Method Article

التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية

DOI:

10.3791/61823

⸱

November 12th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, Inserm, Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences, University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel, Aix Marseille Univ

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف هذه المقالة إلى تقديم بروتوكول حول كيفية بناء مجهر التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (svFCS) لقياس الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث العمليات البيولوجية الديناميكية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تلك المرتبطة بتنظيم غشاء البلازما ، على نطاقات مكانية وزمنية مختلفة ، تتراوح من نانومتر إلى ميكرومتر وميكروثانية إلى دقائق ، على التوالي. مثل هذه المجموعة الواسعة من العمليات البيولوجية تتحدى نهج الفحص المجهري التقليدية. هنا ، نفصل الإجراء الخاص بتنفيذ قياسات التحليل الطيفي لارتباط التألق الموضعي (svFCS) باستخدام مجهر فلوري كلاسيكي تم تخصيصه. يتضمن البروتوكول فحصا محددا لأداء إعداد svFCS والمبادئ التوجيهية لقياسات الانتشار الجزيئي بواسطة svFCS على الغشاء البلازمي للخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، نحن نقدم إجراء لتعطيل المجالات النانوية لطوف غشاء البلازما عن طريق علاج أوكسيديز الكوليسترول ونوضح كيف يمكن الكشف عن هذه التغييرات في التنظيم الجانبي لغشاء البلازما من خلال تحليل svFCS. في الختام ، يمكن لهذه الطريقة القائمة على التألق أن توفر تفاصيل غير مسبوقة حول التنظيم الجانبي لغشاء البلازما بدقة مكانية وزمنية مناسبة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعقيد تنظيم غشاء البلازما
يجب أن يأخذ الفهم الحالي لتنظيم غشاء الخلية في الاعتبار عدة جوانب1. أولا ، يختلف تكوين الدهون المعقدة ليس فقط بين أنواع الخلايا ، ولكن أيضا داخل خلية واحدة (عضيات الغشاء / غشاء البلازما). إلى جانب ذلك ، يتم تنظيم بروتينات الغشاء المرتبطة أو الجوهرية في الغالب في مجمعات ديناميكية متعددة الوسائط ، مع نطاقات كبيرة تمتد خارج الغشاء ، وهو ما يمثل مساحة أكبر بكثير من تلك الموجودة في المجالات عبر الغشاء وحدها. علاوة على ذلك ، تظهر البروتينات المرتبطة بالأغشية قدرات محددة على ربط الدهون أو تفاعل الدهون تلعب أدوارا في تنظيم وظيفة البروتين. هذه تعتمد بشكل مباشر على التركيب المحلي وإمكانية الوصول إلى الدهون2.

أخيرا ، لوحظ وجود مستوى كبير من عدم التماثل بين منشورين غشائيين بسبب البنية غير المتماثلة الجوهرية لبروتينات الغشاء وتوزيع الدهون. في الواقع ، فإن التوازن الأيضي للدهون بين التوليف والتحلل المائي ، جنبا إلى جنب مع الوجه الدهني بين المنشورات ، يولد مثل هذا التوزيع غير المتماثل. نظرا لأن أي نقل عبر الطبقة الثنائية مقيد بالطاقة الحرة اللازمة لتحريك مجموعة الرأس القطبية عبر الجزء الداخلي الكارهة للماء من الأغشية ، فإنه عادة ما يتم مساعدته بواسطة ناقلات انتقائية. لكل نوع من أنواع الخلايا ، يميل عدم التماثل إلى الحفاظ عليه بقوة. إجمالا ، تساهم هذه العوامل في عدم التجانس الجانبي أو تجزئة غشاء البلازما 3,4.

نحن نثري هذا التمثيل لغشاء البلازما من خلال مراعاة الانتشار الجزيئي الجوهري داخل الطبقة الثنائية وعبرها ، مما يساهم في عدم التجانس الجانبي الديناميكي على مقياس من أعشار إلى مئات النانومترات وميكروثانية إلى ثوان. على سبيل المثال ، تساهم المجالات النانوية الغشائية المعتمدة على الدهون - ما يسمى طوافات الدهون ، التي تعرف بأنها الكوليسترول ، ومنصات الإشارات الغنية بالدهون السفينغولية - في تجزئة غشاء البلازما 5,6. ومع ذلك ، فإن وجهة النظر الحالية لتنظيم الأغشية لا تقتصر على طوافات الدهون وحدها. المجالات النانوية الغشائية أكثر تعقيدا وغير متجانسة في التركيب والأصل والوظيفة. ومع ذلك ، يجب تنسيق وجودها في غشاء البلازما بإحكام ، ويبدو أن التفاعلات الديناميكية بين البروتينات والدهون مهمة في التوزيع المكاني والتعديل الكيميائي للمجالات النانوية الغشائية1،3،7،8.

مبدأ svFCS وتطبيقه للتحقيق في تنظيم غشاء البلازما
وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في تحليل مجالات الأغشية، وذلك أساسا من خلال التقنيات البيوفيزيائية، فإن المحددات التي تملي التنظيم المحلي للغشاء البلازمي تحتاج إلى تنقيح بدقة مكانية وزمنية مناسبة. توفر المحددات القائمة على تتبع الجزيئات الفردية دقة مكانية ممتازة وتسمح بتوصيف أوضاع مختلفة من الحركة9،10،11،12 ، ولكن لها دقة زمنية محدودة مع معدلات إطارات الكاميرا المنخفضة الكلاسيكية وتتطلب المزيد من الجهد التجريبي لتسجيل عدد كبير من المسارات. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم معامل انتشار مكونات الغشاء بواسطة Fluorescence Recovery After Photoblaching (FRAP)13 أو Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. وقد حظي هذا الأخير بمزيد من الاهتمام ، ويرجع ذلك أساسا إلى حساسيته العالية وانتقائيته ، وحجم الكشف المجهري ، وانخفاض الغزو ، والنطاق الديناميكي الواسع15.

تم تقديم الأساس المفاهيمي ل FCS من قبل Magde وزملاؤه منذ حوالي 50 عاما16,17. وهو يعتمد على تسجيل تذبذب انبعاثات التألق بدقة زمنية عالية (من μs إلى s)18. في نسخته الحديثة ، يتم إجراء القياسات في الخلايا الحية بواسطة حجم إثارة صغير متحد البؤرة (~ 0.3 فيمتولتر) يتم وضعه داخل منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال ، في غشاء البلازما) ؛ يتم جمع إشارة التألق الناتجة عن نشر جزيئات الفلورسنت الداخلة والخارجة من حجم الملاحظة بدقة زمنية عالية جدا (أي وقت وصول كل فوتون على الكاشف). بعد ذلك ، يتم حساب الإشارة لتوليد دالة الارتباط الذاتي (ACF) ، والتي يتم من خلالها استخراج متوسط الوقت td (وقت الانتشار) الذي يبقى فيه الجزيء داخل الحجم البؤري ، إلى جانب متوسط عدد الجسيمات ، (N) ، الموجود في حجم الملاحظة ، والذي يتناسب عكسيا مع سعة ACF. قد تكون هذه المعلمة الأخيرة معلومات مفيدة عن تركيز الجزيء داخل حجم الملاحظة.

