التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

الببتيدوغليكان (PG) هو سمة مميزة للبكتيريا تعمل على الحفاظ على مورفولوجيا الخلية ، مع توفير الدعم الهيكلي للبروتينات والمكونات الخلوية الأخرى ^1,2. يتكون العمود الفقري ل PG من حمض N-acetyl muramic المرتبط ب β-1،4 (MurNAc) و N-acetyl glucosamine (GlcNAc) ^1,2. يمتلك كل MurNAc ببتيدا قصيرا مرتبطا ببقايا ᴅ-lactyl يمكن ربطه بالببتيدات المجاورة المرتبطة بالسكاريد (الشكل 1أ ، ب). ينتج عن هذا التشابك بنية تشبه الشبكة تشمل الخلية بأكملها وغالبا ما يشار إليها باسم الكيس (الشكل 1C). أثناء تخليق PG ، يتم إنشاء السلائف في السيتوبلازم ، ويتم نقلها عبر الغشاء السيتوبلازمي بواسطة الزعانف. يتم دمج السلائف لاحقا في PG الناضج بواسطة إنزيمات transglycosylase و transpeptidase ، والتي تنتج روابط glycosidic والببتيد ، على التوالي³. ومع ذلك ، بمجرد تجميعها ، هناك العديد من الإنزيمات التي تنتجها البكتيريا التي تعدل و / أو تحلل PG لتنفيذ عدد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك النمو والانقسام. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التعديلات المختلفة ل PG تمنح تكيفات خاصة بالسلالة وظروف النمو والإجهاد البيئي ، والتي تورطت في إشارات الخلية ، ومقاومة مضادات الميكروبات ، والتهرب المناعي للمضيف⁴. على سبيل المثال ، التعديل الشائع هو إضافة مجموعة C6 acetyl على MurNAc التي تمنح المقاومة عن طريق الحد من الوصول إلى روابط الجليكان β-1,4 إلى إنزيمات الليزوزيم المنتجة من المضيف والتي تحلل PG⁴،^5،6. في المكورات المعوية ، يمنح استبدال الطرف ᴅ-Ala من السلسلة الجانبية للببتيد ب ᴅ-Lac مقاومة أكبر لمضادات الميكروبات ، فانكومايسين ^7,8.

ظل الإجراء العام لعزل وتنقية PG دون تغيير نسبيا منذ أن تم وصفه في ستينيات القرن العشرين⁹. يتم إذابة الأغشية البكتيرية من خلال المعالجة الحرارية باستخدام SDS ، تليها الإزالة الأنزيمية للبروتينات المرتبطة ، والجليكوليبيدات ، والحمض النووي المتبقي. يمكن بعد ذلك هضم الكيس السليم المنقى في المكونات الفردية عن طريق التحلل المائي للارتباط β-1،4 بين GlcNAc و MurNAc. ينتج هذا الهضم ثنائي السكاريد GlcNAc-MurNAc مع أي تعديلات هيكلية و / أو روابط متقاطعة سليمة وتسمى muropeptides (الشكل 1B).

تم إجراء التحليل التركيبي ل PG في البداية من خلال الفصل الكروماتوجرافي السائل عالي الضغط (HPLC) لتنقية كل موروببتيد متبوعا بالتحديد اليدوي للببتيدات الموروببتيدات^10,11. ومنذ ذلك الحين تم استبدال هذا بقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، مما يزيد من حساسية الكشف ويقلل من عبء العمل اليدوي لتنقية كل ببتيد موروببتيد فردي. ومع ذلك ، ظلت الطبيعة المعقدة والمستهلكة للوقت للتحديد اليدوي للببتيدات muropeptides عاملا مقيدا ، مما قلل من عدد الدراسات التي أجريت. في السنوات الأخيرة مع ظهور التقنيات "omic" ، أصبح استخراج ميزة LC-MS الآلي أداة قوية ، مما يسمح بالكشف السريع وتحديد المركبات الفردية في عينات معقدة من مجموعات بيانات كبيرة جدا. بمجرد تحديد الميزات ، يقارن برنامج المعلوماتية الحيوية إحصائيا التباين بين العينات باستخدام التحليل التفاضلي لعزل حتى الحد الأدنى من الاختلافات بين مجموعة البيانات المعقدة وعرضها بيانيا للمستخدم. بدأ للتو استكشاف تطبيق برنامج استخراج الميزات لتحليل تكوين PG 12،^13،14 ويقترن بتحليل المعلوماتية الحيوية ¹². على عكس التحليل البروتيني الذي يستفيد من قواعد بيانات البروتين المتاحة بسهولة والتي تتنبأ بتجزئة الببتيد مما يسمح بتحديد الهوية الآلي بالكامل ، لا توجد مكتبة تجزئة حاليا ل peptidoglycomics. ومع ذلك ، يمكن أن يقترن استخراج المعالم بقواعد بيانات هيكلية معروفة ومتوقعة للتنبؤ بتحديد muropeptide¹². نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لاستخدام استخراج الميزات المستندة إلى LC-MS جنبا إلى جنب مع مكتبة muropeptide لتحديد الهوية الآلية والتحليل التفاضلي المعلوماتي الحيوي لتكوين PG (الشكل 2).

1. تحضير عينة الببتيدوغليكان

1. نمو الثقافات البكتيرية
   ملاحظة: سيختلف نمو المزارع البكتيرية اعتمادا على الأنواع البكتيرية وظروف النمو التي يتم فحصها. ستحدد المعلمات التجريبية التي سيتم اختبارها ظروف النمو.
   1. تنمو المزارع البكتيرية في ظل ظروف النمو المطلوبة للسلالة البكتيرية والتصميم التجريبي. تنمو البكتيريا كمزارع ثلاثية (تتكاثر بيولوجيا) ، أي ثلاث مستعمرات منفصلة لكل سلالة أو حالة نمو.
