خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

Brianna Ball; Arjun Sukumaran; Jennifer Geddes-McAlister

doi:10.3791/61881

Method Article

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

DOI:

10.3791/61881

⸱

October 20th, 2020

Brianna Ball¹ , Arjun Sukumaran¹ , Jennifer Geddes-McAlister¹

¹Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن الإنجازات التكنولوجية لقياس الطيف الكتلي (MS) التي تعتمد على البروتيوم الكمي تفتح العديد من الطرق غير المكتشفة لتحليل البروتيوم العالمي للكائن الحي في ظل ظروف مختلفة. هذه الاستراتيجية القوية المطبقة على تفاعلات مسببات الأمراض الميكروبية مع المضيف المطلوب يميز بشكل شامل كلا المنظورين نحو العدوى. هنا، سير العمل يصف الكم خالية من التسمية (LFQ) من infectome من Cryptococcus الأشكال الجديدة، وهو مسبب أمراض داخل الخلايا الكلي الفطرية التي هي العامل المسبب ل cryptococcosis المرض القاتل، في وجود خلايا الضامة خلد. ويفصّل البروتوكول تقنيات إعداد البروتين المناسبة لكل من الخلايا المسببة للأمراض والثدييات في إطار تجربة واحدة، مما يؤدي إلى تقديم الببتيد المناسب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS/MS. تسمح الطبيعة العامة العالية لـ LFQ بنطاق ديناميكي واسع من تحديد البروتين وتحديد كميته ، بالإضافة إلى قابلية النقل إلى أي إعداد للعدوى المضيفة - الممرض ، مع الحفاظ على حساسية شديدة. تم تحسين هذه الطريقة لفهرسة واسعة، غير متحيزة ملامح وفرة البروتين من الممرض داخل ظروف محاكاة العدوى. وعلى وجه التحديد، فإن الطريقة التي تم إظهارها هنا توفر معلومات أساسية عن التسبب في الأورام الجديدة، مثل إنتاج البروتين اللازم للوعاء وتحدد البروتينات المضيفة الحرجة التي تستجيب للغزو الميكروبي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتشار الالتهابات الفطرية الغازية في تزايد كبير ويرتبط مع معدلات الوفيات العالية غير المقبولة، والأكثر شيوعا ذكرت في الأفراد الذين لديهم استعداد المناعي¹. Cryptococcus النيوفورمات هو الممرض الفطري الانتهازية سيئة السمعة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا داخل خلايا الضامة المضيفة. عدم كفاية نتائج التدخل المضاد للفطريات في نشر الفطريات ومظاهر تهدد الحياة من التهاب السحايا cryptococcal والتهاب السحايا²^,³. وقد طالبت الزيادة العالمية في حالة المناعة زيادة موازية في استخدام العوامل المضادة للفطريات، التي العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك C. النيوفورم، تطورت مقاومة متزايدة نحو^4،^5،⁶. ولذلك، لا بد من تنفيذ تكنولوجيات قوية وفعالة للإجابة على الأسئلة البيولوجية الحيوية المتعلقة باستجابة الدفاع المضيف والتنمّر الميكروبي.

العصر الجديد للتقدم التكنولوجي في القياس الطيفي الشامل (MS)، بما في ذلك توليد خطوط الأنابيب الحاسوبية الحيوية القوية، يوفر الأساس لرؤية تكاملية للتحليل على نطاق واسع من البحوث المضيفة المسببة للأمراض⁷^،⁸. تحليل البروتيومي التقليدي الذي يحركه التسبب في التسبب في البروتيوم عادة ما يُحْسَر وجهة نظر العدوى من منظور المضيف أو الممرض، بما في ذلك منهجيات شاملة مثل التنميط الارتباط البروتيني، واللون اللوني المتقارب مع البروتيوميات،^{والتفاعلات 9}. التحقيقات في ضراوة مسببات الأمراض الخطرة في نظام المضيف هي ذات أهمية سريرية هائلة; ومع ذلك، كان تطبيق تحليل منظور مزدوج في تجربة واحدة يعتبر سابقاً غير قابل للتحقيق. على سبيل المثال، غالباً ما تطغى على منظور الممرض نحو العدوى من قبل البروتينات المضيفة الوفيرة مما يؤدي إلى انخفاض الحساسية للكشف عن البروتينات الفطرية منخفضة وفيرة⁷. وعلاوة على ذلك، فإن تعقيد العينة العالية يدعو العديد من الأهداف للتحقيق في نظام تجريبي واحد وتثبت صعوبة في توضيح آليات العمل لبروتين مسبب للأمراض محددة.