ومنذ ذلك الحين، تم تنفيذ عدد متزايد من طرائق FCS بفضل الأجهزة سريعة التطور في الضوئيات الحيوية، مما يسمح بوصف الظواهر الديناميكية التي تحدث في النظم الحية. ومع ذلك ، فإن الأنواع الجزيئية ستشهد توزيعا أكثر تداخلا لقيم معامل الانتشار ، والذي ينعكس عادة من خلال خاصية الانتشار الشاذة ، حيث تنتشر الجزيئات بعلاقة غير خطية في الوقت19 ، وصعوبة في تحديد المعنى البيولوجي لهذا الانتشار الفرعي الشاذ. في الماضي ، تم التغلب على هذه الصعوبة إلى حد ما عن طريق تسجيل الانتشار الجزيئي بواسطة FRAP من مناطق ذات أحجام مختلفة ، بدلا من منطقة واحدة فقط ، وبالتالي توفير معلومات مكانية إضافية. وقد مكن ذلك ، على سبيل المثال ، من تصور المجالات الدقيقة الغشائية20،21،22.

وقد أنشئت ترجمة لهذه الاستراتيجية إلى قياسات FCS (أي ما يسمى بالتحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي (svFCS)) عن طريق تغيير حجم الحجم البؤري للرصد، مما يسمح بتسجيل التذبذب في التألق على مقاييس مكانية مختلفة23. وبالتالي ، يوفر نهج svFCS معلومات مكانية غير مباشرة تسمح بتحديد وتحديد أنماط الانتشار الجزيئي ونوع تقسيم الغشاء (المجالات المعزولة مقابل المجالات المتجاورة24) للجزيئات المدروسة. من خلال رسم زمن الانتشار td كدالة لمختلف المقاييس المكانية المحددة بقيمة الخصر (ω) ، والتي تتوافق مع حجم نصف قطر شعاع الكشف في هذه الحالة23,25 ، يمكن للمرء أن يميز قانون الانتشار لجزيء معين في حالة فسيولوجية معينة. وبالتالي ، فإن svFCS هو تناظرية مثالية لتتبع الجسيمات المفردة في المجال الزمني26. في ظل قيود الانتشار البراوني ، ينبغي للمرء أن يتوقع علاقة خطية صارمة بين وقت الانتشار td والخصر ω (الشكل 1)23,25. يمكن أن يعزى أصل انحراف قانون الانتشار عن هذا المخطط إلى أسباب غير حصرية ، مثل شبكة الهيكل الخلوي ، أو الازدحام الجزيئي ، أو التقسيم الديناميكي في المجالات النانوية ، أو أي مزيج من هذه التأثيرات وغيرها (الشكل 1) ، ويجب اختبارها تجريبيا25.

هنا نقدم جميع نقاط التفتيش اللازمة للتحكم للاستخدام اليومي لنظام بصري svFCS مخصص مبني من الصفر ، والذي يكمل مراجعات البروتوكول السابقةلدينا 27,28 على هذا النهج التجريبي. علاوة على ذلك ، كدليل على المفهوم ، نقدم إرشادات بشأن معايرة الإعداد ، وإعداد الخلايا ، والحصول على البيانات ، وتحليلها لإنشاء قانون انتشار svFCS (DL) ل Thy1-GFP ، وهو بروتين مثبت على غشاء البلازما glycosylphosphatidylinositol ، والذي يعرف بأنه موضعي في المجالات النانوية لطوافة الدهون29. أخيرا ، نوضح كيف يؤثر زعزعة الاستقرار الجزئي للمجالات النانوية لطوافة الدهون بواسطة علاج أوكسيديز الكوليسترول على خصائص انتشار Thy1-GFP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف مفصل لبناء إعداد svFCS من الصفر في المواد التكميلية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المواصفات لتجميع إعداد svFCS حسب الطلب

ملاحظة: تسمح بساطة إعداد svFCS المقترح بسهولة التركيب والتشغيل والصيانة بتكلفة منخفضة مع ضمان الكفاءة في استرداد الفوتون. لمزيد من التفاصيل، راجع المواد التكميلية.

  1. غرفة تجريبية وسلامة
    1. قم بتثبيت النظام في غرفة مستقرة عند حوالي 21 درجة مئوية.
    2. تجنب تدفق الهواء المباشر على الطاولة البصرية السلبية (أو النشطة) واتبع قواعد السلامة بالليزر للمحاذاة البصرية.
  2. الأجهزة والبرامج
    ملاحظة: تفصل المواد التكميلية خطوات التثبيت الموضحة في الشكل 2.
    1. اكتب برنامج الاستحواذ والتحكم الرئيسي في LabVIEW باستخدام بنية آلة الحالة وهيكل الحدث حيث تقوم لوحة الاستحواذ متعددة الوظائف بتشغيل معظم وحدات التحكم.
      ملاحظة: يتم التحكم في جهاز الارتباط والليزر وعداد الطاقة أو مراقبته بواسطة البرامج الخاصة به.
    2. قم بتكييف إجراءات تثبيت الأجهزة والبرامج وفقا للأجهزة المستخدمة.
  3. الإعداد البصري
    ملاحظة: يوضح الشكل 3 وحدات المقاعد البصرية المستخدمة في الأقسام التالية للتحكم في جودة المحاذاة البصرية. يتم سرد جميع مواصفات العناصر البصرية في جدول المواد. يتم تفصيل إجراء إنشاء الإعداد على نطاق واسع في المواد التكميلية. يتكون هذا النظام من ليزر موجة مستمرة ، ومجهر مقلوب بمحرك مجهز بهدف غمر الماء ، وكاشف الصمام الثنائي الضوئي للانهيارات الثلجية إلى جانب وحدة عد فوتون واحدة ، وارتباط الأجهزة. تم تصميم غرفة حضانة المجهر مع سخانات خالية من الاهتزاز خصيصا للتحكم في درجة الحرارة للتجارب على الخلايا الحية. وفقا للاصطلاح، يتوافق محور XY مع المستوى العمودي للمسار البصري، ويتوافق المحور Z مع المسار البصري.