      ملاحظة: من المعروف أن ظروف النمو ومرحلة النمو لها تأثيرات كبيرة على تكوين PG^1،2،10. يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الاتساق بين الثقافات والنسخ المتماثلة لضمان أن التغييرات التركيبية ناتجة عن المعلمات التجريبية وليس الخطأ التجريبي.
   2. قم بتبريد المزرعة بسرعة إلى 4 درجات مئوية ، وقم بالتجميع عن طريق الطرد المركزي (11000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) وقم بتجميد حبيبات الخلية عند -20 درجة مئوية. اغسل حبيبات الخلية بمبردة مسبقا 4 درجات مئوية ، 20 مللي متر من فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 قبل التجميد. يجب أن يتم إنتاج حبيبات الخلايا المجمدة بأسرع ما يمكن واتساقا بين العينات للحد من نشاط الإنزيمات التي يمكن أن تعدل و / أو تحلل PG أثناء عملية التجميع. يمكن معالجة العينات مباشرة من خلال عملية الاستخراج (القسم 1.2) دون تجميد ؛ ومع ذلك ، تأكد من معالجة جميع العينات بطريقة مماثلة.
      ملاحظة: لضمان منتج كاف للخطوات اللاحقة ، يتم استخدام حبيبات خلية رطبة كبيرة الحجم. ينتج عن ذلك حبيبات ساكولي كبيرة بما فيه الكفاية ، والتي يمكن تصورها وصيانتها بسهولة أثناء خطوات الغسيل المتكررة (القسم 1.2.5 و 1.2.14) دون فقد كبير للمنتج. اعتمادا على البكتيريا وظروف النمو ، من المحتمل أن يختلف هذا العائد. بالنسبة للبكتيريا سالبة الجرام Pseudomonas aeruginosa ، PAO1 ، أنتجت 4 لتر من مزرعة 0.5 OD₆₀₀ حبيبات خلية 3-4 جم وكانت كافية لإنتاج ~ 10 ملغ من الكيسولي المنقى (القسم 1.2.17) ¹². هذا هو فائض كبير من saculi مما هو مطلوب ل LC-MS (القسم 2) ؛ ومع ذلك ، سيساعد في دقة القياس (القسم 1.2.17) والتطبيع (القسم 1.3).
2. استخراج الببتيدوغليكان ساكولي
   ملاحظة: بروتوكول استخراج PG مقتبس من المرجع.^9,11,15. سيقوم هذا البروتوكول باستخراج PG من الخلايا البكتيرية الفردية ككيس كامل ، خال من المكونات الخلوية الأخرى. يمكن استخدام البروتوكول مع البكتيريا سالبة الجرام أو إيجابية الجرام. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا إيجابية الجرام ، قد تكون التعديلات ضرورية لعزل بنية PG الأكثر سمكا وإزالة البوليمرات المرتبطة بجدار الخلية. مثل أحماض تيكويك.
   1. إعادة تعليق كريات الخلايا المجمدة عند حوالي 1:10 من حجم المزرعة الأصلي البالغ 20 مللي متر من فوسفات الصوديوم 6.5. نفذ هذه الخطوة عند 4 درجات مئوية (يمكن أن يكون 1-8 مجم من وزن حبيبات الخلايا الرطبة لكل مل من المخزن المؤقت^11,12).
      ملاحظة: للحفاظ على حالة أستلة PG ، يلزم وجود درجة حموضة 6.5 أو أقل^15,16.
   2. أضف معلق الخلية بالتنقيط إلى الغليان 8٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 لحجم نهائي 1: 1 (أي التركيز النهائي هو 4٪ SDS) ، مع التحريك برفق في دورق دائري القاع مجهز بمكثف مبرد بالماء. (الشكل 2، الخطوة 2)
   3. حافظ على غليان لطيف لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعات مع التحريك لضمان تفكك الغشاء بالكامل. تأكد من أن الخليط الناتج واضح تماما مع عدم وجود كتل أو لزوجة متبقية للخلايا. يفضل الغليان لفترة أطول لضمان التفكك التام.
   4. اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن ترك العينة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
      ملاحظة: عند وجود SDS ، احتفظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على SDS في المحلول.
   5. اجمع الساكولي كحبيبات من خلال الطرد المركزي الفائق عند 70000 × جم لمدة 40 دقيقة (أو الوقت اللازم لتكسير الرواسب بالكامل) عند 25 درجة مئوية.
   6. غسل الكيس بشكل متكرر عن طريق الطرد المركزي الفائق المتتالي (القسم 1.2.5) والتعليق في ~ 50 مل من درجة حرارة الغرفة 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5 حتى يحتوي المخزن المؤقت للغسيل على تركيز SDS ~ 0.001٪. عادة ، 5 إلى 7 غسلات كافية.
      ملاحظة: لاختبار تركيز SDS المتبقي في المخزن المؤقت للغسيل ، استخدم الصبغة اللونية ، Stains-all¹⁷.
   7. إعادة تعليق sacculi في 5-10 مل من درجة حرارة الغرفة 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5.
   8. قم بتقطيع العينة لفترة وجيزة (~ 40٪ ، 50 واط ، 20 كيلو هرتز ، 20 ثانية) في درجة حرارة الغرفة لتفريق الكتل.
      ملاحظة: سوف يؤدي صوتنة ممتدة ميكانيكيا القص من هيكل PG¹⁸.
   9. استكمل العينة ب 50 ميكروغرام / مل لكل من الأميليز و DNase و RNase ، و 10 mM من كبريتات المغنيسيوم ، واهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التقليب أو التعويذة.
      ملاحظة: يزيل هضم الأميليز أي جليكوجين متبقي محاصر داخل الكيس¹¹.
   10. أضف 100 ميكروغرام / مل من البروناز واهضمه عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب أو التقطيع و ~ 0.02٪ أزيد الصوديوم.