البروتيوميات من أسفل إلى أعلى هو تقنية مرض التصلب العصبي المتعدد شعبية التي تمكن من إعداد العينة يمكن التحكم فيها، والتي يتم توليد الببتيدات عن طريق الهضم الأنزيمي تسلسل محددة تليها فصل الكروماتوغرافيا السائلة، وتحديد، والكمية من قبل MS¹⁰^،¹¹. هنا، نقدم طريقة توضح استراتيجية الاستحواذ المعتمدة على البيانات بهدف تحقيق تغطية غير متحيزة للبروتيوم القائم على العدوى أو "العدوى". على وجه التحديد، الكم خالية من التسمية (LFQ) يلقي الاعتماد على التسميات الكيميائية أو الأيضية لتحديد قوية ودقيقة للتغيرات مستوى البروتين عبر البروتينات المتعددة، والحد من معالجة العينات ومعالجة الخطوات¹²^،¹³. هذا التطبيق العالمي يستجوب البروتينات المنتجة في لحظة معينة داخل خلية مستقلة عن أي إنتاج البروتين المتوقع؛ وهكذا، يمكن اكتشاف رؤى جديدة التي تعتبر حاسمة للعدوى.

تم تحسين سير العمل الموضح هنا لاستكشاف التغيرات في مستوى البروتين من C. neoformans خلال حالات محاكاة العدوى مع الخلايا المناعية المضيفة (الشكل 1). وبدلاً من الاعتماد على عزل وفصل أنواع الخلايا، يستخرج هذا النهج البروتيم المضيف والمسبب للمرض معاً، ويستخدم الفصل المعلوماتي الحيوي باستخدام قاعدتي بيانات خاصتين بالكائنات الحية لتمييز إنتاج البروتينات الخاصة بالأنواع. وتوفر هذه الطريقة مزايا لعدد غير محدود من العينات التي يتعين معالجتها دون اتخاذ خطوات إعداد إضافية مكلفة ضرورية في دراسات وضع العلامات القائمة على النظائر أو الكسر. وعلاوة على ذلك، يدعم هذا العمل بروتوكولات استخراج البروتين المحسنة القابلة للنقل إلى مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية القادرة على استهداف الخلايا المناعية المضيفة وتصيبها. وعموما، يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستكمال استخراج البروتين غير متحيزة ومعالجة العينة ل MS عالية الدقة، تليها البيانات والتحليل الإحصائي، قادرة على توفير ثروة من المعرفة من البروتينات الفطرية الهامة للعدوى جنبا إلى جنب مع التنميط الشامل للاستجابة الدفاع المضيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام خط خليد من الضامة المستمدة من الفئران BALB / ج للبروتوكول التالي وافق عليها جامعة غيلف استخدام الحيوان بروتوكول 4193. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق سلالات أخرى من الفئران أو مصادر أخرى من الخلايا الخالدة على البروتوكول المبين مع اختبار كاف لتحسين المعلمات التفصيلية. سوف ينتقل البروتوكول التالي الخطوات التي تبدأ بزينة مجمدة من خلايا الضامة. يتم تخزين الخلايا في 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنينية)، 1٪ L-الجلوتامين و 5٪ القلم / ستريب (البنسلين-ستربتوميسين) خليط لDEM (Dulbecco معدلة النسر المتوسط) و 20٪ DMSO (ثنائيثيل سلفوكسيد).

1- زراعة الأشكال الجديدة من نوع C.

