Method Article

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الكبد الأولية هي أداة قيمة لدراسة استجابة الكبد والتمثيل الغذائي في المختبر. باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في أبحاث الكبد في المختبر ، خاصة في دراسات استقلاب الجلوكوز. تم تكييف تقنية أساسية بناء على احتياجات مختلفة ، مثل الوقت والعمالة والتكلفة واستخدام خلايا الكبد الأولية ، مما أدى إلى بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الخطوات العديدة ومستحضرات الكواشف التي تستغرق وقتا طويلا في عزل خلايا الكبد الأولية هي عيوب رئيسية للكفاءة. بعد مقارنة بروتوكولات مختلفة لإيجابياتها وسلبياتها ، تم الجمع بين مزايا كل منها ، وتم صياغة بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية بسرعة وكفاءة. في غضون 35 دقيقة فقط ، يمكن لهذا البروتوكول أن ينتج الكثير ، إن لم يكن أكثر ، من خلايا الكبد الأولية الصحية مثل البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، أثبتت تجارب استقلاب الجلوكوز التي أجريت باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة فائدة هذا البروتوكول في دراسات استقلاب الكبد في المختبر . كما قمنا بمراجعة وتحليل أهمية وغرض كل خطوة في هذه الدراسة على نطاق واسع حتى يتمكن الباحثون المستقبليون من تحسين هذا البروتوكول بناء على الاحتياجات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكبد بمثابة واحد من أهم الأعضاء في الجسم الفقاري بسبب الدور الحيوي الذي يلعبه في العديد من الوظائف الداعمة للحياة مثل هضم الطعام والدورة الدموية وإزالة السموم. استخدام خلايا الكبد الأولية للفئران في ثقافة المختبر تحظى بشعبية متزايدة في دراسات استقلاب الكربوهيدرات وسرطان الكبد. لذلك ، من المهم تطوير طريقة ملائمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية الفطرية. نظرا لوظيفته كمركز لاستقلاب الجلوكوز ، فإن الكبد هو أيضا مركز لإنتاج الجلوكوز وتخزينه1. التجارب مع خلايا الكبد الأولية في المختبر أمر لا بد منه لمعظم دراسات استقلاب الجلوكوز. لذلك ، لسنوات ، طورت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات لعزل خلايا الكبد ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران (8 أسابيع) في هذه الدراسة.

1. التحضير:

  1. امزج ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) مع محلول FBS بنسبة 10٪ ومحلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ لجعل الثقافة متوسطة.
  2. قم بتصفية 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل (على سبيل المثال ، Liver Digest Medium) من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الجسيمات.
  3. دافئ 50 مل من H 2 O مزدوج المقطر (ddH2O) ، و 35 ملمن وسط التروية (على سبيل المثال ، وسط تروية الكبد) (أو 50 مل في المرة الأولى باستخدام هذا البروتوكول) ، و 25 مل من وسط الكولا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل اختبار الكفاءة ، تم إجراء بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية الحالية على الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اختبار تعلق ونقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة. يستخدم عزل خلايا الكبد الأولية لمجموعة واسعة من التجارب على فسيولوجيا الكبد ، مثل تأثيرات الأدوية الكبدية واستقلاب الجلوكوز ، ونشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية2 ، وحساسية الأنسولين ، وإنتاج الجلوكوز. لذلك ، تم اختبار أنشطة خلايا الكبد الأولية المعزولة بهذا البروتوكول في التجارب التالية.

لم ي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير العديد من بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية. كما تم الحفاظ عليها على النحو الأمثل وتكييفها بناء على الاحتياجات المختلفة (الجدول 1). تتكون بروتوكولات العزل عموما من جزأين: التروية (بما في ذلك هضم الإنزيم) والتنقية.

يمكن إجراء التروية مع الكبد بأكمله في الجسم الحي 2،20،21،22،23 أو مع فصوص الكبد تشريح24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 5R01HD095512-02 إلى S.W.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12 بئر لوحةFALCON353043طلاء غير مطلوب
6 آبار طلاءFALCON353046غير مطلوب
مضادللخلايا2920S
محلول مضاد للبيبات مضاد للفطريات (100x) ، مستقرSigma-AldrichA5955
المضادة ل FOXO1خلية الإشارات97635S
المضادة ل GAPDHخلية الإشارات2118S
المضادة ل p-AKT (S473)إشارات الخلية9271L
المضادة ل PEPCKسانتا كروزSC-166778
المضادة ل p-FOXO1 (S256)الإشارات84192S
مصفاة الخلية ، 70 ومايكرو. mCELLTREAT229483
قسطرة IV مغلقة ، 24 مقياس 0.75 بوصةBecton Dickinson383511
DMEM ، بدون جلوكوز ، بدون جلوتامين ، بدون فينول أحمرThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kitالفحص الحيويEBGL-100
مصل الأبقار الجنينية (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانويLI-COR926-68070
الماعز المضاد للأرانب IgG الجسم المضاد الثانويLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
الكبد غسل متوسطجيبكو17704-024
خليةIBMX13630S
الأنسولينليليNDC 0002-8215-01
الكيتامين هيدروكلوريك (100 مجم / مل)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamineGibco25030081
Liver Digest MediumGibco17703-034Aliquot داخل غطاء مزرعة الأنسجة إلى 25 مل لكل في أنبوب 50 مل ، واحتفظ به في -20 درجة ؛ C فريزر
نضح الكبد متوسطجيبكو17701-038
القلم StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
مضخة التمعجيةGilsonMinipuls 2قادرة على الضخ بسرعة 4 مل / دقيقة
طبق بتريFisherbrand08-757-12
طردمركزي مبردSorvallLegend RTقادرة على الطرد المركزي 50 مل أنبوب عند 4 درجات ؛ C
الصوديوم L-LactateSigma-AldrichL7022
11360070الصوديوم بيروفاتجيبكو
، PVDF 0.45 & micro ؛ م 30 ممCELLTREAT 229745
، 0.5 مل329461بيكتون ديكنسون
، 60 ملBecton Dickinson309653
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Gibco15250061
Tube ، 15 ملCorning430052
Tube ، 50 ملCorning430290
Water خزان الحمامكورنينجCLS6783أو أي خزان حمام مائي قادر على تسخين ما يصل إلى 45 درجة ؛ سي
ويليام S E متوسط (مكمل GlutaMAX)جيبكو32551020
زيلوزين (100 مجم / مل)فيتون أناسيد لوس أنجلوسNDC13985-704-10
AKT خلية أنظمة خلايا إشارات جهاز فلتر حقنة قطر حقنة حقنة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Related Articles