2. نقطة تفتيش يومية قبل إجراء التجربة

  1. التحكم في مسار الإثارة (الشكل 3 ، figure-protocol-1 و figure-protocol-2).
    1. افتح جميع أغشية القزحية.
    2. قم بقياس طاقة الليزر باستخدام عداد الطاقة ، مع الحفاظ على القزحية الأولى مفتوحة بالكامل.
    3. أدر اللوحة نصف الموجية (HWP) للعثور على الطاقة القصوى.
    4. تحقق من المحاذاة باستخدام القزحية إذا كانت طاقة الليزر أقل من المعتاد ، وحرك L1 و M1 بالتناوب ، إذا لزم الأمر.
    5. لاحظ قيمة الطاقة في دفتر ملاحظات مختبر التجربة.
  2. التحكم في مسار الكشف (الشكل 3 ، figure-protocol-3 و figure-protocol-4).
    1. ضع الماء وغطاء وقطرة من محلول 2 نانومتر رودامين 6G (Rh6G) على الهدف.
    2. إذا كانت إشارة التألق (رقم العد على APD ، المسجل باستخدام برنامج LabVIEW) أقل من المعتاد ، فأعد إنشاء حل Rh6G ، وتحقق من تحديد المواقع ورقم الغطاء على العدسة الموضوعية ، أو قم بإزالة الفقاعات ، إن وجدت.
      1. إذا كانت إشارة التألق لا تزال أقل من المعتاد ، فضع عداد الطاقة داخل المسار البصري لحجب الشعاع.
      2. قم بإيقاف تشغيل APD (فيما يلي ، يشير APD إلى APD ووحدة عد الفوتون المفرد).
      3. قم بإزالة العينة.
      4. قم بتنظيف العدسة الموضوعية واستبدالها بهدف عاكس.
      5. تحقق من شعاع الليزر على الهدف العاكس عن طريق إزالة عداد الطاقة من مسار الضوء. تأكد من أن شعاع الهدف متمركز ، وأن الانعكاس الخلفي يصل إلى القزحية الأولى على الخط figure-protocol-5 (الشكل 3).
      6. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط موضع المركز باستخدام M2 أو الانعكاس الخلفي باستخدام المرآة ثنائية اللون.
      7. إذا كان اقتران المجهر صحيحا ، فادفع العدسة الموضوعية إلى الخلف ، وأضف قطرة ماء ، وغطاء ، وقطرة من محلول Rh6G أكثر تركيزا (أي 200 نانومتر) ، وقم بتعيين طاقة ليزر أقل من القياسات الكلاسيكية (عدد قليل من μW).
      8. قم بتشغيل APD وتحسين محاذاة APD والثقب، بالتناوب، باستخدام مسامير ضبط XYZ الخاصة بكل منهما أثناء مراقبة إشارة الكثافة (برنامج LabVIEW).
      9. قم بتغيير الغطاء وإضافة تركيز أقل من Rh6G (2 نانومتر). حرك الثقب على طول المحور Z للعثور على موضع تزداد فيه نسبة السطوع الجزيئي ، ويكون الخصر في الحد الأدنى.
      10. أغلق القزحية حتى تسقط الإشارة: يصل حجم شعاع الليزر إلى حجم الفتحة الخلفية للهدف (أي الحد الأدنى لحجم الخصر ، انظر المواد التكميلية).
      11. قم بتشغيل برنامج الارتباط وتسجيل البيانات (انظر القسم 7 لتسجيل البيانات).
      12. تحقق من ACF ، الذي يجب أن يعرض كمية منخفضة من الضوضاء ، ويعطي حجم خصر صغير ، ومعدل عد مرتفع لكل جزيء في الثانية (انظر القسم 7 لتحليل البيانات وتقييم حجم الخصر).

3. اعتبارات عامة لتسجيل وتحليل بيانات svFCS

  1. تسجيل وتحليل بيانات التألق بعد هذا المخطط العام (انظر الأقسام 7 و 8 و 9): (1) تسجيل التألق وتوليد ACF (برنامج الارتباط) ، (2) التخلص غير المتوقع من البيانات ، متوسط البيانات المحتفظ بها ، بما يتناسب مع النموذج المناسب (مع برنامج Igor Pro محلي الصنع) ، (3) مخطط قانون الانتشار (برنامج MATLAB محلي الصنع 1) ، و (4) مقارنة قانون الانتشار الاختياري (برنامج MATLAB محلي الصنع 2). تتوفر البرامج المختلفة عند الطلب.
    ملاحظة: يحتوي جهاز ربط الأجهزة على وقت أخذ عينات لا يقل عن 12.5 نانو ثانية (أي تردد أخذ العينات 80 ميجاهرتز). إنه يوفر دقة زمنية أقل ب 1000 على الأقل من وقت الإقامة النموذجي للجزيء الصغير المنتشر بحرية في المحلول و 106 أصغر من وقت انتشار بروتينات الغشاء داخل حجم مراقبة متحد البؤرة.

4. زراعة الخلايا ونقلها

  1. قم بزرع خلايا Cos7 في زجاج مغطى ب 8 غرف مع قاع زجاجي من البورسليكات # 1.0 بكثافة 10000 خلية / بئر باستخدام وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) مع 5٪ من مصل البقر الجنيني ، والبنسلين (100 U / mL) ، والستربتومايسين (100 U / mL) ، و L-glutamine (1 mM).
  2. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  3. قم بإزالة الوسط ، وأضف 300 ميكرولتر من وسط الثقافة الكاملة الطازجة لكل بئر ، واحتضن الخلايا مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. تمييع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ترميز بروتين Thy-1 المنصهر مع eGFP25 في 50 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل. دوامة لفترة وجيزة للخلط.
  5. قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من كاشف نقل الحمض النووي في 50 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل ، واخلط المحلول جيدا.
  6. أضف كاشف النقل المخفف مباشرة إلى محلول الحمض النووي المحضر ، واخلط المركبات على الفور.
  7. احتضن الخليط المحضر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. أضف 10 ميكرولتر من مجمعات كاشف الحمض النووي / النقل مجتمعة على الوسط في كل بئر ، وتجانس عن طريق تدوير اللوحة بلطف.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات.
  10. بعد الحضانة ، استبدل الوسط الذي يحتوي على مجمعات كاشف الحمض النووي / النقل ب 400 ميكرولتر من DMEM الكامل الطازج ، واستزرع الخلايا لمدة 16 ساعة قبل تجربة svFCS.

5. إعداد الخلايا لقياسات svFCS

  1. إزالة الوسط الثقافي.
  2. اغسل الخلايا بلطف مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام محلول الملح المتوازن الخالي من المصل من هانك (HBSS) الذي يحتوي على Ca 2+ و Mg2+ مع استكمال 10 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) (HEPES) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (HBSS / HEPES).
  3. الحفاظ على الخلايا في المخزن المؤقت HBSS / HEPES خلال جميع عمليات الاستحواذ على svFCS.

6. العلاج الدوائي

  1. قم بإزالة وسط المزرعة ، واغسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام HBSS الخالي من المصل مع 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (HBSS / HEPES).
  2. احتضن الخلايا ب 1 U / mL من محلول أوكسيديز الكوليسترول (COase) في المخزن المؤقت HBSS / HEPES لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بإزالة المحلول ، وحافظ على الخلايا في وجود 0.1 U / mL من COase في المخزن المؤقت HBSS / HEPES أثناء إجراء قياسات svFCS.

