مقالة منهجية

طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم الراتنج الكامل الحجم للبذر وتطبيقاته

DOI:

10.3791/61822

⸱

يناير 23, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه التقنية تسمح لإعداد سريع وبسيط من قسم الراتنج كامل الحجم البذور لمراقبة وتحليل الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المورفولوجيا، وحجم وكمية من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في البذور تحديد وزن ونوعية البذور. وهي تختلف اختلافا كبيرا بين مناطق مختلفة من البذور. من أجل عرض morphologies من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتين بوضوح ، وتحليل كميا المعلمات المورفولوجيا بدقة ، وهناك حاجة إلى قسم البذور كلها الحجم. على الرغم من أن قسم البارافين بالبذور الكاملة يمكن أن يحقق في تراكم مواد التخزين في البذور ، إلا أنه من الصعب جدًا تحليل بارامترات المورفولوجيا للخلايا ومواد التخزين نظرًا لدقة منخفضة للقطعة السميكة. يحتوي قسم الراتنج الرقيق على دقة عالية ، ولكن طريقة تقسيم الراتنج الروتينية ليست مناسبة لإعداد القسم الكامل بحجم البذور من البذور الناضجة مع حجم كبير ومحتوى كبير من النشا. في هذه الدراسة، نقدم طريقة بسيطة للقطع الجاف لإعداد قسم الراتنج الكامل بحجم البذور. يمكن لهذه التقنية إعداد المقاطع الشاملة الحجمة للبذور الكاملة المتقاطعة والطولية من البذور النامية والناضجة والمبتوتة والمضمروسة في راتنج LR White ، حتى بالنسبة للبذور الكبيرة ذات المحتوى العالي من النشا. يمكن أن يكون مقطع كامل بحجم البذور ملطخة مع الفلورسنت 28، اليود، وCoomassie الأزرق الرائع R250 ليعرض على وجه التحديد مورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا، والهيئات البروتين بوضوح، على التوالي. ويمكن أيضا أن يتم تحليل الصورة التي تم الحصول عليها كميا لإظهار المعلمات مورفولوجيا الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي البذور النباتية على مواد تخزين مثل النشا والبروتين وتوفر الطاقة والتغذية للناس. يحدد شكل وحجم وكمية الخلايا ومواد التخزين وزن ونوعية البذور. الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور لها morphologies مختلفة بشكل ملحوظ، وخاصة بالنسبة لبعض المحاصيل الحبوب عالية amylose مع تثبيط النشا المتفرعة إنزيم IIb1،2،3. لذلك ، من المهم جدًا التحقق من الصفات المورفورة للخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور.

البارافين هو طريقة جيدة لإعداد الجزء الكامل البذور الحجم ويمكن أن يعرض هيكل الأنسجة من البذور وتراكم مواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور4،5،6. ومع ذلك، فإن أقسام البارافين عادة ما يكون 6-8 μm سمك مع دقة منخفضة؛ وبالتالي ، فمن الصعب جدا أن نلاحظ بوضوح وتحليل كمي مورفولوجيا من المواد الخلية والتخزين. أقسام الراتنج وعادة ما يكون 1-2 μm سمك ودقة عالية ومناسبة جدا لمراقبة وتحليل مورفولوجيا من مواد الخلية والتخزين7. ومع ذلك، فإن طريقة تقسيم الراتنجات الروتينية تواجه صعوبة في إعداد القسم الكامل بحجم البذور، وخاصة بالنسبة للبذور ذات الحجم الكبير والمحتوى العالي من النشا؛ وهكذا، لا توجد طريقة لمراقبة وتحليل مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور. LR الراتنج الأبيض هو راتنج الاكريليك والمعارض اللزوجة المنخفضة والنفاذية القوية، مما يؤدي إلى تطبيقاته جيدة في إعداد قسم الراتنج من البذور، وخاصة بالنسبة الحبوب الحبوب ناضجة حبات مع حجم كبير وارتفاع محتوى النشا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ملطخة العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج الأبيض LR بسهولة مع العديد من الأصباغ الكيميائية لعرض بوضوح مورفولوجيا من الخلايا ومواد التخزين تحت ضوء أو المجهر الفلورسنت7. في ورقتنا السابقة، أبلغنا عن طريقة اقسام جافة لإعداد الأجزاء الكاملة بحجم البذور من حبات الحبوب الناضجة المضمنة في راتنج LR White. ويمكن لهذه الطريقة أيضا إعداد الجزء الكامل من البذور الحجم من تطوير، والنباتة والمطبوخة نواة الحبوب8. تم الحصول على كامل البذور الحجم القسم لديها العديد من التطبيقات في مجال الرصد والتحليل micromorphology ، وخاصة بالنسبة للعرض بوضوح وتحليل كمي الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور8،9.

