 لوضع علامة على النهاية C ل Ikaros / IKZF1 باستخدام ببتيد HiBiT. تمت معالجة الخلايا بسلسلة تركيز استجابة جرعة 8 نقاط بما في ذلك DMSO لأربعة مركبات غراء جزيئية مختلفة2،26،55،57: (أ) ليناليدوميد ، (ب) إيبردوميد (CC-220) ، (ج) ثاليدومايد ، أو (د) بوماليدوميد. تم قياس التلألؤ كل 5 دقائق لما مجموعه 19.5 ساعة. تم تحويل بيانات وحدة الضوء النسبي (RLU) من (A-D) إلى RLU كسري كما هو موضح في الخطوة 2.4.1 وتم رسمها بيانيا كدالة للوقت. تمثل أشرطة الخطأ SD من 3 نسخ مكررة تقنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معدلات تحلل إيكاروس ودراسة صلاحية الخلية: الرسوم البيانية للتركيز والاستجابة ، فعالية الدواء المقارنة.
الشكل 4: حساب معدل التحلل و Dmax50 ل Ikaros / IKZF1-HiBiT ، وفحوصات صحة الخلايا المتعددة. تم استخدام بيانات التدهور الحركي من الشكل 3 لحساب معلمات التحلل الكمي. (أ) يتم رسم معدلات التحلل و (ب) القيم القصوى للتحلل (Dmax) عند كل تركيز دوائي لمركبات الغراء الجزيئي المشار إليها2،26،55،57. (ب) تم حساب قيم Dmax50 لكل مركب باستخدام نموذج الاستجابة للجرعة مع ميل هيل مقيد يبلغ 1 ، والذي يمكن استخدامه لترتيب مركبات التحلل لهدف ما. (ج) تم إجراء فحوصات صلاحية الخلية باستخدام إيبردوميد (CC-220) استجابة جرعة تحلل 55,57 من الشكل 3B كقياس نقطة النهاية عند الانتهاء من قياسات التدهور الحركي. تمثل أشرطة الخطأ SD من 3 نسخ مكررة تقنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا طريقتين لفحص نشاط مركب التحلل إما في شكل lytic نقطة النهاية أو الوضع الحركي للخلية الحية. تعتمد هذه الأساليب على نفس مبادئ قياس الإنارة ولكنها توفر مستويات مختلفة من التفاصيل والفهم. من المحتمل أن يعتمد اختيار أي من النهجين على أهداف الفحص وحجم المكتبة المركبة. بالنسبة لمجموعات الفحص المركبة الكبيرة أو الشاشات الأولية لمراقبة أي تدهور يمكن اكتشافه ، يوفر الفحص lytic لنقطة النهاية توافقا حساسا وفعالا عالي الإنتاجية حيث يمكن أن تكون مناهج نقطة النهاية الأخرى ، مثل اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي إما غير عملية أو يصعب تكييفها14. يمكن إجراء نقطة انطلاق لهذه الشاشات بعدد محدود من التركيزات والنقاط الزمنية. تتراوح التركيزات الأولية الموصى بها للاختبار بين 100 نانومتر و 10 ميكرومتر ، لحساب المتحلل الأولي ذي الفعالية المنخفضة ، أو ضعف النفاذية ، أو في بعض الحالات مع مركبات قوية للغاية ، وجود تأثير خطاف. ويوصى كذلك باختبار نقطتين زمنيتين مختلفتين على الأقل لتحديد التدهور المبكر في الساعة 4-6 والتدهور الكامن أو المستمر في الساعة 18-24. يتم ملاحظة المركبات التي تظهر فعالية تحلل عالية وآلية على الهدف بسهولة في غضون 4-6 ساعات ، في حين أن التدهور أو فقدان البروتين الواضح الذي لوحظ فقط في نقاط زمنية لاحقة يمكن أن يكون بسبب مجموعة متنوعة من الآليات. يوصى بشدة بمراقبة صلاحية الخلية في كل من النقاط الزمنية المبكرة والمتأخرة ، بحيث يمكن فصل فقدان البروتين عن الخسارة بسبب موت الخلايا. على غرار أي نوع من مقايسة الإنارة أو الفلورسنت ، هناك احتمال أن تتداخل المركبات داخل المكتبات أو تمنع الإشارة ، وبالتالي ، فإن تجارب المتابعة المتعامدة مع مركبات الرصاص باستخدام اندماجات غير ذات صلة أو طرق بديلة لمراقبة مستوى البروتين ستكون مهمة لتقييم أن فقدان RLU في هذه المقايسات يرتبط مباشرة بتدهور البروتين المستهدف.