7. معايرة حجم البقعة

  1. قم بتسخين غرفة المجهر عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محلول قياسي 2 نانومتر من Rh6G عن طريق التخفيف التسلسلي.
  3. قم بإسقاط 200 ميكرولتر من محلول 2 nM Rh6G على غطاء زجاجي يوضع على هدف الغمر بالماء.
  4. بدء تشغيل كافة الأجهزة والبرامج.
  5. قياس وضبط طاقة شعاع الليزر 488 نانومتر إلى 300 ميكروواط. اعتمادا على السطوع والاستقرار الضوئي لمسبار الفلورسنت المستخدم ، قم بتكييف هذه الطاقة وفقا ل (1) شدة التألق (على برنامج LabVIEW) ، والتي يجب أن تكون مستقرة ، (2) شكل ACF (على برنامج الارتباط) ، والذي يجب أن يكون له شكل ثابت بمرور الوقت ، و (3) المعلمات المناسبة التي تعطي حجم خصر صغير ومعدل عد مرتفع لكل جزيء (فوتونات لكل جزيء في الثانية ، وعادة ما تكون بضع عشرات إلى مئات الفوتونات لكل جزيء في الثانية).
    ملاحظة: تتناسب سعة ACF (تسمى G(0)) عكسيا مع عدد الجزيء (أي تركيز مسبار الفلورسنت). بالنسبة لمعايرة حجم الخصر ، هذه معلمة مرشحة جيدة لمراقبة الجودة. لذلك ، يجب أن يكون G (0) مشابها لنفس التركيز من يوم لآخر لأنه يربط بين حجم الخصر والتركيز. بالنسبة لقياسات الخلايا ، نظرا لأن FCS أكثر دقة للتركيز المنخفض ، يجب أن يكون G (0) مرتفعا لاستخراج المعلمة المناسبة.
  6. اضبط منفذ مجهر الإضاءة/الكشف svFCS باستخدام برنامج LabVIEW.
  7. قم بتشغيل APD.
  8. أغلق القزحية حتى تسقط الإشارة للحصول على الحد الأدنى من حجم الخصر ، أو أغلقها للحصول على حجم خصر أكبر.
  9. سجل العديد من ACFs لمدة محددة (أي تشغيل) لتحسين قابلية التكرار الإحصائي ، وعادة ما تستمر 10 أشواط لمدة 20 ثانية لكل منها باستخدام برنامج الارتباط.
  10. أوقف تشغيل APD.
  11. استخدم برنامج Igor Pro للتحقق من عمليات التشغيل والتخلص منها مع تقلبات قوية بسبب المجاميع الجزيئية. نفذ هذه الخطوة يدويا - يجب أن تكون مستقلة عن المستخدم بعد تدريب المستخدمين.
  12. تناسب متوسط ACFs المحتفظ بها مع نموذج نشر 3D.
  13. استخراج متوسط وقت figure-protocol-6 الانتشار من معلمات التركيب وحفظه في ملف ".txt" (يتم إملاء تنسيق الملف بواسطة برنامج Igor Pro).
  14. تحقق من معدل العد لكل جزيء في الثانية (مؤشر أداء جيد) عن طريق قسمة متوسط الكثافة (المستخرجة من أثر التألق) على عدد الجزيئات (المستخرجة من ACF).
    ملاحظة: تأكد من أن هذه القيمة عالية ومستقرة من يوم لآخر لنفس معلمات الاستحواذ.
  15. معرفة معامل انتشار Rh6G في محلول مائي عند 37 درجة مئوية (D) و figure-protocol-7 (انظر 7.13) ، احسب حجم الخصر التجريبي ω وفقا لما يلي: figure-protocol-8.
  16. تطبيق الإجراء الخاص بكل تعديل في حجم الخصر مطلوب لرسم قانون انتشار FCS وقبل أي سلسلة تجريبية جديدة من الحصول على بيانات svFCS.

8. عمليات الحصول على بيانات svFCS على الخلايا

  1. قم بقياس وضبط طاقة شعاع 488 نانومتر بين 2 و 4 ميكروواط. اعتمادا على السطوع والاستقرار الضوئي لمسبار الفلورسنت المستخدم ، قم بتكييف هذه الطاقة للسماح بمعدل عد مرتفع لكل جزيء (عادة عدة آلاف من الفوتونات لكل جزيء في الثانية) ، مع الحفاظ على التبييض الضوئي منخفضا (أي تتبع كثافة مستقر على برنامج LabVIEW).
  2. قم بموازنة العينات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل بدء القياسات.
  3. اضبط مجهر الإضاءة فوق الفلورية باستخدام برنامج LabVIEW.
  4. اختر خلية ذات موقع مسبار فلورسنت مناسب وكثافة إشارة فلورية (منخفضة).
    ملاحظة: كلما انخفض التألق ، كانت قياسات FCS أفضل (انظر الخطوة 8.1).
  5. اضبط منفذ مجهر الإضاءة/الكشف svFCS باستخدام برنامج LabVIEW.
  6. قم بتشغيل APD.
  7. قم بإجراء فحص xy-scan للخلية المحددة باستخدام برنامج LabVIEW.
  8. قم بإجراء مسح ضوئي وتحديد موقع البقعة البؤرية عند أقصى كثافة تألق عن طريق اختيار غشاء البلازما في الأعلى وابدأ في الحصول على البيانات. لتحقيق أقصى قدر من الفصل بين الغشاءين ، يفضل إجراء المسح الضوئي في المنطقة النووية للخلية.
  9. سجل سلسلة واحدة من 20 عملية تشغيل تدوم لمدة 5 ثوان ، كل منها باستخدام برنامج الارتباط.
    ملاحظة: تأكد من أن مدة كل تشغيل طويلة بما يكفي للحصول على ACFs مع انخفاض الضوضاء. عمليات الاستحواذ الطويلة عرضة للتبييض الضوئي أو الاختلافات الكبيرة غير المتوقعة (على سبيل المثال ، المجاميع). قم بتكييف عدد مرات التشغيل ومدتها وعدد السلاسل مع العينات، ولكن تأكد من بقائها ثابتة داخل نفس الجزء الأكبر من التجارب من أجل التكرار.
  10. أوقف تشغيل APD.
  11. تجاهل عمليات التشغيل غير المتوقعة باستخدام برنامج Igor Pro.
  12. تناسب متوسط ACF مع نموذج انتشار 2D من نوعين. قم بتكييف هذا النموذج مع نوع سلوك الانتشار للجزيء المستهدف.
  13. احفظ معلمات التركيب في الملف السابق (راجع الخطوة 7.13).
  14. قم بإجراء 10 إلى 15 سلسلة من التسجيلات على 10 خلايا مختلفة على الأقل، وأعد إنتاج الخطوات من 8.3 إلى 8.13. تحقق من أن الملف الفردي الذي تم الحصول عليه يحتوي على معلومات حجم الخصر والمعلمات المناسبة للتسجيلات 10-15.
  15. لإنشاء قانون انتشار واحد ، قم بتحليل أربعة أحجام خصر على الأقل تتراوح بين 200 و 400 نانومتر. يتم تعريف هذا النطاق بواسطة الحد البصري للحيود ، ولكنه يعتمد على الهدف (الفتحة العددية) والليزر (الطول الموجي).
    ملاحظة: نظرا لأن معايرة حجم الخصر ليست مطلقة ولديها درجة معينة من عدم اليقين ، فقد تم بناء برنامج MATLAB28 المخصص الذي يمثل الخطأ x و y (أي ω2 و td) ليناسب قانون الانتشار.
  16. ابدأ تشغيل برنامج MATLAB 1 وحدد مجلدا يحتوي على جميع ملفات ".txt" المقابلة لأربع تجارب بحجم الخصر على الأقل.
  17. المؤامرة <td> مقابل <ω2> ، أي قانون الانتشار. يمكن استخراج معلمتين رئيسيتين: اعتراض المحور y (t0) ومعامل الانتشار الفعال (Deff ، يتناسب عكسيا مع المنحدر).

9. قوانين الانتشار لمقارنة الحالات التجريبية المختلفة

ملاحظة: إذا لزم الأمر، أعد إنتاج القسمين 7 و8 لظروف تجريبية مختلفة. تم تطوير برنامج مخصص (MATLAB software 2) لتحديد ما إذا كانت قوانين الانتشار هذه متشابهة أم لا وفقا لقيم t0 و Deff 28. يختبر فرضيتين: القيمتان مختلفتان ، أو أن القيمتين لا تختلفان عند عتبة محددة فوق احتمال الإنذار الكاذب (PFA). تعتبر قيمة PFA التعسفية البالغة 5٪ (T = 3.8) الحد الأعلى للأهمية بين معلمتين (t0 أو Deff) ، مما يشير إلى أن هناك فرصة بنسبة 5٪ فقط لأن تكون القيمتان متطابقتين.

  1. قم بإنشاء ملف ".xls" يحتوي على قيم قانون الانتشار المميزة لكل شرط للمقارنة (أي ملف يحتوي على خطأ t 0 و t0 وخطأ D eff و Deff للظروف غير المعالجة (NT) والمعالجة (COase) كجدول).
    1. بدء تشغيل برنامج MATLAB 2.
    2. حدد ملف ".xls".
    3. قم بتحليل مخطط 2D المرمز بالألوان الذي تم إنشاؤه ، حيث سيتم رسم الاختبارات الإحصائية t0 و Deff على المحورين x و y ، على التوالي (الشكل 4). كلما كان T أعلى ، كلما زاد الفرق بين القيم المقارنة.