باستخدام مخزون الجلسرين، سلالة البرية المتتالية C. neoformans (H99) على الخميرة استخراج بيبتون دكستروز (YPD) لوحة أجار لعزل مستعمرات واحدة.
احتضان ليلة وضحاها لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
حدد مستعمرة واحدة من سلالة البرية C. neoformans والثقافة في 5 مل من مرق YPD في فضفاضة توج 10 مل أنبوب الاختبار. أداء في رباعية.
احتضان ليلة وضحاها ل 16 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي ثقافة فرعية كل ثقافة بين عشية وضحاها في تخفيف 1:100 في مرق YPD 3 مل.
قياس الكثافة البصرية (OD_600nm)قيم الثقافة الفطرية لتحديد منتصف مرحلة السجل. اعتمادا على مقياس الطيفي، C. سلالة النمط البرية الجدد تصل إلى منتصف مرحلة سجل عادة بعد 6 إلى 8 ح حضانة في YPD مع عام_600nm القيم OD تتراوح 1.0 إلى 1.5.
مرة واحدة الخلايا تصل إلى منتصف مرحلة السجل، واتخاذ aliquot 10 ميكرولتر من تعليق الخلية الفطرية في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة وتمييع 1:100 في العقيمة 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت.

2. زراعة خلايا الضامة

ملاحظة: تأكد من أن بيئة العمل يتم تعقيمها قبل عمل ثقافة الخلية.

إعداد متوسط ثقافة الخلية
1. المضادات الحيوية تكمل المتوسطة: إضافة 10٪ FBS (مصل البقر الجنينية)، 1٪ L-الجلوتامين و 5٪ القلم / ستريب (البنسلين-ستريبتوميسين) خليط إلى DMEM (Dulbecco معدلة النسر المتوسط). تصفية المتوسطة من خلال نظام تصفية كاملة 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
2. وسيط خالٍ من المضادات الحيوية: اتبع بروتوكولاً مماثلاً ولكن حذف خليط القلم/العقدية.
خلايا الضامة البذرية
ملاحظة: يجب تدفئة المضادات الحيوية تكمل المتوسطة (2.1.1.) إلى 37 درجة مئوية قبل عمل زراعة الخلية.
1. ذوبان من خلايا الضامة بسرعة في 37 درجة مئوية حمام الخرز.
2. غسل الخلايا من محلول التجميد عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 1 مل المضادات الحيوية تكمل المتوسطة.
  ملاحظة: هناك حاجة إلى احتياطات إضافية لضمان عدم lyse الخلايا بسبب الأنابيب القاسية.
3. نقل الخلايا التي أعيد اعتمادها إلى أنبوب عقيم 15 مل.
4. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة بعناية فائقة مع ماصة المصلية أو التعرق فراغ.
6. بيليه resuspend بلطف في 10 مل من المضادات الحيوية تكمل المتوسطة.
7. الخلايا الماصة بلطف إعادة توزيعها في طبق استزراع الخلايا 60 × 15 مم.
8. طبق احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ بين عشية وضحاها.
المرور الأولي لخلايا الضامة
ملاحظة: عادة ما تحتوي مخزونات الخلايا المجمدة على ما بين 5 إلى 10 ملايين خلية لكل قارورة (حوالي 1 مل). في اليوم التالي، سوف خلايا الضامة التي نجت من بروتوكول البذر تلتزم الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية وستكون جاهزة لـ passaging.
1. المضادات الحيوية الدافئة تكمل المتوسطة (الخطوة 2.1.1) إلى 37 درجة مئوية قبل عمل زراعة الخلية. ضمان تعقيم بيئة العمل قبل العمل ثقافة الخلية. تصور الخلايا باستخدام المجهر الخفيف لضمان أن يتم الالتزام بالخلايا وصحية.