تعتمد القدرة على الفحص بتنسيق حركي للخلية الحية على مدى فترات زمنية طويلة بشكل كبير على إشارة الفحص إلى الخلفية (S: B). تشمل العوامل التي تساهم في S: B مستوى التعبير عن البروتين المستهدف نفسه ، والذي يمكن أن يمتد لعدة أوامر من حيث الحجم ، كفاءة تعبير LgBiT في خط الخلية المختار لإدخال الببتيد ، وتوافر الهدف الموسوم للتكامل في مجمعاته المحلية المختلفة. لقد أنشأنا مطلبا عاما للقطع يتكون من S: B من 15 لقياس التدهور بنجاح في الوضع الحركي إما باستخدام Endurazine أو Vivazine. يتم تحديد S: B عن طريق قياس إشارة خط الأساس للخلايا المحررة HiBiT التي تعبر عن LgBiT بالنسبة للخلايا الأبوية غير المحررة التي تعبر عن LgBiT وحدها في وجود ركائز الخلايا الحية Endurazine أو Vivazine. سينتج Vivazine إشارة مضيئة أعلى ولكنه سوف يتحلل بشكل أسرع من Endurazine وقد يحد من اكتساب الإشارة إلى 24 ساعة أو أقل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعتمد S: B أيضا بشكل كبير على ما إذا كانت مجمعات CRISPR أو الحيوانات المستنسخة مستخدمة. بالنسبة للأهداف في خطوط الخلايا الأكثر قابلية وذات كفاءة عالية لهندسة CRISPR / Cas9 ، قد يكون لدى مجموعة CRISPR غير المتجانسة من الخلايا المحررة S: B كافية للتحليل الحركي. بالنسبة للأهداف في خطوط الخلايا الأكثر صعوبة حيث يؤدي التكامل الجينومي الأقل كفاءة عبر كريسبر إلى تجمعات ذات S: B منخفضة ، قد يكون عزل استنساخ CRISPR ضروريا لإثراء المجموعات المحررة وتحقيق S: B مرتفع بما فيه الكفاية للتحليل الحركي. بالنسبة لأي من هذه السيناريوهات ، إذا كان S: B أقل من 15 مع ركائز Endurazine أو Vivazine ، ينصح بفحص lytic لنقطة النهاية.

من أجل فهم وتوصيف أفضل للمركبات ، بما في ذلك تحديد ملف تعريف التدهور مع المعلمات الكمية ، فإن التحليل الحركي في الوقت الفعلي في الخلايا الحية هو نهج الفحص الموصى به14,18. مثل تحليل نقطة النهاية الذي تمت مناقشته أعلاه ، يمكن إجراء الفحص الحركي الأولي بعدد محدود من التركيزات في نطاق 100nM-10μM بطريقة عالية الإنتاجية. في شكل 384 بئرا ، يمكن بسهولة فحص أكثر من 100 مركب في ثلاث نسخ بتركيز واحد على لوحة واحدة. ستوفر ملامح التدهور الناتجة إرشادات ليس فقط حول مدى التدهور الملاحظ ، ولكن معدل التدهور ، ومدة التدهور ، والاسترداد المحتمل للبروتين14,18 (الشكل 2 والشكل 3). كما أن أشكال ملف تعريف التدهور تسفر عن معلومات قيمة. غالبا ما تظهر أجهزة التحلل المحددة والقوية فقدانا سريعا أوليا للبروتين المستهدف إلى هضبة في غضون ساعات18,53 ، في حين أن الآليات الأخرى مثل ردود الفعل النسخية أو السمية المركبة تؤدي عادة إلى فقدان خطي أكثر للبروتين بمرور الوقت. يتم تفويت هذه التفاصيل والفروق الدقيقة مع التحليل الليتيكي لنقطة النهاية ، ومع التحليل في الوقت الفعلي على مدار 24-48 ساعة ، لا يتعين على المرء التنبؤ بالوقت اللازم لالتقاط Dmax الحقيقي ضمن مجموعات من المركبات الجديدة أو غير المعروفة.