       ملاحظة: يزيل هضم البروناز الإنزيمات المضافة (من القسم 1.2.9) ويزيل البروتينات الدهنية المرتبطة تساهميا ب PG.
       تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية ويتطلب طرق استخدام / التخلص المناسبة.
   11. جهاز طرد مركزي فائق عند 70000 × جم لمدة 40 دقيقة (أو الوقت اللازم لامتصاص الرواسب بالكامل) عند 25 درجة مئوية لإزالة أزيد الصوديوم.
   12. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من 2٪ SDS 20 mM فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.5.
   13. تغلي لمدة ساعة واحدة في قدر بخاري أو قارورة مستديرة القاع مع مكثف مبرد بالماء (القسم 1.2.2).
       ملاحظة: تزيل خطوة الغليان الثانية SDS جميع البروتينات والملوثات المتبقية من الكيس.
   14. كرر غسل sacculi (القسم 1.2.6) مع ~ 50 مل من الماء المقطر المزدوج بدرجة حرارة الغرفة (ddH₂O) حتى يصبح تركيز SDS ~ 0.001٪.
   15. أعد تعليق الحبيبات بكمية كافية من ddH₂O لتعليق الكيس ، وكذلك غسل الحاوية (على سبيل المثال ، 25 مل) وتجميدها طوال الليل عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يختلف الحجم حيث سيتم تجفيف العينة بالتجميد في الخطوة التالية ، على الرغم من أن الأحجام الأصغر تتطلب وقتا أقل للتجميد.
   16. في اليوم التالي ، قم بتجفيف التعليق وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
   17. قياس كمية الكيس المجفف بالتجميد التي تم الحصول عليها على ميزان تحليلي.
   18. خفف الكيس في ddH₂O إلى 10 مجم / مل وصوتنة لفترة وجيزة لتفتيت الكتل قبل إجراء مزيد من التحليل.
3. القياس الكمي للببتيدوغليكان المنقى
   1. حدد كمية الكيس المنقى من القسم 1.2.18 لضمان معادلة بيانات مواصفات الكتلة أثناء التحليل التفاضلي (القسم 3.2). اتبع المنهجية التفصيلية الموضحة في المرجع¹⁵.
      ملاحظة: يتم تقسيم الساكولي المنقى (القسم 1.2.18) إلى مكونات فردية من السكر والأحماض الأمينية عن طريق التحلل المائي للحمض. يتم فصل المكونات الفردية وقياسها كميا بواسطة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون باستخدام الكشف النبضي الأمبيرومتري. بالنظر إلى بنية PG (الشكل 1) ، تتكون الببتيدات الموروببتيدات الفردية من MurNAc واحد وبقايا GlcNAc واحدة. لذلك ، فإن تحديد تركيز أي من البقايا يمثل كمية الببتيدات 1: 1 داخل العينة. يفضل MurNAc بسبب فصل الذروة النظيف عن مكونات PG الأخرى أثناء الكروماتوغرافيا¹⁶.

2. الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي

1. تحضير الببتيدات الموروببتيدات لقياس الطيف الكتلي
   1. تكملة 800 ميكروغرام من ساكولي المنقى مع 100 ميكروغرام / مل موتانوليسين ، 100 مللي متر أسيتات الأمونيوم درجة الحموضة 5.5 ، و 50 مليمتر كلوريد المغنيسيوم في تفاعل 100 ميكرولتر.
   2. هضم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   3. أضف حجم 1: 1 0.5 M بورات عازلة درجة الحموضة 9.0 وتكملة مع ~ 10 ملغ / مل بوروهيدريد الصوديوم (NaBH₄).
      ملاحظة: سيؤدي دوران السكريات الحلقية بين الأشكال α و β الشاذة إلى تكوينات ذروة متعددة أثناء فصل الكروماتوغرافيا السائلة للببتيدات الموروببتيدات. العلاج مع NaBH₄ يزيل التحويل بين الشكلين عن طريق اختزال MurNAc إلى موراميتول¹¹. لا يقلل العلاج من 1،6-anhydro MurNAc أو 1،4 بقايا السكر المرتبطة به.
      تنبيه: ينتج عن تفاعل NaBH₄ كميات صغيرة من غاز الهيدروجين. سيخلق تفاعل NaBH₄ فقاعات ويجب إبقاء أنابيب الميكروفوج مفتوحة للسماح للغاز بالهروب.
   4. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 20-30 دقيقة.
   5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لتسوية العينة في أنبوب microfuge وإزالة الفقاعات.
   6. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى <4.0 باستخدام حمض الفوسفوريك 1: 5 ، المضاف بزيادات قدرها 5 ميكرولتر. اختبار درجة الحموضة باستخدام شرائط اختبار درجة الحموضة عباد الشمس.
   7. أجهزة الطرد المركزي في ~ 17000 × ز لمدة 1 دقيقة لترسب أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية.
   8. تصفية باستخدام مرشحات الطرد المركزي الدقيقة 0.2 ميكرومتر.
   9. يتم طرد العينات بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 30000 × جم قبل الحقن في LC-MS لضمان عدم حقن أي جسيمات في مرض التصلب العصبي المتعدد.
2. إعداد LC-MS
   1. قم بتوصيل عمود جسيمات C18 مسامي سطحيا (100 مم × 2.1 مم ، حجم المسام <3 ميكرومتر) بمطياف الكتلة رباعي الأقطاب لوقت الرحلة (qtof) بدقة كشف m / z بأربع نقاط عشرية كحد أدنى.
   2. إجراء فصل الكروماتوغرافيا السائلة من muropeptides
      ملاحظة: يجب تشغيل كل ثلاثية بيولوجية (القسم 1.1.1) من خلال LC-MS (القسم 2.2.2 إلى 2.2.3) ثلاث مرات (ثلاث نسخ تقنية). لذلك ، سيكون لكل حالة تم اختبارها إجمالي تسعة ملفات بيانات LC-MS. تم الحصول على البيانات باستخدام البرامج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، ينبغي اختيار برامج الاستحواذ بناء على آلية MS. يمثل ما يلي دليلا لإعداد MS مع معلمات محددة لتشغيل هذا البروتوكول. للحصول على وصف تفصيلي ، يرجى الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة.