هذه التقنية مناسبة للباحثين الذين يرغبون في مراقبة البنية المجهرية للأنسجة وشكل وحجم الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور باستخدام المجهر الخفيف. يمكن تحليل صور الأجزاء الكاملة بحجم البذور الملطخة خصيصًا لثناء الخلايا المعرضة وحبيبات النشا والهيئات البروتينية بواسطة برنامج تحليل المورفولوجيا لقياس المعلمات المورفولوجية للخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور. من أجل إظهار التطبيق التقني وتطبيقات القسم الكامل الحجم بالبذور ، قمنا بالتحقيق في البذور الناضجة من الذرة والبذور النباتية والاغتصاب وزراعة ، والنبات ، والحبوب من الأرز المطبوخ في هذه الدراسة. يحتوي البروتوكول على أربع عمليات. هنا، ونحن نستخدم نواة الذرة الناضجة، والتي هي الأكثر صعوبة في إعداد أقسام البذور الحجم كله بسبب حجم كبير وارتفاع محتوى النشا، كعينة لعرض العمليات خطوة بخطوة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- إعداد بذور الراتنج المضمّنة (الشكل 1)

  1. إصلاح ست حبات ناضجة الذرة في 10 مل من 2.5٪ من الغلوتارالدهيد الفوسفات المخزنة (0.1 M، pH7.2) في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. يمكن للباحثين اختيار الخلائط تثبيت أخرى، وتركيزات التثبيت، وظروف التثبيت وفقا لأهداف أبحاثهم وأنواع الأنسجة.
  2. أخرج حبات وشريحة لهم طوليا أو عرضية إلى 2-3 ملم سمك باستخدام شفرة حادة مزدوجة الجانب، وإصلاحها في 10 مل من 2.5٪ من الغلوتارالدهيد الفوسفات المخزنة (0.1 M، pH 7.2) مرة أخرى لمدة 48 ساعة.
  3. غسل العينات ثلاث مرات مع 10 مل من 0.1 M العازلة الفوسفات (pH 7.2) لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
  4. يجفف العينات في زيادة درجات من محلول الإيثانول مائي (10 مل) من 30% إلى 50%, 70%, 90% مرة واحدة, و 100% ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
  5. التسلل إلى العينات في 10 مل زيادة درجات من LR الأبيض راتنج حل المخفف مع الإيثانول من 25٪ إلى 50٪، 75٪ مرة واحدة، و 100٪ مرتين في 4 درجة مئوية ل12 ح في كل مرة.
  6. إعداد الرواد للعينات قبل التضمين. إضافة 0.25 مل من 100٪ LR الراتنج الأبيض في أنبوب الطرد المركزي 2-مل، وبلمرة عليه في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  7. على التوالي إضافة نقية LR الراتنج الأبيض (0.5 مل) والعينة تسللت إلى أنبوب الطرد المركزي مع قاعدة. قم بتقويم العينات باستخدام الإبرة التشريحية، وإضفاء البلمرة عليها عند 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 48 ساعة.

2. القطاعات الجافة لإعداد كامل البذور الحجم القسم (الشكل 1)

  1. أخرج حبات مدمجة من أنبوب الطرد المركزي وقطع الراتنج الزائد حول العينة باستخدام شفرة حادة.
  2. المشبك كتلة الراتنج في حامل العينة من ultramicrotome (م UC7)، وتقليم قبالة الراتنج زائدة عن الحاجة على سطح العينة وحول العينة مع شفرة.
  3. البولندية سطح العينة بدقة مع سكين الزجاج حتى يمكن تشكيل مقطع كامل.
  4. وضع خطاف نحاسي صغير حوالي 2 مم فوق حافة النصل قبل قطع العينة وقطعها إلى قسم 2 ميكرومتر. دور هوك هو تجنب الشباك صعودا من القسم.
  5. وضع ربط تحت المقطع لدعمه عندما يصبح المقطع طويل.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الماء على شريحة غير مُهدّمة، ونقل بعناية القسم الكامل وغير المنقطع إلى الماء مع الملاقط.
  7. من أجل تخفيف القسم التجاعيد، والحرارة وتجفيف العينة على طاولة التسوية في 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    1. إذا انهار القسم أو الدموع، تمديد الوقت لكل تسلل الراتنج من العينة من 12 ح إلى 24 ساعة أو 48 ساعة.
    2. إذا كان القسم لديه بعض خطوط موازية للسكين، المشبك كتلة عينة بإحكام. إذا كان القسم يحتوي على بعض الخطوط العمودية إلى السكين، يرجى استخدام سكين جديدة.

3- تلطيخ القسم ومراقبته

ملاحظة: من أجل مراقبة بنية الأنسجة ومورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا، والهيئات البروتينية، وصمة عار المقاطع مع بقع محددة وفقا لغرض البحث. هنا، ونحن نستخدم الفلورسنت 28، محلول اليود، وCoomassie الأزرق الرائع R250 لطخة جدران الخلية، حبيبات النشا، والهيئات البروتين، على التوالي.

