3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

السراديب المعوية ولكن ليس زغب، تشكل organoids عندما مثقف في مصفوفة Matrigel أو BME-R1. هذه organoids هي هياكل التنظيم الذاتي، وغالبا ما يشار إليها باسم "الأمعاء المصغرة" بسبب وجود مختلف الأنساب المختلفة، السلف، والخلايا الجذعية الموجودة في ظهارة الأمعاء في الجسم الحي. ويعزى احتمال تشكيل organoids من سرداب إلى وجود الخلايا الجذعية¹. الزغب المعوي من ناحية أخرى تتكون فقط من خلايا مختلفة، وبالتالي لا يمكن تشكيل organoids. ومع ذلك، قد تؤدي الطفرات² أو الشروط التي تسمح dedifferentiation من ظهارة villus إلى الخلايا الجذعية في زغب^2،3. يمكن تأكيد هذا التغيير المصيري الناتج عن الجذعية في ظهارة السيلي عن طريق طلاء ظهارة villus المتمايزة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز كمؤشر على النبع من الدي نوفو في ظهارة villus. وبالتالي ، فإن الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب.

وSmad4^KO:β-catenin^GOF الطفرة الشرطية يسبب dedifferentiation في ظهارة الأمعاء تميزت التعبير عن الانتشار وعلامات الخلايا الجذعية في الزغب, وفي نهاية المطاف تشكيل هياكل مثل سرداب في زغب يشار إليها باسم سرداب خارج الرحم تم تحديد وجود هذه الخلايا الجذعية هذه villi dedifferentiated من خلال التعبير عن علامات الخلايا الجذعية في سرداب خارج الرحم(في الجسم الحي)وقدرة الزغب متحولة لتشكيل organoids wh en مطلي ماتريجل³. الإجراء المذكور أدناه يوضح المنهجية المستخدمة لتأكيد الجذعية من ظهارة الأمعاء المتمايزة في Smad4 KO:β-catenin^GOF الفئران المتحولة. كانت إحدى السمات الرئيسية لهذه المنهجية لعزل الزغب هي استخدام كشط التجويف المعوي ، بدلا من^طريقةEDTA 4. على عكس طريقة إزالة EDTA ، تحتفظ عزلة الزغب عن طريق كشط غالبية mesenchyme الأساسي وتسمح بضبط ضغط الكشط لتسفر عن زغب بدون سرداب مربوطة. ضغط كشط ذاتية للمشغل، وبالتالي، يجب تحديد الضغط الأمثل لتسفر عن زغب دون سرداب المربوطة تجريبيا من قبل المشغل. الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري للزغب قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1.

يتم كشط زغب الأمعاء قبالة التجويف المعوي مع الشرائح الزجاجية ووضعها في مرشح 70 ميكرومتر وغسلها مع برنامج تلفزيوني للتخلص من الخلايا فضفاضة أو سرداب، إن وجدت، قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1. وتشدد هذه الطريقة على المعايير التالية لتجنب التلوث سرداب: أ) حصر حصاد الزغب النصف القريب من الاثني عشر حيث الزغب هي الأطول، ب) التقليل من عدد الخدوش ذات العائد الزغب، ج) غسل المرشح الذي يحتوي على الزغب من خلال سلسلة من برنامج تلفزيوني في طبق من ستة آبار، و د) مما يؤكد عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1. عزل سيلي عن طريق كشط، بدلا من EDTA chelation، يمنع فقدان كامل من mesenchyme الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة^5،6،7،8، إذا لزم الأمر، لبدء organoid من ظهارة villus.

وقد حظيت جميع تجارب الماوس التي أجريت، بما في ذلك استخدام تاموكسيفين والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم، بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في معهد ستيفنز لعلم ال echnology.

1. الفئران

ملاحظة: جيل Smad4^f/f; كاتنب^lox(ex3)/⁺; وقد وصفت سابقا الفئران Villin-Cre^{ERT2 3}. الفئران الإناث البالغات بين ثمانية إلى اثني عشر أسبوعا من agewere المستخدمة.