      1. للفصل الكروماتوغرافي ، قم بإعداد المذيبات التالية 0.1٪ حمض الفورميك (A) والأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (B).
      2. قم بإعداد طريقة للفصل الكروماتوجرافي باستخدام المعلمات التالية.
      3. اضبط معدل التدفق على 0.4 مل / دقيقة.
      4. شرط العمود لمدة 10 دقائق عند 2٪ B (~ 24 حجم عمود).
      5. باستخدام جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي ، قم بحقن 10 ميكرولتر من العينة من القسم 2.1.9.
         ملاحظة: قم بتشغيل عينة أولية واحدة من خلال بروتوكول LC-MS قبل بدء جمع البيانات. لا يتم استخدام هذا التشغيل للبيانات ولكن لزيادة قابلية استنساخ وقت الاستبقاء لجميع عمليات التشغيل اللاحقة. ويلزم استنساخ زمن الاستبقاء أثناء المعالجة الطيفية (القسم 1.3) من أجل التحديد الدقيق لقمم نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z ) وتجميعها.
      6. افصل الببتيدات باستخدام 2٪ B لمدة 5 دقائق (~ 12 حجم عمود) ، ثم زيادتها إلى 15٪ B خلال 13 دقيقة (~ 30 حجم عمود) ، وزيادتها إلى 50٪ B على مدى 10 دقائق (~ 24 حجم عمود) ، وأخيرا زيادتها إلى 98٪ B على مدى 2 دقيقة (~ 5 أحجام أعمدة).
         ملاحظة: تخلص (أرسل إلى النفايات) أول 2 دقيقة وآخر 5 دقائق من التدرج.
      7. انتهي بغسل العمود بنسبة 98٪ B لمدة 6 دقائق (~ 14 حجم عمود) وإعادة التوازن لمدة 20 دقيقة (~ 47 حجم عمود).
   3. إجراء الكشف عن قياس الطيف الكتلي للببتيدات الموروببتيدات
      1. قم بمعايرة محور الكتلة في الوضع الإيجابي باستخدام مزيج ضبط في الأسيتونيتريل يحتوي على معايير الكتلة المرجعية LC-MS باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمرض التصلب العصبي المتعدد.
         ملاحظة: يتم ضبط MS قبل بداية عمليات التشغيل الكروماتوغرافية (القسم 2.2.2.1).
      2. قم بإعداد طريقة للحصول على بيانات MS باستخدام المعلمات التالية.
         ملاحظة: تجمع بيانات MS وMS/MS (الأقسام 2-2-3-2 إلى 2-2-3-6) بالتزامن مع الفصل الكروماتوغرافي للببتيدات الموروببتيدات (القسمان 2-2-2-4 و2-2-2-5). كل من المعلمات الكروماتوغرافية و MS (الأقسام 2.2.2.2 و 2.2.3.2) هي طريقة واحدة تتم إضافتها أثناء إعداد قائمة عمل لتشغيل عينات متعددة بالتسلسل.
      3. اضبط جهد الشعيرات الدموية بالرش الكهربائي على 4.0 كيلو فولت ودرجة حرارة غاز التجفيف عند 350 درجة مئوية بمعدل تدفق 13 لتر / دقيقة.
         ملاحظة: يجب استخدام النيتروجين (نقاء >99٪) كغاز للرذاذ والتجفيف والاصطدام أثناء جمع جميع بيانات قياس الطيف الكتلي.
      4. اضبط ضغط البخاخات على 40 رطل / بوصة مربعة واضبط المجزأ على 150 فولت.
      5. اضبط الفوهة والكاشطة وجهد التردد اللاسلكي ثماني الأضلاع على 1000 فولت و 65 فولت و 750 فولت على التوالي.
      6. اضبط نطاق المسح على 300-2000 م / z في وضع الأيونات الموجبة 4 جيجاهرتز (النطاق الديناميكي الموسع).
      7. تعيين جمع البيانات باستخدام اكتساب MS / MS المعتمد على البيانات مع معدل مسح MS و MS / MS يبلغ 1 أطياف / ثانية. حدد خمس كتل سلائف لكل دورة ، بترتيب شحنة مفردة ومضاعفة وثلاثية.
      8. اضبط طاقات تصادم تجزئة MS / MS على 15 و 20 و 30 فولت.

3. التحليل التفاضلي لوفرة الموروببتيد

1. المعالجة الطيفية للكروماتوجرام LC-MS
   ملاحظة: تم إجراء استخراج الميزة العودية باستخدام البرامج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يمكن استخدام برامج استخراج الميزات الأخرى. ومع ذلك ، قد تتطلب البرامج الأخرى معالجة بيانات يدوية إضافية لإنجاز الاستخراج العودي القوي للغاية. تستخدم البرامج المختلفة ميزة المصطلحات والكيان والمركب بالتبادل تقريبا. بالنسبة لتحليل PG ، تشير جميعها إلى تحديد مخطط كروماتوجرام الأيونات LC-MS لممثل muropeptide فردي (على سبيل المثال ، الشكل 3). أثناء المعالجة الطيفية (القسم 3.1) ، تمثل الميزة القمم المتعددة m / z التي تشمل الأنواع الأيونات المتعددة المحتملة ل muropeptide واحد والتي يتم تجميعها معا تحت تسمية مركب واحد.
   1. ضمن ملف، بدء مشروع جديد.
   2. أضف ملفات بيانات LC-MS QTOF وقم بتعيين ملفات بيانات فردية لحالة / مجموعة تجريبية ، على سبيل المثال ، حالتان مختلفتان للنمو.