2. إزالة خلية ثقافة المتوسطة من الطبق إما مع ماصة المصلية أو pirator فراغ.
3. أضف بلطف 5-7 مل من PBS معقم درجة حرارة الغرفة (ملح الفوسفات المخزن) إلى طبق 60 × 15 ملم.
4. إمالة بلطف الطبق لغسل الخلايا الملتزمة.
5. إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة المصلية أو pirator فراغ.
6. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة (المخزنة في 4 درجة مئوية) إلى الخلايا، وطبق إمالة لتوزيع برنامج تلفزيوني على جميع الخلايا، والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
7. إطلاق الخلايا عن طريق التنصت لطيف من الطبق، الأنابيب برنامج تلفزيوني الباردة ضد الخلايا، أو باستخدام مكشطة الخلية.
8. أضف 9 مل من المضادات الحيوية الملحقة بالطبق.
9. في طبق جديد 60 × 15 مم، أضف 9 مل من المضادات الحيوية الطازجة و1 مل من الخلايا التي يتم تثبيتها من الطبق الأصلي.
10. مرة واحدة وقد تم شغل عدد من لوحات passaging المطلوب، يمكن التخلص من الخلايا resuspended من الطبق الأصلي.
11. احتضان الطبق الجديد في الإعدادات المذكورة أعلاه (الخطوة 2.2.8).
12. تنفيذ تمرير اللاحقة عندما الخلايا قد وصلت التقاء 70-80٪ (تقريبا كل 2 أيام اعتمادا على خط الخلية والمتوسطة المستخدمة).
  ملاحظة: يجب أن يتم تمرير خلايا الضامة خمس مرات كحد أدنى قبل تجارب العدوى. اعتمادا على خط الخلية، ينبغي إجراء تجارب العدوى من قبل 25 إلى 30 مقطعا. بعد 25 إلى 30 مقطعاً، يجب تجميد الخلايا أو التخلص منها. ويمكن اختيار القسم 2-4 أو 2-5 على أساس الخطط التجريبية. وسوف تستخدم المادة 2-4 في الفروع التالية.
بذور خلايا الضامة قبل العدوى
1. تنفيذ خطوات بروتوكول ترحيل التمرير 2.3.1 إلى 2.3.7.
2. باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي تحديد كثافة الخلية (الخلايا / مل).
3. نقل 0.3 × 10⁶ خلايا الضامة إلى بئر واحد من لوحة ثقافة خلية 6-well.
4. ضبط حجم إجمالي من جيدا إلى 1 مل باستخدام المضادات الحيوية الملحقة المتوسطة (الخطوة 2.1.1).
5. كرر الخطوتين 2-4-3 و2-4-4 حتى يتم ملء 8 آبار (4 آبار تم ملئها في لوحتين منفصلتين).
6. اختياريا، تعبئة الآبار المتبقية اثنين مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للحفاظ على مستويات الرطوبة أثناء الحضانة.
7. السماح للخلايا أن تنمو في ظل ظروف الحضانة المذكورة في الخطوة 2.2.8 ل 2 د قبل الإصابة.
خلايا الضامة البذر في يوم العدوى
1. تنفيذ خطوات بروتوكول ترحيل التمرير 2.3.1 إلى 2.3.7.
2. باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي تحديد كثافة الخلية (الخلايا / مل).
3. البذور 1.2 × 10⁶ خلايا الضامة في بئر واحد من 6-جيدا خلية لوحة الثقافة.
4. ضبط حجم إجمالي من جيدا إلى 1 مل باستخدام المضادات الحيوية الملحقة المتوسطة (2.1.1).
5. كرر 2.4.3 و2.4.4 حتى تم ملء 8 آبار (4 آبار مملوءة في لوحتين منفصلتين).
6. اختياريا، تعبئة الآبار المتبقية اثنين مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للحفاظ على مستويات الرطوبة أثناء الحضانة.
7. احتضان الخلايا في ظل الشروط المذكورة في الخطوة 2.2.8 ل 3 ساعة للسماح للخلايا بالتمسك بالآبار.