10. قياسات تركيز الكوليسترول

  1. علاج الخلايا وتحللها
    1. زرع خلايا Cos7 في ثلاثة أضعاف في لوحات 6 آبار في 4 × 10 5 خلايا / بئر وحضانة في 2 مل من DMEM الكامل في 37 درجة مئوية مع5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق باللوحة.
    2. قم بإزالة وسط المزرعة واغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت HBSS/HEPES الذي يحتوي على (أو لا، للضوابط) 1 U/mL من Coase، واحتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    4. استبدل الوسط ب 1 مل من HBSS / HEPES يحتوي على 0.1 U / mL من Coase ، واحتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    5. إزالة الحل وحصاد الخلايا.
    6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. قم بتحليل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي (25 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 150 mM NaCl ، 1٪ NP40 ، 10 mM ، MgCl 2 ، 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid ،2٪ glycerol ، protease و phosphatase inhibitor cocktail) لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    8. الطرد المركزي لليسات في 10000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع supernatant.
  2. حدد تركيز البروتين الكلي لكل عينة عن طريق فحص بروتين برادفورد المعدل باستخدام محلول العمل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  3. قياس تركيز الكوليسترول
    1. لتحديد مستوى الكوليسترول الخلوي الكلي إنزيميا ، استخدم المجموعة المناسبة (على سبيل المثال ، Amplex Red Cholesterol Assay Kit) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    2. لكل تفاعل ، امزج العينة التي تحتوي على 5 ميكروغرام من البروتين مع محلول عمل كاشف Amplex Red / بيروكسيديز الفجل / أوكسيديز الكوليسترول / إستراز الكوليسترول ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
    3. قم بقياس التألق باستخدام إثارة 520 نانومتر ، واكتشف الانبعاثات عند 560-590 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
    4. اطرح الخلفية من القيمة النهائية ، وحدد تركيز الكوليسترول باستخدام منحنى قياسي.
    5. احسب محتوى الكوليسترول النهائي بالنانوغرام من الكوليسترول لكل ميكروغرام من البروتين.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أنشأنا DL ل Thy1-GFP معبرا عنه في خلايا Cos-7 (الشكل 4 ، المربعات السوداء). يحتوي قانون الانتشار على قيمة t0 موجبة (19.47 مللي ثانية ± 2 مللي ثانية) ، مما يشير إلى أن Thy1-GFP محصور في هياكل المجال النانوي لغشاء البلازما. أدى علاج أوكسيديز الكوليسترول للخلايا التي تعبر عن Thy1-GFP إلى تحول قيمة DL t0 إلى 7.36 ± 1.34 مللي ثانية (الشكل 4 ، المربعات الرمادية). تؤكد هذه الملاحظة أن طبيعة حبس Thy1-GFP تعتمد على محتوى الكوليسترول وترتبط بالمجالات النانوية لطوافة الدهون. يظهر أن هذين القانونين للانتشار مختلفان وفقا للاختبار الإحصائي الموصوف أعلاه (انظر الخطوة 9.1.3) من حيث قيم t0 و Deff . بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتقييم تركيز الكوليسترول الخلوي الكلي في خلايا Cos-7 غير المعالجة مقابل الخلايا المعالجة ب COase. لوحظ انخفاض صغير ، ولكنه كبير ، في إجمالي محتوى الكوليسترول عند علاج COase (الشكل 5). نظرا لأن هذا الإنزيم يعمل فقط على تجمع الكوليسترول الذي يمكن الوصول إليه في النشرة الخارجية لغشاء البلازما ، فإننا نفترض أن الانخفاض الملحوظ في الكوليسترول يرتبط فقط بغشاء البلازما ويؤدي إلى زعزعة استقرار المجالات النانوية لطوف الدهون.

figure-results-1
الشكل 1: قوانين الانتشار الطيفي المحاكي لارتباط التألق (FCS) التي وضعتها FCS ذات التباين الموضعي لأشكال مختلفة من تنظيم الأغشية. (اللوحات العلوية) تمثيل تخطيطي لتنظيم الغشاء - (أ) الانتشار الحر ، (ب) حواجز الشبكة ، و (ج) حبس / مجال - مع المسار المرسوم لجزيء واحد (أحمر). تشير الدوائر الزرقاء إلى تقاطع الغشاء وشعاع الليزر للخصر ω. (اللوحات السفلية) قوانين انتشار FCS ممثلة برسم زمن الانتشار td كدالة لنصف القطر التربيعي ω2. يعترض إسقاط قانون الانتشار (الخط الأخضر المتقطع) محور الوقت عند (أ) الأصل (t 0 = 0) في حالة الانتشار الحر ؛ (B) في المحور السالب (t 0 < 0) عندما تكون هناك حواجز شبكية ، أو (C) في المحور الموجب (t 0 > 0) عندما تكون هناك مصائد ومجالات (طوافات دهنية). D هو معامل الانتشار الجانبي للحركة البراونية. Deff ، معامل الانتشار الفعال ؛ Dmicro ، معامل الانتشار المجهري داخل مصائد الشبكة ؛ Dفي ، معامل الانتشار داخل المجالات ؛ (د) معامل الانتشار خارج المجالات؛ L ، حجم جانب المجال المربع ؛ و rD ، نصف قطر المجال الدائري. تم تعديل هذا الرقم من هو ومارجيت6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عرض تخطيطي للتحكم في أجهزة svFCS. يتحكم الكمبيوتر في جميع الأجهزة من خلال بروتوكولات اتصال مختلفة: تسلسلي (مجهر ، مصراع خارجي) ، USB (مرحلة كهرضغطية XYZ ، مربط) ، و PCI (لوحة الاستحواذ). DAQ: لوحة الحصول على البيانات ، APD: الصمام الثنائي الضوئي للانهيار الجليدي ، SPCM: وحدة عد الفوتون الواحد ، DO: الإخراج الرقمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: عرض تخطيطي للمسارات البصرية للإثارة والانبعاثات لإعداد svFCS. يحتوي إعداد svFCS على أربع وحدات: (1) يتم تجميع إخراج ليزر 488 نانومتر من الألياف ، (2) مزيج من صفيحة نصف موجة ومقسم شعاع استقطاب يحدد الطاقة البصرية ، (3) شعاع الليزر الذي يركز على العينة بعد السفر عبر مجهر آلي خال من العدسة الأنبوبية ، و (4) يتم اكتشاف التألق من خلال مسار كشف يشبه الخلط على صمام ثنائي ضوئي انهيار جليدي مقترن بوحدة عد فوتون واحدة ، الذي يسلم إشارة إلى جهاز ربط الأجهزة. البساطة تعطي النظام حساسيته ومتانته وسهولة استخدامه (تم التعليق عليه على نطاق واسع في المواد التكميلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: قوانين انتشار svFCS الناتجة عن تحليل انتشار Thy1-GFP المعبر عنها في Cos-7. قوانين انتشار svFCS لخلايا Cos-7 بدون علاج (NT ، المربعات السوداء) وبعد علاج أوكسيديز الكوليسترول (COase ، الدوائر الرمادية). يمثل الإدراج في الرسم البياني اختبارا إحصائيا لفرق كبير بين قانوني انتشار svFCS المقدمين (وفقا ل Mailfert et al.28). يجب أن تكون قيمة الاختبار (T) أعلى من العتبة المحددة عند 3.8 عندما يكون كلا قانوني الانتشار مختلفين. كلما كان أعلى ، كلما زاد الفرق بين قوانين الانتشار. قيمة T مرمزة بالألوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: مقارنة محتوى الكوليسترول الكلي في خلايا Cos-7. كانت خلايا Cos-7 إما غير معالجة (NT) أو عولجت ب 1 U / mL من أوكسيديز الكوليسترول (COase) لمدة 1 ساعة. تمثل البيانات مثالا على تجربة واحدة في ثلاثة أضعاف. تم استخدام اختبار t ثنائي الذيل وغير مقترن لتقييم الفرق الإحصائي (α = 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جدول المواد: قائمة العناصر البصرية المطلوبة لإعداد svFCS.