   3. قم بتشغيل معالج معالجة البيانات استخراج الميزة العودية دفعة (جزيئات صغيرة / ببتيدات) وتعيين مرشحات معالجة البيانات لمطابقة معلمات ظروف LC-MS والأجهزة لتحديد وتجميع والتحقق بدقة من قمم m / z التي تمثل muropeptides الفردية. من الكروماتوجرام ، افحص انحراف وقت الاحتفاظ وتباين m / z من القمم المماثلة المعروفة لتعيين معلمات المرشح الأولية.
      ملاحظة: يستخدم استخراج المعالم العودية خوارزمية استخراج ميزة جزيئية أولية غير مستهدفة لتحديد ومحاذاة ميزات الكروماتوجرام (قمم m / z ) عبر جميع ملفات البيانات. بمجرد إنشائها ، يتم استخدام هذه الميزات لإعادة تقييم ملفات البيانات الأصلية (المتكررة) باستخدام خوارزمية استخراج الميزة الجزيئية المستهدفة لتحسين موثوقية ودقة الميزات المحددة. من الأفضل تعيين الاستخراج الأولي غير المستهدف مع نافذة كشف ضيقة واستخدام معلمات الكشف الأوسع للاستخراج العودي لتحديد القمم في جميع ملفات البيانات التي قد تكون مفقودة في الاستخراج الأولي. قد يستغرق تشغيل استخراج الميزة العودية ساعات حتى يكتمل اعتمادا على عدد العينات وتعقيد البيانات وأجهزة الكمبيوتر الموجودة
   4. راجع نتائج استخراج المعالم. إذا فشل عدد كبير من الميزات في المحاذاة في مجموعة، فاضبط معلمات التصفية العودية لتوسيع/تقييد نافذة الكشف كما هو مطلوب. لتحقيق ذلك ، افحص مخطط الكروماتوجرام وملف تعريف النظائر لكل ميزة مستخرجة لضمان إنجاز اكتشاف الميزة بشكل مشابه عبر جميع ملفات البيانات. أيضا، لكل معلم محدد داخل ملف بيانات، افحص النتيجة وأي تحذيرات وما إذا كانت الميزة قد اجتازت معلمات التصفية المختارة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر للحفاظ على نوافذ الكشف ضيقة بما فيه الكفاية بحيث لا يتم تجميع الميزات المميزة معا عن طريق الخطأ. غالبا ما يتم ملاحظة ذلك من خلال ملفات تعريف النظائر المتباينة بين ملفات البيانات ، أو الاختلافات الكبيرة في وقت الاستبقاء . على العكس من ذلك ، إذا كانت هناك ميزات متعددة ذات أوقات m / z وأوقات احتفاظ متشابهة ، فمن المحتمل أن تكون معلمات المرشح صارمة للغاية مما أدى إلى تقسيم ذروة MS واحدة إلى ميزتين. لذلك ، قم بتشغيل استخراج الميزات (القسم 3.1.3) مرة أخرى مع معلمات تصفية وقت الاستبقاء المعدلة للسماح بتجميع أفضل لهذه الميزات. سيشير تصور قمم الوفرة الأقل إلى ما إذا كانت المرشحات المستخدمة (القسم 3.1.3) قد حددت بدقة القمم فوق ضوضاء الخلفية. إذا ظهرت قمم الوفرة الأقل مشابهة للخلفية، فأعد تشغيل استخراج الميزة باستخدام معلمات تصفية الخلفية الجديدة.
   5. تصدير البيانات كملف تبادل مركب (.cef) (تنسيق متوافق مع البرنامج الإحصائي) ، أو ملف منفصل عن عمود (.csv) يحتوي على الكتلة ووقت الاحتفاظ ووفرة كل ميزة لكل عينة.
2. التحليل التفاضلي للخصائص الطيفية
   ملاحظة: أجري التحليل التفاضلي باستخدام برامجيات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يمكن استخدام برامج المعلوماتية الحيوية الأخرى.
   1. افتح البرنامج وعند توجيه بدء مشروع جديد.
   2. اتبع تعليمات استيراد البيانات وتحليلها. أثناء استيراد البيانات، قم بتحميل ميزة الملفات المستخرجة (القسم 3.1). أثناء تحليل البيانات، اختر تغيير الأهمية والطي للتحليل التفاضلي وحدد البيانات الأساسية إلى متوسط الكثافة عبر جميع ملفات البيانات. لا تقم بتعيين أي عوامل تصفية بيانات (إذا تم ذلك في خطوة معالجة الأطياف السابقة (القسم 3.1)) لأن تطبيق المرشحات مرة أخرى من شأنه أن ينفي استخراج الميزة العودية القوية. ومع ذلك ، على غرار استخراج الميزات ، يجب محاذاة التحليل التفاضلي بناء على الكتلة (m / z) ووقت الاحتفاظ بسبب الانجراف في جمع بيانات LC-MS. استخدم المعلمات المحددة في استخراج الميزة (القسم 3.1).
      ملاحظة: قم بالتطبيع بين ملفات البيانات باستخدام كمية muropeptide (القسم 1.3) للتأكد من أن الاختلافات ناتجة عن المعلمات التجريبية وليس بسبب الاختلافات في تنقية sacculi (القسم 1.2). استخدم خيار القشارة الخارجية لضبط كل ملف بيانات للاختلافات في تركيز MurNAc للعينة.
   3. بمجرد اكتمال التحليل ، افحص التحليلات الرسومية والإحصائية الناتجة لتحديد muropeptides التي تظهر تغيرا كبيرا في الوفرة بين الظروف التجريبية المختبرة.
   4. ضمن متصفح المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن على التحليلات المختلفة واختر خيار تصدير لحفظ تفاصيل الميزة كملف بيانات مفصول بعمود (.csv) يحتوي على m / z ووقت الاحتفاظ وقيم الكثافة الأولية والمعيارية والقيمة p و FDR وتغييرات الطي لكل ميزة. يجب حفظ تحليلات متعددة للحصول على جميع البيانات ذات الصلة.