3. عدوى خلايا الضامة مع C. النموش

ملاحظة: عند الوصول إلى التقاء 70-80٪ ، سيكون هناك حوالي 1.2 × 10⁶ خلايا الضامة في البئر. لتحقيق التعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) من 100:1، 1.2 × 10⁸ الخلايا الفطرية مطلوبة لكل رد فعل. ويجب وضع الثقافات وفقا لذلك في رباعية بيولوجية.

تنويه : وزارة الداخلية من 100:1 حققت نتائج مرغوب فيها في مجموعتنا البحثية ، والمقصود كاقتراح للقراء. قد تكون هناك حاجة إلى وزارة الداخلية أقل لسلالات C. neoformans المعدية أو لخطوط خلايا الضامة الأقل مرونة. التحقق من العدوى (القسم 3.5) يمكن استخدامها لتحديد وزارة الداخلية المثالي لل C. الجدد معينة - تركيبات الضامة.

إعداد الخلايا الفطرية
1. اتبع الخطوة 1 لنمو الأشكال الجديدة C. إلى منتصف مرحلة السجل.
2. جمع وطاردة مركزية في 1500 س ز لمدة 10 دقيقة، وغسل بلطف بيليه مع درجة حرارة الغرفة العقيمة PBS، وكرر لمجموع ثلاثة يغسل.
3. خلايا إعادة الزرع في الخلايا الخالية من المضادات الحيوية المتوسطة (الخطوة 2.1.2) لتحقيق تركيز 1.2 × 10⁸ خلايا / مل.
إعداد خلايا الضامة
1. تصور كل بئر في لوحة 6-جيدا لضمان أن الخلايا قد وصلت 70-80٪ التقاء. بدلا من ذلك، يمكن قياس الخلايا لتحقيق حوالي 1.2 × 10⁶ خلايا الضامة في البئر.
2. اتبع الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.4.
ثقافة المشاركة من C. النموشات الجديدة وخلايا الضامة
1. إضافة 1 مل من الخلايا C. neoformans التي تم تعليقها (الخطوة 3.1.3) إلى 4 آبار تحتوي على خلايا الضامة المعدة في القسم 3-2.
  ملاحظة: يجب حساب عدد اللوحات المطلوبة قبل بدء التجربة. إضافة 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المتوسطة (الخطوة 2.1.2) إلى آبار فارغة.
2. السماح للخلايا لاحتضان تحت شروط المدرجة (الخطوة 2.2.8) لمدة 3 ساعة.
3. إزالة خلية ثقافة المتوسطة من لوحة إما مع ماصة المصلية أو pirator فراغ.
4. أضف بلطف 1 مل من PBS العقيمة درجة حرارة الغرفة.
5. إمالة بلطف لوحة لغسل غير المرفقة أو غير phagocytosed الخلايا خارج الخلية C. الخلايا الجدد.
6. إزالة PBS باستخدام ماصة المصلية أو التعرق فراغ، كرر لمجموع ثلاثة يغسل. كرر 3.3.4 إلى 3.3.5 مرتين ازيد من ذلك.
الضامة غير المصابة
1. وبالمثل، استخدم 4 آبار من 6 صحن جيد لتكون بمثابة عينات الضامة فقط. أضف 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المضادات الحيوية (الخطوة 2.1.2) إلى هذه الآبار.
2. كرر الخطوات من 3.3.2 إلى 3.3.6.
التحقق من العدوى
ملاحظة: باستخدام مقايسة سمية للخلايا، يمكن قياس إجادة العدوى. وسيسلط البروتوكول التالي الضوء على تطبيق منتج السمية الخلوية لقياس إطلاق LDH (اللاكتات dehydrogenase). ويمكن أيضاً استخدام منتجات أخرى للسمية الخلوية.
1. إعداد C. عدوى النُمُج الجديدة من خلايا الضامة
  1. تكرار الخطوات 1 و2 و3 (حتى 3.5). يمكن إجراء فحص LDH في ثلاث ية، إذا كان المفضل.
  2. بعد الخطوة 3.3.6، أضف 1 مل من المضادات الحيوية الخالية من المضادات الحيوية المتوسطة (2.1.2) إلى كل بئر في لوحة 6-جيدا.
  3. الخطوتان 2-4-3 و2-4-4 حتى تم ملء 3 آبار بالإضافة إلى 3n (حيث n هو عدد النقاط الزمنية التي تم قياسها).
  4. احتضان الخلايا تحت شروط المسرودة في الخطوة 2.2.8.
  5. في نقاط زمنية مختارة (على سبيل المثال، 1، 3، 6، 12، و 24 ساعة) جمع فائق لقياس إطلاق LDH وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
  6. في نفس الوقت، سيتم خلايا الضامة غير المصابة lysed إلى قيمة محددة لأقصى سمية للخلايا.
  7. حساب السمية الخلوية على النحو التالي:

4. عينة جمع

المشاركة في الثقافة وجمع الضامة غير المصابة
1. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخلايا (من 3.3.6 و 3.4.2) والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
2. إطلاق الخلايا من لوحة عن طريق التنصت لطيف من لوحة أو لطيف الأنابيب برنامج تلفزيوني الباردة ضد الخلايا.
  ملاحظة: يجب تجنب مكشط الخلية لأن هذا قد يسبب تحلل الخلايا.
3. الخلايا الماصة في أنبوب 15 مل.
4. خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة فائقة.
5. خلايا العملية (كما هو مفصل في الخطوة 5) على الفور أو فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للمعالجة في وقت لاحق.