المواد التكميلية: يتناول هذا المستند إنشاء إعداد svFCS من البداية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، وصفنا تنفيذ وحدة svFCS على مجهر فلورسنت قياسي ، وهو نهج تجريبي قوي لفك رموز ديناميكيات تنظيم غشاء البلازما في الخلايا الحية بفضل تحليل قانون انتشار FCS. من الناحية المفاهيمية ، يعتمد svFCS على مبدأ بسيط: قياسات الارتباط للتألق في المجال الزمني مع تغيير حجم منطقة الإضاءة23. كانت هذه الاستراتيجية مفيدة في استنتاج المعلومات النانوية من القياسات المجهرية ، مما يساعد على فك رموز العناصر الفيزيائية والكيميائية الرئيسية التي تساهم في تنظيم غشاء البلازما في حالة ثابتة25 والعمليات الفسيولوجية30،31،32،33. وإجمالا، تظهر تحليلات svFCS هذه بشكل لا لبس فيه وجود مجالات نانوية تعتمد على الدهون في أنواع مختلفة من الخلايا وتأثيرها المباشر في ضبط أحداث الإشارات المختلفة.

في هذا الإطار ، هناك بعض الجوانب البصرية التي يجب مراعاتها أثناء بناء إعداد svFCS لتحسين ميزانية الفوتون وتقليل الانحرافات البصرية. وبالتالي ، نوصي باستخدام المجهر الذي يمكن من خلاله إزالة عدسة الأنبوب عند إجراء قياس svFCS. علاوة على ذلك ، تلعب قزحية واحدة دورا رئيسيا في إعداد svFCS: فهي تغير حجم الشعاع في الفتحة الخلفية للهدف ، وبالتالي تغير بشكل مباشر حجم الخصر الفعال (أي حجم الإثارة الفعال). يجب أن يتناسب قطر الشعاع مع بؤبؤ العين الخلفي الهدف للحصول على أصغر حجم خصر34. هذا الخيار ، الذي يساعد على ضبط حجم الخصر ، يضمن تحسين ميزانية الفوتون وسهل التنفيذ. أخيرا ، يتم استخدام الحد الأدنى من الأجزاء البصرية على طول مسار الضوء. كلما كان النظام أقل تعقيدا ، قل عدد الفوتونات المفقودة. كل هذه الخيارات تحسن بشكل كبير من متانة تجارب svFCS.

وفيما يتعلق بالبروتوكول نفسه، لا بد من النظر في بضع خطوات حاسمة. الأهم من ذلك هو المحاذاة المناسبة للمسارات البصرية التي تعتبر حاسمة لقياسات svFCS الناجحة (البروتوكول ، القسم 2). من السهل التحقق من ذلك من خلال تحليل إشارة التألق من محلول 2 نانومتر Rh6G ، والذي يجب أن يكون ~ 200 كيلو هرتز تحت إضاءة ليزر 300 ميكروواط. يجب فتح جميع القزحية ، ويجب أن يكون ل ACFs سعة مهمة (عادة G0 ~ 1.5-2.0). نقطة حرجة أخرى تتعلق بالخلايا وإعدادها لتحليل svFCS (البروتوكول ، الأقسام 4-8). يجب تكييف كثافتها بحيث تكون الخلايا المعزولة التي يجب ملاحظتها متاحة للتحليل. يجب تجميد الخلايا غير الملتصقة على غطاء زجاجي حجري باستخدام محلول poly-L-lysine. لا ينبغي أن تكون إشارة التألق من وضع العلامات على الخلايا قوية جدا ، أو أنها ستؤدي إلى ACFs مسطحة للغاية يصعب ملاءمتها ، ومعلمات الملاءمة مثقلة بخطأ مهم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وضع العلامات غير المتجانسة ومجاميع التألق في الخلايا يجعل من الصعب للغاية تفسير قياسات svFCS. أخيرا ، يؤثر علاج أوكسيديز الكوليسترول على صلاحية الخلايا ، ويجب ألا يتجاوز تحليل svFCS ساعة واحدة بعد العلاج. من الأفضل أيضا تسجيل تقلبات التألق من غشاء البلازما العلوي لأنه غير متصل بالدعم ، وليس هناك خطر من إعاقة انتشار الجزيئات بسبب التفاعلات الفيزيائية مع الدعم.

وقد أحرز تقدم كاف في تقنية svFCS لاستخدامها في نهج مختلفة بسبب تنوع طرائق تعديل حجم الكشف، مما يجعل من الممكن دراسة مختلف العمليات البيولوجية في الخلايا الحية. بديل لضبط حجم حجم الإثارة هو استخدام موسع شعاع متغير35. من الممكن أيضا ببساطة تعديل حجم منطقة الإضاءة عن طريق تسجيل إشارة الفلورسنت من اعتراض غشاء البلازما على طول الاتجاه z36. يمكن القيام بذلك على المجهر البؤري القياسي الذي تم تطوير إطار نظري له لاشتقاق قانون الانتشار37,38.

على الرغم من أن طريقة svFCS توفر دقة مكانية زمانية ، وهو أمر ضروري لتوصيف التنظيم الجانبي غير المتجانس لغشاء البلازما ، إلا أن الأنماط الهندسية للحبس لا تستبعد بعضها البعض. يكشف انحراف t0 في اتجاه واحد أو آخر حصريا عن نمط مهيمن للحبس25. علاوة على ذلك ، هناك قيد مهم آخر لطريقة svFCS الحالية ينتج عن حد الحيود البصري الكلاسيكي (~ 200 نانومتر). هذا بلا شك أكبر من المجالات التي تحصر الجزيئات داخل غشاء البلازما الخلوي. لذلك ، يتم استنتاج تحليل الحبس من قيمة t0 ، مستنبطة من قانون الانتشار.

وقد تم التغلب على هذا العيب من خلال تنفيذ أساليب بديلة. في البداية، أتاح استخدام الأفلام المعدنية المحفورة بفتحات نانوية إمكانية إضاءة منطقة غشاء صغيرة جدا (أي أقل من حد الحيود البصري لفتحات نانومترية مفردة ذات نصف قطر يتراوح بين 75 و 250 نانومتر)39. وهكذا تم الإبلاغ عن النظام الانتقالي الذي تنبأ به قانون الانتشار النظري لتنظيم المجال المعزول ، وسمح بتحسين الحجم المميز لعدم تجانس الغشاء النانومتري وتقدير كمي للمساحة السطحية التي تشغلها المجالات النانوية المعتمدة على الدهون39. بدلا من ذلك ، تم تطوير الإضاءة النانومترية أيضا باستخدام المجهر الضوئي المسح الضوئي القريب من المجال40 أو الهوائيات النانوية البصرية المستوية41. وفي الآونة الأخيرة، وفر الجمع بين استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) و FCS أداة قوية وحساسة لتوثيق قانون الانتشار بدقة مكانية عالية جدا. يتيح هذا STED-FCS الوصول إلى خصائص الانتشار الجزيئي على نطاق نانوي يحدث في غضون فترة زمنية قصيرة ، مما يسمح بدراسة التنظيم الديناميكي لمجسات الدهون في غشاء البلازما42,43. ومع ذلك ، فإن القمع غير الكامل للتألق في عملية STED يتحدى تحليل منحنيات الارتباط التلقائي في FCS.