   5. تصدير ملف .csv ثان يحتوي فقط على muropeptides التي تجاوزت التحليلات الإحصائية بما في ذلك القيمة p <0.05 وتغيير الطي >2.
3. شرح هوية muropeptide إلى الميزات الطيفية
   ملاحظة: يجب تعيين بنية muropeptide متوقعة لكل معلم محدد بناء على m / z ويتم تأكيد هذا التعليق التوضيحي من خلال فحص تجزئة MS / MS. بعد تأكيد التعليقات التوضيحية ، قد يكون من الضروري إجراء التحليل التفاضلي وتحسينه (القسم 3.2).
   1. ضمن برنامج التحليل التفاضلي ، ضمن تفسير النتائج ، حدد متصفح الهوية. أضف مكتبة من هياكل الموروببتيد المتوقعة وحدد معلمات مماثلة كما هو مستخدم سابقا (القسم 3.1.3). سيؤدي ذلك إلى إنتاج تعليق توضيحي متوقع ل muropeptide لكل ميزة محددة. يمكن إنتاج مكتبة من هياكل muropeptide باستخدام m / z لهياكل muropeptide المتوقعة وبرامج قاعدة بيانات MS (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن العثور على مكتبة m / z من >6000 muropeptides المحتملة في المرجع¹².
   2. حدد التعليق التوضيحي للموروببتيد المتوقع بناء على درجة المطابقة والأهمية البيولوجية للموروببتيد المتوقع ، أي اختر الموروببتيد الأكثر احتمالا ليكون موجودا في العينة البيولوجية.
   3. قم بتأكيد التعليق التوضيحي المتوقع ل muropeptide يدويا من خلال مقارنة قمم m / z لمخطط كروماتوجرام MS / MS ب m / z المتوقع لجميع الأجزاء المحتملة لهيكل muropeptide معروف (على سبيل المثال ، الشكل 4).
      1. عرض بيانات MS و MS / MS باستخدام برنامج عرض الكروماتوجرام (انظر جدول المواد ، الشكل 4).
      2. ارسم بنية muropeptide المتوقعة باستخدام محرر جزيئي (برنامج رسم التركيب الكيميائي) (انظر جدول المواد ، الشكل 4 ، أقحم رمادي). استخدم أداة تجزئة الكتلة لإظهار m / z لشظايا MS عند كسر كل رابطة إما بشكل فردي أو مجتمعة.
         ملاحظة: اعتمادا على طاقة التجزئة المستخدمة في MS / MS ، يمكن أن يحدث التجزئة عند أي رابطة في بنية muropeptide . ومع ذلك ، فإن بعض الروابط مجزأة بسهولة / بشكل متكرر عند مستويات طاقة أقل. على سبيل المثال ، يحدث التجزئة في السلسلة الجانبية للببتيد في أغلب الأحيان عند رابطة الأميد بين الأحماض الأمينية. أثناء تقييم التجزئة ، من المهم ملاحظة أن بقايا GlcNAc مجزأة بسهولة من الببتيد الموروبيتد. لذلك ، يجب تقييم تجزئة بنية muropeptide المعروفة مع وبدون GlcNAc. نظرا لتجزئة GlcNAc في المصدر ، قد تمثل العديد من الميزات المستخرجة في المعالجة الطيفية (القسم 3.1) بنية muropeptide واحدة. إذا وجدت ، يجب دمج هذه الميزات وإعادة تقييم التحليل التفاضلي.
      3. قارن جميع الأجزاء المحتملة لهيكل muropeptide الذي تم تحديده (القسم 3.3.3.2) بمخطط كروماتوجرام MS / MS (القسم 3.3.3.1). لتأكيد التعليق التوضيحي muropeptide ، يجب العثور على قمم m / z لأجزاء متعددة في مخطط كروماتوجرام MS / MS مع نافذة محاذاة m / z ضئيلة للغاية (الشكل 4).
      4. من أجل توضيح هوية muropeptide في حالة تجزئة MS / MS الغامضة ، كرر الأقسام 2.2.2 إلى 2.2.3 مع العينات (القسم 2.1.9) للحصول على بيانات MS / MS إضافية تتضمن قائمة سلائف مفضلة من m / z ووقت الاحتفاظ مع طاقات تصادم تجزئة MS / MS إضافية.
   4. بالنسبة للكيانات المشتركة التي تم التعليق عليها على أنها نفس muropeptide ، قم بتشغيل التحليل التفاضلي (القسم 3.2.2) مرة أخرى ودمج المعالم المستخرجة.
4. تقييم التغيرات العالمية في تعديلات الموروببتيد
   1. قم بتحرير ملف .csv (القسم 3.2.4) من muropeptides ذات الدلالة الإحصائية العالية للتغيير لتضمين عمود واحد لكل تعديل muropeptide . املأ هذا العمود بتسمية لكل موروببتيد مشروح (القسم 3.3) (على سبيل المثال ، الأسيتيل مقابل de-N-acetylated GlcNAc أو MurNAc).
   2. قم بتحميل ملف .csv المعدل إلى Perseus^22,23. قم باستيراد قيم الكثافة التي تمت تسويتها إلى مربع الاستيراد الرئيسي وقم باستيراد تعيين التعديل إلى مربع الاستيراد الفئوي.
   3. ضمن التعليقات التوضيحية للصفوف ، انقر فوق التعليقات التوضيحية بشكل قاطع على الصفوف وأضف ملفات بيانات إلى كل معلمة تجريبية.
   4. ضمن الاختبار ، انقر فوق اختبارين نموذجيين لإجراء اختبار t للطالب (القيمة p < 0.05 ، FDR < 0.05 ، s0 = 1).
   5. انقر فوق 1D لإجراء تعليق توضيحي 1D^22,23. يشير التعليق التوضيحي 1D FDR < 0.05 إلى تغيير كبير في الوفرة لتعديل muropeptide بين المعلمات التجريبية المختبرة. سيؤدي تعيين قيمة العتبة (s0) = 1 إلى عرض درجات FDR للتعليق التوضيحي 1D لجميع muropeptides.