1. حث Smad4KO:β-catenin^GOF طفرة في Smad4^f/f; كاتنب^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 مع الحقن داخل الصفاق من تاموكسيفين في زيت الذرة لمدة أربعة أيام متتالية.
2. التضحية miceby خلع عنق الرحم بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى.
3. رش البطن مع الإيثانول 70٪ لمنع فرو الماوس الدخول في تجويف الصفاق.
4. افتح تجويف البطن بمقص تشريح لكشف الأمعاء. عزل الأمعاء بمساعدة مقص والمملقط.
   ملاحظة: ما يصاحب ذلك من فقدان Smad4 جنبا إلى جنب مع كسب طفرة وظيفة من β-catenin (Smad4^KO;β-catenin^GOF) في ظهارة الأمعاء تم تحقيقه عن طريق حقن^{Smad4و / و}; كاتنب^lox(ex3)/⁺; فئران Villin-Cre^ERT2 كل يوم لمدة أربعة أيام متتالية بوزن جسم 0.05 غرام تاموكسيفين/كجم في زيت الذرة. يتم حصاد هذه الفئران بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى لضمان وجود خلايا تعبر عن علامات مرتبطة بالخلايا الجذعية في الزغب المتمايز.

2. العزلة الاثني عشر وإعداد

1. تشريح النصف القريب من الاثني عشر.
2. تدفق الاثني عشر مع 5 مل من الجليد الباردة PBS في حقنة 10 مل لمسح المحتوى الإنارة.
3. فتح duodenum طوليا مع مقص الزاوية ووضع شقة الاثني عشر على لوحة بيتري 15 سم على الجليد مع تجويف الاثني عشر التي تواجه المشغل.

3. عزلة Villi عن طريق كشط

1. قبل البدء في كشط، ضع مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في واحدة من آبار لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. ملء جميع الآبار مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا على الجليد (الشكل 1).
2. كشط الزغب على النحو التالي باستخدام اثنين من الشرائح الزجاجية المجهرية: واحد لعقد الاثني عشر إلى أسفل والآخر لكشط (الشكل 1B1).
   1. كشط الجانب الإنارة من الاثني عشر سطحيا إلى جيئة وذهابا مرتين لإزالة المخاط. تطبيق الضغط بحيث هذه الخطوة يزيل طبقة المخاط، ولكن ليس الزغب.
   2. كشط duodenum مرة أخرى، إلى جيئة وذهابا مرتين تطبيق نفس الضغط كما هو الحال في 3.1، وخلال ذلك يمكن أن ينظر إلى زغب جمع على الشرائح(الشكل 1B2). هذا هو الضغط الأمثل (الذي يجب تحديده تجريبيا من قبل المشغل) لتحقيق الزغب دون ربط سرداب.
3. استخدام أنبوب نقل 1 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني لنقل زغب (التي يتم جمعها على الشريحة من الخطوة 3.2.2.) إلى 70 ميكرومتر شبكة مصفاة وضعت في طبق 6-جيدا. يتم جمع الزغب وبالتالي، بعد كل كشط(الشكل 1B2).
4. غسل الزغب التي تم جمعها في مصفاة 70 ميكرومتر (من الخطوة 3.3) عن طريق نقل مصفاة (مع زغب) من خلال سلسلة من الآبار في طبق 6 آبار تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة (~ 4 مل / بئر). هذا هو لإزالة سرداب فضفاضة، إن وجدت.
5. باستخدام أنبوب p1000، نقل تعليق زغب في برنامج تلفزيوني (~ 3 مل) من مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد 15 مل على الجليد.
6. استخدام 0.1٪ BSA المغلفة حادة انتهت P200 تلميح pipet إلى يستنشق حجم 50 ميكرولتر من تعليق زغب على شريحة زجاجية. عد عدد الزغب في قطرة 50 ميكرولتر تحت التكبير 4x لتحديد تركيز الزغب في تعليق برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إذا كان هناك 10 زغب في تعليق 50 ميكرولتر فحص، ثم تركيز الزغب هو 0.2 زغب / ميكرولتر. هذا هو أيضا الوقت المناسب لتأكيد عدم وجود سرداب المربوطة.
7. حساب حجم تعليق الزغب المطلوبة لوحة بتركيز 0.5 زغب / ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. إضافة إضافية 100 ميكرولتر لحساب خطأ pipetting وحجم المطلوبة للفحص المجهري المطلوبة لضمان نقاء الزغب.
   تنبيه: الضغط المستخدم في أول كشطين ، يزيل المخاط ولكن ليس الزغب ، يجب استخدامه في الخدوش اللاحقة التي سيتم خلالها إطلاق الزغب. الحد من عدد كشط جيئة وذهابا إلى اثنين بعد أن لوحظ لأول مرة الإفراج الزغب. هذا التدبير يتجنب الإفراج عن الزغب مع سرداب المربوطة. من الضروري تقييم الزغب بشكل مجهري لضمان عدم وجود سرداب مربوطة.