تم تطوير نموذج تركيب جديد للتغلب على هذه الصعوبة ، وتحسين دقة أوقات الانتشار ومتوسط أعداد الجزيئات قياسات44. أخيرا ، بالنسبة للانتشار الجزيئي البطيء في غشاء البلازما ، يمكن تطبيق مبدأ svFCS على البيانات المسجلة بواسطة التحليل الطيفي لارتباط الصورة45. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن الجمع بين مجهر القوة الذرية (AFM) والتصوير الكلي للانعكاس الداخلي - FCS (ITIR-FCS) يساهم في تحسين طبيعة الآلية التي تعيق الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما ، خاصة بالقرب من تكوين غشاء عتبة التسرب بسبب الكثافة العالية للمجالات النانوية46.

في الختام ، فإن إنشاء قانون الانتشار بواسطة svFCS قد وفر الأدلة التجريبية لاستنتاج عدم التجانس المحلي الناتج عن الدهون الجماعية الديناميكية وارتباطات البروتينات الغشائية. وكما ذكر وولاند وزملاؤه في العمل46، "يظل تحليل قانون نشر FCS أداة قيمة لاستنتاج السمات الهيكلية والتنظيمية دون حد الدقة من المعلومات الديناميكية". ومع ذلك، نحن بحاجة إلى تطوير نماذج جديدة لتحسين تفسير قانون الانتشار الذي يجب أن يسمح بفهم أفضل لديناميكيات الأحداث الجزيئية التي تحدث في غشاء البلازما.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم SB و SM و DM بتمويل مؤسسي من CNRS و Inserm و Aix-Marseille University ومنح برامج من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-17-CE15-0032-01 و ANR-18-CE15-0021-02) و "Investissement d'Avenir" الفرنسية (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). تعترف KW ب "BioTechNan" ، وهو برنامج لدراسات الدكتوراه البيئية متعددة التخصصات KNOW في مجال التكنولوجيا الحيوية وتكنولوجيا النانو. تقر EB بالدعم المالي المقدم من المركز الوطني للعلوم في بولندا (NCN) في إطار المشروع رقم 2016/21/D/NZ1/00285 ، وكذلك الحكومة الفرنسية وسفارة فرنسا في بولندا. تقر MŁ بالدعم المالي المقدم من وزارة التنمية البولندية (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) والمركز الوطني للبحث والتطوير (Innochem POIR.01.02.00-00-00-0064/17). تعترف TT بالدعم المالي المقدم من المركز الوطني للعلوم في بولندا (NCN) في إطار المشروع رقم 2016/21/B/NZ3/00343 ومن مركز فروتسواف للتكنولوجيا الحيوية (KNOW).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مفتاح ربط أداة Aligmentلحلقات الاحتفاظ بالخيوط SM1 ThorlabsSPW602
الثنائي الضوئي للانهيار الجليدي ووحدة عد الفوتون الفردي (SPCM) وحدةعد الفوتون الفردي ، الثنائي الضوئي الانهيارExcelitasSPCM-AQRH-15
BNC 50 & Omega ؛ التوصيل إلى 50 & أوميغا ؛ الرصاص القابس 2 مترمكونات RS742-4315
كابل متحد المحور 415 موصلات Cinch ، RG-316 ، 50 & Omega ؛ مع موصل ، 1.22 م ، مكونات RoHS2RS885-8172
نقطة الإنطلاق 50 & أوميغا ؛ محول الترددات اللاسلكية BNC التوصيل إلى مقبس BNC 0 &rarr ؛ مكونات RS بسرعة 1 جيجا هرتز546-4948
Brennenstuhl 2.5 م ، 8 مقبس من النوع E & ndash ؛ رصاص التمديد الفرنسي ، مكونات 230 فولتRS768-5500
التميمة ، 6 واط التوصيل في مصدر الطاقة 5 فولت تيار مستمر ، 1.2 أمبير ، 1 مصدر طاقة وضع التبديل ، مكونات النوع CRS452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 مرجع مذبذب كابل الطاقة محول RFمكونات RS792-4079
تصفية مضان535/70 ET Bandpass ، AOI 0 & deg ؛ قطر Chroma 25 مممرشح AHFF47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC ، AOI 45 & deg ؛ فلتر Chroma 25.5 × 36 × 1 ممAHF F43-088
496 / LP مرشح BrightLine HC Longpass ، AOI 0 & deg ؛ قطر Chroma 25مرشح AHFF37-496
الأجهزة80 ميجا هرتز الارتباط الرقميCorrelator.comFlex02-12D
ليزرLASER LASOS LDM-XT مع الألياف المقترنة ، 488 نانومتر ، 65 ميجاواتLasosBLD-XT 488100
شريط اخفاءأسود عالي الأداء ، 1 بوصة × 180 بوصة (25 مم × 55 م) لفةThorlabsT743-2.0
مناديل العدسات ، 25 ورقة لكل كتيب ، 5 كتيباتThorlabsMC-5
، عدسات برتقالية فاتحة ، 48٪ نقل الضوء المرئيThorlabsLG3B
مجهرZeiss Axiovert 200M مجهر مضان مقلوب بمحرك
تركيز دقيق وخشن ، دوران برج عاكس ، دوران موضوعي لقطعة الأنف ، تبديل منافذ الكاميرا ، ومصاريع الإضاءة الداخلية		Carl Zeiss
C-Apochromat 40x / 1,2 W Korr.selected ل FCS
(D = 0.14-0.19 مم) (WD = 0.28 مم عند D = 0.17 مم) ، UV-VIS-IR		Carl Zeiss421767-9971-711
محول W0.8 / M27x0.75 H "5"Carl Zeiss000000-1698-345
الحلقة الوسطى W0.8 - W0.8 H "5"Carl Zeiss000000-1698-347
المسار البصريD25.4mm مرآة ،ThorlabsPF10-03-P01
D25.4mm ، F = 60.0.mm ، Achromat المرئيThorlabsAC254-060-A
D25.4mm ، F = 35.0.mm ، Achromatالمرئي ThorlabsAC254-035-A
25 & micro ؛ الثقب المثبت علىm ThorlabsP25S I
25.4 مم مثبت على الصفر ، طلب 1/2 لوحة موجية 488 نانومترThorlabsWPH10M-488 (HWP)
20 مم مكعب شعاع مقسم الاستقطاب 420-680 نانومترThorlabsPBS201
مرحلة الدوران 56 مم × 26 مم معرف الخيوطThorlabsRSP1 / M
52 مم × 52 مم منصة حركية جبلThorlabsKM100B / M
مشبك المنشور القابل للتعديلThorlabsPM3 / M
كتلة شعاع - منطقة نشطة 19 مم × 38 ممThorlabsLB1 / M
الحجاب الحاجز القزحية من 1 مم إلى 25 مم فتحةThorlabsID25 / M
العدسة الأسطوانية الحركية اليسرى حاملThorlabsKM100CL
حامل بصري مقاس 1 بوصة ، M4 TapThorlabsMFF101 / M
1 "أنبوب عدسة قابل للتكديسThorlabsSM1L03
عدسة قابل للتكديس ل 1 "عمق بصري قابل للاستخدام ½ ؛ThorlabsSM1L05
عدسة قابل للتكديس لقضبان بصرية صغيرة 1 بوصة قابلة للاستخدام بصريا 2 بوصةThorlabsSM1L20
600 مم ،مترية ThorlabsRLA600 / M
75 مم ،مترية ThorlabsRLA075 / M
150 مم ،متري ThorlabsRLA150 / M
، ثقب مضاد 1 "× 1"ThorlabsRC1
، عمودي متشابكThorlabsRC3
الدقة ترجمة عدسة جبل ل 1 بوصةThorlabsLM1XY / M &
frac12 ؛ "(12 مم) مرحلة الترجمة المتشابكةThorlabsDT12 / M
مشابك السكك الحديديةThorlabsCL6
مرحلة الترجمة المترية XYZ (بما في ذلك PT102)ThorlabsPT3 / M
أسود مطاطي النسيجThorlabsBK5
مجموعة سائق الكرة / 6 أدواتمحول ThorlabsBD-KIT / M
مع خيوط خارجية M6 × 1.0 وخيوط خارجية M4 × 0.7ThorlabsAP6M4M
، 25 مم × 58 مم × 10 مم ، 5 عبواتThorlabsBA1S / M-P5
حامل عدسة لمحول Thorlabs البصري 25.4 ممThorlabsLMR1 / M
SM1 FC / APCThorlabsSM1FCA
مرآة حركية لرأس طاقة السيليكون Thorlabs KM100
مقاس 1 بوصة ، 400-1100 نانومتر ، 50 ميجا واطThorlabsS120C
12.7 ملم حاملات أعمدة ، برغي إبهام سداسي محمل بنابض ،
L = 50 مم ، 5 عبوات		ThorlabsPH50 / M-P5
مع برغي إبهام سداسي محمل بنابض ، L = 20 ممThorlabsPH20 / M
12.7 مم × 50 مم عمود بصري من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسمار M4 ، ثقب