تسمح الحركية في الوقت الفعلي أيضا بفحص الاستجابة الفعالة للجرعة لفهم فعالية المركب بشكل أفضل ، وكيف يؤثر تركيز المركب على معدل التدهور الأولي ، ويوفر إمكانيات لتصنيف المركبات بناء على أكثر من معلمة واحدة. تتضمن القياسات الكلاسيكية لفعالية التحلل حسابات DC50 في نقطة زمنية محددة بناء على الحد الأقصى للتدهور الظاهر. في المقابل ، يتضمن نهجنا الحركي لتقييم الفاعلية الحد الأقصى للتحلل الحقيقي عند كل تركيز بغض النظر عن وقت حدوثه في الوقت18. نسمي هذا القياس لفعالية التحلل الحركي ، Dmax5018. التحليل بهذه الطريقة يفسر المركبات التي قد تبدأ التحلل بشكل أبطأ عند تركيزات أقل وبالتالي تستغرق وقتا أطول بعد المعالجة للوصول إلى Dmax. يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص لتصنيف المركبات على كل من معدل التحلل و Dmax. بالنسبة لأقوى المحللات ، سيؤدي ذلك إلى زيادة التمييز بين المتحلل البطيء ، ولكن القوي من تلك التي تكون سريعة وقوية. معا ، يعد كل من الفحص الحركي للخلايا الحية والخلايا الحية باستخدام خطوط خلايا HiBiT CRISPR طرقا قوية تسفر عن صورة أكثر شمولا لتدهور البروتين المستهدف ، والوظيفة المركبة ، وتمكين عملية الفحص من تقييم النشاط الأولي إلى تحسين المواد الكيميائية النهائية من خلال تعزيز معلمات التدهور الرئيسية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شركة Promega هي المالك التجاري عن طريق التنازل عن براءات اختراع تقنيات وتطبيقات HiBiT و NanoLuc.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.M.R ، S.D.M ، M.U. و D.L.D جميعهم موظفون في شركة Promega Corporation

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف CellTiter-Glo 2.0PromegaG9241قابلية الخلية للبقاء مقايسة مضيئة
CellTiter-Fluor CellPromegaG6080قابلية الخلية مقايسة الفلورسنت
CO2< / sub> الوسط المستقلThermoFisher18045-088ثقافة الخلية
DMSOSigma AldrichD2650للتخفيف والتحكم في المركب
DPBSGibco14190زراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنينيSeradigm89510-194ثقافة الخلايا
HEK293 خط الخلية المستقر LgBiTPromegaN2672للتكميل مع HiBiT لتوليد
خط خلية الثدييات HiBiT CRISPRPromegahttps://www.promega.com/crispr-tpd< / u>
حل Hygromycin BGibco10-687-010ثقافة الخلية
LgBiT BacMamPromegaCS1956C01للتكميل مع HiBiT لتوليد
ناقلات تعبير LgBiTPromegaN2681للتكملة مع HiBiT لتوليد
قارئلوحة مقياس الإضاءةLuminomenter قادر على قياس اللمعان والمضان (على سبيل المثال نظام اكتشاف GloMax ، Promega GM3000)
ركيزة الخلايا الحية NanoGlo Endurazine كاشفHiBiT
NanoGlo Vivazine ركيزة الخليةPromegaN2580كاشف HiBiT الحركي
NanoGlo HiBiT نظام الكشف عن الحالةPromegaN3030Enpoint كاشف
HiBiTOpti-MEM وسط مصل مختزل ، بدون فينول أحمر (ThermoFisher)ThermoFisher11058-021زراعة الخلايا
ألواح زراعة الأنسجة ، أبيض ، 96 لوحة بئرCostar3917زراعة الخلايا
ألواح زراعة الأنسجة ، أبيض ، 384 لوحةبئر Corning3570ثقافة الخلايا
Trypsin / EDTAGibco25300ثقافة الخلايا
Vivability فحص الحركي الحية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
  2. Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
  3. Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
  4. Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
  5. Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
  6. Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
  7. Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
  8. Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
  9. Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
  10. Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
  11. Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
  12. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  13. Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
  14. Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
  16. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
  17. Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
  18. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  19. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  20. Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
  21. Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
  22. Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
  23. Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
  24. Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
  25. Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
  26. Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
  27. Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
  28. DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
  29. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  30. Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
  31. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  32. Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
  33. Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
  34. Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
  35. Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
  36. Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  37. Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
  38. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  39. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
  40. Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
  41. Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
  42. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  43. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  44. Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
  45. Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
  46. Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
  47. Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
  48. Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
  49. Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  50. Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
  51. Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
  52. Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  53. Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
  54. Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
  55. Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
  56. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  57. Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
  58. Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
  59. Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
  60. Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
  61. Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
  62. Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
  63. Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  64. Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
  65. Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
  66. Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HiBiT CRISPR Cell LinesTargeted Protein DegradationPROTAC CompoundsMolecular GluesEndogenous TaggingLuminescent DetectionKinetic Degradation AnalysisDose Response ProfilingCell Viability MultiplexingNanoBRET Technology

مقالات ذات صلة