4. الطلاء من الزغب على مصفوفة BME-R1

1. باستخدام 0.1٪ BSA المغلفة P200 طرف الأنابيب حادة النهاية، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق حجم الزغب (من الخطوة 3.6) المطلوبة لوحة في كثافة ~ 6 سيلي لكل بئر في 12.5 ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. استخدام طرف BSA المغلفة حادة انتهت في هذه المرحلة يضمن أن الزغب، والتي هي كبيرة جدا لطرف مدببة يستنشق دون أن يتم حظرها أو فقدت من أن تمسك إلى جانبي الطرف.
2. تدور أسفل الزغب لمدة 2 دقيقة في 200 × ز في جهاز طرد مركزي المبردة (4 درجة مئوية) وإزالة supernatant.
3. كرر الخطوة 4.2 لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية والمضي قدما إلى الخطوة التالية تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
4. Resuspend بيليه الزغب بلطف في الكمية المطلوبة من BME-R1 الباردة إذابة على الجليد.
5. باستخدام أنبوب P20، لوحة 12.5 ميكرولتر / بئر من الزغب في مصفوفة BME-R1 في 3D في لوحة U-bottom قبل الحرب 96 جيدا.
6. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتقويم مصفوفة BME-R1.
7. إضافة 125 ميكرولتر / بئر من ENR قبل الحارة (عامل نمو البشرة / Noggin / R-spondin1) وسائل الإعلام: متقدمة DMEM F-12 وسائل الإعلام, تكملها 1x البنسلين: ستريبتومايسين, 10 MM HEPES, الجلوتاماكس, 50 نانوغرام/ مل EGF, 100 نانوغرام/مل نوجين, 5٪ وسائط مكيفة من خلايا HEK293-T تعبر عن R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-أسيتيل سيستين, و0.05 ملغم/مل بريموسين.
8. احتضان الزغب المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂، وتغيير الوسائط كل يومين.
9. تجاهل أي بئر تظهر فيه الأجهزة العضوية قبل يومين من الطلاء ، حيث أن أقرب نقطة زمنية يتوقع فيها وجود عضويات مشتقة من الزغب هي بعد يومين.
   ملاحظة: يتم احتساب أي زغب يحتوي على نصف أو أكثر من نصف طول الزغب ك villus واحد. على عكس الأجهزة العضوية المشتقة من سرداب، لا يتوقع الأجهزة المشتقة من الزغب في غضون 24 ساعة بعد الطلاء. يبدو أن الزغب الذي يبدأ بالعضوية يظلم ويتقلص قبل تكوين الأعضاء العضوية. وبالتالي ، ينبغي التخلص من أي آبار مع organoids النامية في غضون يوم من الطلاء لتجنب معقولية بعد أن اشتقت من التلوث سرداب معقول. المنهجية المستخدمة لإنتاج وسائل الإعلام مشروطة متاحة عند الطلب.