M6 ، 5 عبوات		ThorlabsTR50 / M-P5
12.7 مم × 75 مم عمود بصري من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسمار M4 ، ثقب
M6 ، 5 عبوات		ThorlabsTR75 / M-P5
واجهة عداد الطاقة والطاقة USBThorlabsPM100USB
12.7 مم × 30 مم عمود بصري من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسمار M4 ، ثقب
M6		ThorlabsTR30 / M
12.7 مم × 20 مم عمود بصري من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسمار M4 ، ثقب
M6		ThorlabsTR20 / M
750 مم سكة حديد هيكلية بطول 750 مم (صندوق الكشف)ThorlabsXE25L750 / M
سكة هيكلية بطول 350 مم (صندوق كشف)ThorlabsXE25L350 / M
مكعب زاوية سريعة لقضبان 25 ممThorlabsXE25W3
قوس الزاوية اليمنى لقضبان 25 ممThorlabsXE25A90
لوحة ملصق سوداء 20 بوصة × 30 بوصة (508 مم × 762 مم) ، 1/16 بوصة (1.6 مم) سميكة ، 5 أوراقThorlabsTB5
مفصلة لحاويات السكك الحديدية مقاس 25 ممتوقف غطاء ThorlabsXE25H
لحاويات السكك الحديدية مقاس 25 مم طقمبرغي الغطاء Thorlabs
HW-KIT1
M6 طقم برغي الغطاء ومجموعة الأجهزةThorlabsHW-KIT2 / M
مشبك طاولة ، على شكل حرف L ، 5 عبواتThorlabsCL5-P5
SM1 غشاء قزحية تعمل بحلقة (& Oslash ؛ 0.8 - &[أوسلاش]; 12 مم)ThorlabsSM1D12D
& Oslash; 1 "قرص محاذاة الزجاج المصنفر المثبت على SM1 مع أوسلاش; 1 مم ثقبThorlabsDG10-1500-H1-MD
سطح طاولة بصرية على شكل قرص العسل ،Standa 1HB10-15-12
، StandaStanda1TS05-12-06-AR
عينة من تحديد المواقع النانويةالدقة XYZ NanopositioningPhysik InstrumentePI P527-3.CD
شركة Piezo الرقمية متعددة القنوات ، 3 قنوات ، -30 إلى 130 فولت
موصلات فرعية D ، أجهزة استشعار سعوية ،		Physik InstrumentePI E727-3.CD
Zeiss 200M نظام حاضنة المجهر المقلوب MATT BLKالبكسل
ثنائي القناة وحدة تحكم في درجة حرارةالمعالج الدقيقDP_MTC_2000_DUO
وحدتيسخان خالية من الاهتزازبكسل رقميDP_150_VF
PT100 مستشعر درجة الحرارةبكسل رقميDP_P100_TS
<قوي > الكواشف والمواد البيولوجية < / قوي >
ثقافة الخلية وتعداءخلايا Cos7ATCC & reg ؛CRL-1651 ™
8- غرف Well Lab-TekThermo Fisher Scientific155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
مصل الأبقار الجنينيThermo Fisher Scientific16000044
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030081
PBS العازلةThermo Fisher Scientific14190144
PenStrepThermo Fisher Scientific15140122
PolyJet Transfection ReagentSignaGen LaboratoriesSL100688
قياس محتوى الكوليسترولAmplex مجموعة فحص الكوليسترولالأحمر Thermo Fisher ScientificA12216
مثبطات البروتياز كوكتيلثيرمو فيشر Scientific87786
مثبطات الفوسفاتيز كوكتيلثيرمو فيشر Scientific78420
ROTI Nanoquant حل العملRothK880
GloMax اكتشف قارئ الصفيحةالدقيقة PromegaGM3000
svFCS قياساتHBSS ThermoFisher Scientific14025092
Hepes العازلةالحرارية فيشر العلمية15630080
الكوليسترول أوكسيديزسيجما ألدريتشC8868
رودامين 6 جرامسيجما ألدريتش83697-1 جرام
الجليدي ارتباط نظارات أمان ليزر فضي محمي حامل حامل قضبان بصرية صغيرة قضبان بصرية صغيرة حامل سكة حديد حامل السكك الحديدية عالية قاعدة تركيب حامل حامل عمود / M دعم الطاولة البصرية Standa غرفة درجة حرارة الرقمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).
  3. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
  4. Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
  6. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
  7. Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
  8. Nicolson, G. L. The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
  9. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
  10. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
  11. Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
  12. Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
  13. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
  14. Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
  15. Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
  16. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
  17. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
  18. Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
  19. Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
  20. Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
  21. Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
  22. Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
  23. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  24. Saxton, M. J. Fluorescence corralation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2005).
  25. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  26. Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
  27. Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
  28. Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
  29. Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).
  30. Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
  31. Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21(2011).
  32. Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
  33. Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
  34. Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
  35. Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
  36. Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
  37. Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
  38. Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
  39. Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
  40. Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
  41. Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
  42. Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
  43. Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
  44. Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
  45. Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
  46. Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spot Variation FCSFluorescence Correlation SpectroscopyPlasma Membrane DiffusionMolecular Diffusion AnalysisCholesterol Oxidase TreatmentLipid Raft NanodomainsThy1 GFP ExpressionCos7 CellsLaser Power CalibrationAuto Correlation Function

Related Articles