   6. ضمن برنامج الرسوم البيانية (انظر جدول المواد) ، قم بإنتاج خريطة حرارية لتغيير أضعاف الوفرة لكل تعديل muropeptide وإظهار درجة التعليق التوضيحي 1D لإثبات الأهمية (الشكل 5B). يمكن إنتاج تغيير الطي لكل تعديل muropeptide في Microsoft Excel باستخدام الشدة الأولية لجميع muropeptides الفردية التي تحتوي على التعديل.

أدت زيادة حساسية الكشف عن آلات MS إلى جانب برنامج التعرف على الذروة عالي الطاقة إلى تحسين القدرة على عزل ومراقبة وتحليل تركيبات المواد للعينات المعقدة بتفاصيل دقيقة للغاية. باستخدام هذه التطورات التكنولوجية ، بدأت الدراسات الحديثة حول تكوين الببتيدوغليكان في استخدام تقنيات استخراج ميزة LC-MS الآلية12،13،14،24 مقارنة بالمنهجية القديمة القائمة على HPLC 11،25،26،27،28،29،30،31 . على الرغم من وجود العديد من حزم برامج استخراج الميزات العامة المتاحة ، إلا أن البرامج التجارية التي تستخدم استخراج الميزات العودية سريعة وقوية للغاية من خلال تحديد ودمج جميع الشحنات والنظائر والإصدارات المقربة لكل muropeptide الموجودة في مجموعة بيانات LC-MS (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم أوقات الاستبقاء الأولية، والأنماط النظيرية للسمات المستخرجة لإعادة تقييم (تكرار) مجموعة البيانات لضمان التحديد الدقيق لكل سمة في جميع ملفات البيانات. لذلك ، تساعد الخوارزمية العودية في التحقق من صحة وزيادة الثقة في تحديد الذروة. لا تقوم معظم برامج استخراج الميزات العامة بتجميع الشحنات / النظائر ، إلخ. وسيتطلب ذلك كخطوة يدوية إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون البرامج العامة أقل قوة حيث يتم استخراج الميزات بشكل منفصل داخل كل ملف بيانات وليس كمجموعة بيانات كاملة ، والتي تعد جزءا من الخوارزمية العودية.

تم استخدام بروتوكول الببتيدوغليكوميك المقدم هنا مؤخرا لفحص التغيرات التركيبية ل PG بين حالتين للنمو الفسيولوجي ، وهما العوالق السباحة الحرة والأغشية الحيوية المجتمعيةالثابتة 12. باستخدام QTOF MS عالي الحساسية إلى جانب استخراج الميزة العودية ، تم التعرف على 160 من الببتيدات الموروبية المتميزة وتتبعها. يمثل هذا ثمانية أضعاف عدد الببتيدات الموروبيبتيدات التي تم تحديدها في هذا الكائن سابقا29،32 ، وأكثر من ضعف الببتيدات الموروبيبتيدات التي تم تحديدها باستخدام منهجيات أخرى في الكائنات الحية الأخرى10،14،24.

يتم تسهيل ربط كل قمة m / z المستخرجة من بيانات MS مع muropeptide معين عن طريق الإحالة المرجعية مع قاعدة بيانات لهياكل muropeptide المعروفة والمتوقعة. تتم مقارنة مخطط كروماتوجرام MS / MS للتجزئة (الشكل 4) لكل ميزة مستخرجة بملف تعريف التجزئة (الشكل 4 ، أقحم رمادي) ل muropeptide المقترح باستخدام قاعدة البيانات.

يمكن عرض بيانات Peptidoglycomic بعدة طرق مختلفة اعتمادا على الإعداد التجريبي والأسئلة المطروحة. يمكن أن يشمل هذا التحليل البياني تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، ومخططات التشتت ، ومخططات البراكين ، والخرائط الحرارية ، وتحليل التجميع الهرمي. على سبيل المثال ، تسلط مخططات البراكين الضوء على الببتيدات الموروبية التي تظهر حجما كبيرا ذا دلالة إحصائية من تغير الوفرة بين الظروف المختبرة (الشكل 5 أ). يمكن فحص هذه الببتيدات الموروببتيدات المختارة التي تمثل تغيرات كبيرة في الوفرة بين الظروف المختبرة لمزيد من التعديلات على الموروببتيد. يمكن أن تشمل هذه التعديلات وجود بدائل الأحماض الأمينية ، أو تغييرات الأستيل ، أو وجود نشاط الأميداز. عند فحصها معا ، يمكن فحص العديد من الببتيدات الموروببتيدات التي تمتلك نفس التعديل بحثا عن اتجاه نحو حالة تجريبية واحدة (الشكل 5 أ - النقاط المميزة باللون الأخضر) وتقييم المجموعة بأكملها للأهمية (الشكل 5 ب). يمكن أن يشير تتبع تعديل muropeptide بهذه الطريقة إلى نشاط إنزيمي معين يتأثر بالمعلمة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تشير القيم المتطرفة من هذا الاتجاه إلى نشاط إنزيمي له خصوصية معينة أو وظيفة بيولوجية معينة (الشكل 5 أ - النقاط المميزة باللون البرتقالي).