العامل الحاسم لنجاح الإجراء هو منع تلوث سرداب. يتم ضمان تطور الجهاز من الزغب (وليس من أي سرداب ملوثة) من خلال تأكيد أربعة معايير رئيسية: 1) ضمان نقاء الزغب المحصود عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد طلاء الزغب في BME-R1 ، 2) طلاء عدد محدود من الزغب لكل بئر للسماح بتصور جميع الزغب المطلي بشكل فردي ، 3) على زراعة تطوير الجهاز يوميا؛ صور من الدورة الزمنية تظهر تطور organoid من الزغب(الشكل 3)،و 4) onitoring الحركية والمظهر المورفولوجي من organoids الشروع من الزغب؛ الأجهزة التي تبدأ من الزغب تظهر على شكل غير منتظم في البداية وتأخذ يومين إلى خمسة أيام قبل أن يمكن رؤيتها تحت التكبير 4x بدلا من organoids المستمدة من سرداب (مثقف عن طريق عزل السراديب باستخدام طريقة EDTA / PBS chelation1،4)التي تظهر بين عشية وضحاها كهياكل كروية مع حدود محددة جيدا(الشكل 2).

الوقت الأمثل للتضحية الفئران لاختبار الإمكانات تشكيل الجهازية من الزغب هو بعد villi-epithelium dedifferentiating التعبير عن علامات الخلايا الجذعية والبدء في تطوير سرداب خارج الرحم في الزغب في الجسم الحي (حوالي 10 أيام بعد حقن تاموكسيفين من Smad4و / و; كاتنبlox(ex3)/+; فئران فيلين-كرERT2). هذه الفئران لديها تاموكسيفين غير قابل للانسياط cre-recombinase الذي يسبب فقدان Smad4 المصاحبة لتنشيط β كاتينين مع تاموكسيفين. تتطور سرداب ال ectopic بشكل كامل في غضون أسبوعين من تحريض الطفرة ، في حين تظهر الخلايا الجذعية في ظهارة villus في غضون أسبوع بعد تحريض الطفرة في الجسم الحي. عدد الزغب التي تشكل organoids عندما مطلي في Matrigel وقد أفيد أن تتراوح بين 2٪ إلى 12٪3. حصاد الماوس متحولة لطلاء الزغب في الوقت الذي تكون فيه الخلايا الجذعية موجودة (حوالي أسبوع بعد التعريفي cre-recombinase) سوف تطيل الوقت اللازم لظهور الأجهزة المشتقة من الزغب، في حين تأخير الحصاد إلى ما بعد عشرة أيام بعد التعريفي كر يزيد من سرداب خطر التلوث.

الشكل 1: التجريبية انشاء وخفة كشط من ظهارة الأمعاء. أ)حقنة مليئة برنامج تلفزيوني (syrg) مع أنابيب ومرشح (Fltr) في برنامج تلفزيوني. ب)عزل Villi عن طريق كشط (B1) ونقل إلى مرشح (B2). يشير السهم إلى الزغبة التي تم جمعها على الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التمييز في مظهر organoids الناشئة من سرداب مقابل ظهارة سيلي dedifferentiated من نفس الأمعاء الماوس: أ) الكرتون تظهر villus والسراديب. ب)جبل كامل (في برنامج تلفزيوني) من الزغب التي أعدتها كشط (لوحة أعلى) والسرد التي أعدتها EDTA-chelation (لوحة أقل). ج)الاعضاء المشتقة من Villi (اللوحة العليا) والمستمدة من سرداب (اللوحة السفلى) من نفس ظهارة الماوس المعوية في BME-R1 (أشرطة المقياس، 500 um). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مسار الوقت لتشكيل organoid من زغب dedifferentiating. يظهر بدء العضوية من اثنين من زغب مختلفة (يتم توسيع المناطق محاصر في الألواح الوسطى والسفلية). يبدو الزغب مع إمكانية تشكيل الجهاز كثيفة، وربما يرجع ذلك إلى الاحتفاظ mesenchyme الكامنة. بدء organoid من villus هو واضح في اليوم الثاني (السهم الصلب) من واحدة من الزغب (مربع مع الحدود المكسورة)، بينما في villus أخرى (مربع مع الحدود الصلبة) يظهر organoid في اليوم الرابع (السهم). يظهر المربع العلوي في لوحة اليوم 6 عضوية مشتقة من الزغب. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.