  1. لمراقبة مورفولوجيا الخلايا، وصمة عار القسم مع 40 مل من 0.1٪ (ث / الخامس) الفلورسنت المضيء 28 محلول مائي في 70 مل الزجاج المضغوط تلطيخ جرة في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ومن ثم شطفه بالماء الجاري لمدة 5 دقائق. مراقبة وتصوير القسم تحت مجهر الفلوريسكين مجهز بكاميرا CCD.
  2. لمراقبة مورفولوجيا حبيبات النشا، وصمة عار القسم مع 40 ميكرولتر من محلول اليود (0.07٪ (ث / الخامس) أنا2 و 0.14٪ (ث / الخامس) KI في 25٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين) لمدة 1 دقيقة، وتغطي العينة التي تحتوي على محلول اليود مع يغطي. عرض وتصوير العينة تحت مجهر خفيف مزود بكاميرا CCD.
  3. لمراقبة مورفولوجيا أجسام البروتين، غمر القسم مع 40 مل من 10٪ (v/v) حمض الخليك في 70 مل من الزجاج المضغوط تلطيخ جرة لمدة 10 دقيقة في 45 درجة مئوية، ثم وصمة عار في 40 مل من 1٪ (ث / الخامس) Coomassie الأزرق الرائع R250 في 25٪ (V/ الخامس) ايزوبروبانول و 10٪ (الخامس / الخامس) حمض الخليك لمدة 15 دقيقة في 45 درجة مئوية. غسل المقاطع الملطخة بالماء الجاري لمدة 5 دقائق، وتجفيفه. مراقبة وتصوير القسم تحت مجهر خفيف مزود بكاميرا CCD.

4- التحليل الكمي لبارامترات المورفولوجيا

  1. عملية وتحليل كمي للصور التي تم تصويرها للمنطقة، والمحور الطويل / القصير، و roundness من الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور باستخدام برنامج تحليل مورفولوجيا (صورة برو زائد 6.0 البرمجيات) بعد إجراءات تشاو وآخرون9 بالضبط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم بذرة كاملة الحجم
نحن ننشئ طريقة بسيطة للقطع الجافة لإعداد قسم بذرة كاملة الحجم من البذور المضمنة في راتنج LR-أبيض (الشكل 1). ويمكن أن الطريقة إعداد المقاطع عرضية وطولانية كاملة البذور الحجم مع سمك 2 μm(الشكل 2-5، الشكل التكميلي 1-4). على سبيل المثال، يمكن تقسيم البذور الناضجة من الاغتصاب بذرة زيتية عرضية وطولية(الشكل 2). بالنسبة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والبذور هي أهم مورد متجدد للأغذية والأعلاف والمواد الخام الصناعية، وهي غنية بمواد التخزين مثل النشا والبروتين. المورفولوجيا وكمية الخلايا ومحتوى وتكوين مواد التخزين تؤثر على وزن ونوعية البذور7،12. على الرغم من أن تكنولوجيا علم المجسمات وتحليل الصور يمكن قياس حجم وكمية الخلايا في منطقة الأنسجة ، إلا أنها تفتقر إلى العديد من المختبرات. تعطي أقسام البارافين والراتنج صورة ثنائية الأبعاد ، مما يؤدي إلى عدم وجود طريقة في تحليل الحجم الحقيقي وكميات الخلايا. ومع ذلك، يتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (32071927)، ومشروع المواهب في جامعة يانغتشو وتطوير البرنامج الأكاديمي ذات الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليكسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA501931
جرة تلطيخ زجاجية مدمجة (5 أماكن)Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.E678013
Coomassie الأزرق اللامع R-250Sangon Biotech (شنغهاي) المحدودةA100472
CoverslipSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةF518211
شفرة على الوجهينجيليت شنغهاي المحدودة74-S الإيثانول
المطلق سانغون التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA500737
طاولة التسطيحLeicaHI1220
مجهر مضانأوليمبوسBX60
منير الفلورسنت 28Sigma-Aldrich910090
شرائط زجاجيةLeica840031
محلول Glutaraldehyde 50٪ في الماءSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A600875
الجلسرينسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA600232
اليودسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA500538
IsopropanolSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةA507048
المجهر الخفيفأوليمبوسBX53
LR الراتنج الأبيضأجارAGR1281A
العلمي شنغهاي جينغ هونغ مختبر الصك المحدودة9023A
يوديد البوتاسيومسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةA100512
الشريحةسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةF518101
ملاقطسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةF519022
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة دوديكاهيدراتسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة.A607793
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ثنائي الهيدراتسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة.A502805
UltramicrotomeLeicaEM UC7
فرن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LR White 28

مقالات ذات صلة