الشكل 1: مثال على تركيب الببتيدوجليكان سالب الجرام النموذجي. (أ) في البكتيريا سالبة الجرام، يقع الببتيدوغليكان في المحيط بين الأغشية الداخلية والخارجية. (ب) يتكون الموروببتيد الواحد من جلوكوزامين N-acetyl المرتبط ب β-1،4 (GlcNAc) (أزرق) وحمض موراميك N-acetyl (MurNAc) (أرجواني) مع سلسلة جانبية ببتيد ملحقة (برتقالية). يمكن ربط السلسلة الجانبية للببتيد بالسلسلة الجانبية للموروببتيد المجاور لإنتاج الببتيدوغليكان الناضج الشبيه بالشبكة (A). يتضمن التنقية عزل الببتيدوغليكان من الخلية بأكملها ككيس حيث تم تجريد جميع المواد الخلوية الأخرى. ج: صورة مجهرية إلكترونية لكيس ببتيدوجليكان. وبالمقارنة ، يمكن أن يتكون PG إيجابي الجرام من مجموعة أكبر من الاختلافات في البنية وهو جزء من التصنيف التصنيفي إيجابي الجرام33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير عمل Peptidoglycomics. إعداد العينة. الخطوة الأولى ، تنمو والخلايا البكتيرية بيليه (القسم 1.1). الخطوة 2 ، تنقية الببتيدوغليكان ساكولي بنسبة 4 ٪ SDS تغلي (القسم 1.2). الحصول على البيانات. الخطوة 3 ، الهضم الأنزيمي للساكولي لإنتاج الببتيدات عن طريق كسر الارتباط β-1،4 بين N-acetylglucosamine (GlcNAc) وحمض N-acetylmuramic (MurNAc) من العمود الفقري الببتيدوغليكان (القسم 2.1). الخطوة 4 ، تحليل شدة الموروببتيد من خلال LC-MS / MS (القسم 2.2). تحليل البيانات. الخطوة 5 ، يحدد استخراج الميزة العودية ويجمع جميع الشحنات والمواد المضافة والنظائر المرتبطة بببتيد muropeptide واحد (القسم 3.1). الخطوة 6 ، تحديد الببتيدات الموروبية من خلال مقارنة التجزئة المتوقعة مع كروماتوجرام MS / MS (القسم 3.3). الخطوة 7 ، التحليل التفاضلي المعلوماتي الحيوي (القسم 3.2) مقارنة التغيرات التركيبية الببتيدوغليكان بين المعلمات التجريبية المختلفة. الخطوة 8 ، فحص التغير العالمي في تعديلات muropeptide ضمن المعلمات التجريبية المختلفة باستخدام التعليق التوضيحي 1D (القسم 3.4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مثال على استخراج ميزة عودية. بالنسبة للموروببتيد الذي يمثل سلسلة جانبية ببتيدية من الألانين (A) ، فإن iso-ᴅ-glutamate (E) ، وحمض الميزو ديامينوبيميليك (m) ، والألانين (A) مرتبط ب AE m A للسلسلة الجانبية muropeptide المجاورة (1864.8 m / z). تتضمن الميزة المستخرجة ل 1864.8 م / ض الشحنات (+1 و +2 و +3) ، والمواد المضافة (مثل الصوديوم والبوتاسيوم) ، وفقدان GlcNAc (1 أو 2 GlcNAc) ، وقمم نظيرية متعددة لكل شكل (على سبيل المثال ، أقحم مكبر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تجزئة الموروببتيد وتحديد هويته. للتعليق التوضيحي ، يتم إعطاء كل ذروة m / z (ميزة) مستخرجة من مخطط كروماتوجرام MS بنية muropeptide مقترحة بناء على التشابه مع مكتبة muropeptide . لتأكيد هذا الهيكل المقترح ، يتم إنشاء شظايا MS / MS المتوقعة باستخدام برنامج رسم كيميائي (أقحم رمادي). تتم مقارنة هذا التجزئة المتوقعة بكروماتوجرام MS / MS. عندما تتطابق الأجزاء المتوقعة (أقحم رمادي) مع مخطط كروماتوجرام MS / MS ، يتم تأكيد بنية muropeptide المقترحة. تم تعديل الرقم من المرجع12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحليل التفاضلي لتركيب الببتيدوغليكان. (أ) مخطط بركان لتغير الطية ودلالة إحصائية للتغيرات في شدة الموروببتيد بين الببتيدوغليكان المنقى من P. aeruginosa المزروع إما كعوالق سباحة حرة أو مستنبت بيوفيلم ثابت. يتم تسليط الضوء على جميع الببتيدات التي لها تعديل يمثل تغييرا في ترتيب الأحماض الأمينية النموذجي داخل السلسلة الجانبية للببتيد. يتم تمييز الببتيدات المستبدلة بالأحماض الأمينية التي أظهرت اتجاها نحو انخفاض الوفرة في الببتيدوغليكان المشتق من الأغشية الحيوية باللون الأخضر. تم تمييز الأحماض الأمينية التي حلت محل الببتيدات التي كانت متطرفة لهذا الاتجاه وأظهرت وفرة متزايدة في الببتيدوغليكان المشتق من الأغشية الحيوية باللون البرتقالي. (ب) خريطة حرارية لتغير الطيات العالمية في وفرة جميع الأحماض الأمينية المستبدلة ببتيدات الموروببتيدات مع زيادة الوفرة (البرتقالية) وانخفاض الوفرة (الخضراء) في الأغشية الحيوية. تم إعادة تجميع هذه الببتيدات الموروببتيدات وتقييمها لمعرفة ما إذا كان استبدال الأحماض الأمينية قد حدث على المونومرات أو الثنائيات المتشابكة أو ما إذا كان قد تم استبدال الرابع (AE m +) أو الخامس (AE m A +) أو كلا الأحماض الأمينية (AEm ++). تم تقييم أهمية كل مجموعة من الببتيدات muropeptides من خلال التعليق التوضيحي 1D مع FDR < 0.05 للأهمية ويتم عرض درجة 1D المرتبطة بها. لا يمكن إجراء التعليق التوضيحي 1D إلا على أكثر من 2 muropeptides (على سبيل المثال ، تم العثور على استبدال AEm ++ فقط على اثنين من muropeptides). لذلك ، في هذه الحالة ، يجب فحص الأهمية بالنسبة للببتيدات الموروبية الفردية وليس على المجموعة. تم تعديل الرقم من المرجع12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.