5. بروتيوم الخلوية

ملاحظة: يجب تحسين التحلل الكافي لنوع الخلية المحلل (أي، كمية الدورات والسعة يعتمد على حجم بيليه الخلية ونسبة الطاقة من نموذج sonicator التحقيق).

تحلل خلية الضامة المصابة
1. Resuspend خلايا الكريات (الخطوة 4.1.5) في 300 ميكرولتر من 100 mM تريس-HCl (pH 8.5) تتكون من حبوب كوكتيل مثبطات البروتياز المذابة حديثا.
  ملاحظة: يتم إضافة قرص كوكتيل مثبطات البروتياز إلى 10 مل من الثلج البارد 100 mM تريس-HCl (pH 8.5) قبل بدء التجربة.
2. التحقيق سونيكات الخلايا في حمام الجليد لمدة 15 دورة من 30 ق على و 30 ق قبالة، لlyse الخلايا.
3. خلايا الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ق في 400 س ز، والحرص على عدم تشكيل بيليه ، فقط لإزالة السائل على جانبي الأنابيب تليها نقل العينة إلى 2 مل لو الربط microcentrifuge أنبوب.
4. أضف 1:10 حجم 20٪ من SDS إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪.
5. إضافة 1:100 حجم من 1 م dithiothreitol (DTT) إلى تركيز نهائي من 10 mM وخلط العينة بدقة عن طريق الأنابيب، تليها الحضانة على كتلة التدفئة الحرارية في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 800 دورة في الدقيقة الانفعالات. بعد ذلك، بارد لدرجة حرارة الغرفة (يمكن أن يتم التبريد على الجليد).
6. إضافة 1:10 حجم iodoacetamide M 0.55 (IAA) للحصول على تركيز نهائي من 55 mM وخلط العينة جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة.
7. إضافة 100٪ الأسيتون للحصول على تركيز النهائي من 80٪ الأسيتون وتخزين عينة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية لتعجيل البروتينات.
هضم البروتين
1. في اليوم التالي، وجمع بيليه راسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10،000 س ز و 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من 80٪ الأسيتون. كرر لمجموع اثنين من يغسل. بيليه الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة بعد يغسل.
2. Resolubilize بيليه البروتين في 100 ميكرولتر من 8 M urea/40 mM HEPES، لضمان solubilization كاملة، دوامة أو سونيكات في حمام الماء المثلج لمدة 15 دورة من 30 s على و 30 ق قبالة.
  ملاحظة: يتم تحديد تعديل حجم اليوريا/HEPES على حجم الكريه الخلية المترسبة، إذا حدثت تعديلات يجب تعديل جميع وحدات التخزين المصب بشكل مناسب.
3. كمي تركيز البروتين باستخدام مقايسة البروتين (على سبيل المثال، اختبار بروتين BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضبط لقياس الخلفية عن طريق التطبيع فارغة مع 8 M urea/40 mM HEPES.
4. إضافة 300 ميكرولتر من 50 mM بيكربونات الأمونيوم للحصول على تركيز النهائي من 2 م اليوريا.
  ملاحظة: فرصة لتطبيع تركيز البروتين لقياسات المصب، واقترح لهضم 100 ميكروغرام من البروتين وتخزين العينة المتبقية غير مهضومة عن طريق تجميد فلاش في النيتروجين السائل ثم تخزينها في -20 درجة مئوية على المدى القصير، أو في -80 درجة مئوية على المدى الطويل.
5. إضافة 2:50 (الخامس / ث) نسبة الإنزيم إلى البروتين من خليط التربسين / ليس - C البروتياز على الجليد والاستفادة بلطف أنبوب لخلط، احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد الحضانة، ووقف الهضم بإضافة 1:10 حجم وقف حل (20٪ acetonitrile، 6٪ حمض ثلاثي الفلوراستيكيك) وعينات أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. جمع مكبر(يتكون من الببتيدات المهضمة)والتخلص من أي حطام بيليه أو الترسب.
الببتيد desalting
1. تفعيل C18 وقف والذهاب استخراج (المرحلة) تلميح (تتكون من 3 طبقات C18 الراتنج في 200 ميكرولتر ماصات تلميح) عن طريق إضافة 100 μL من 100٪ الأسيتريتريل والطرد المركزي في 1،000 س ز لمدة 2 دقيقة.
2. اكويبيل طرف C18 STAGE بإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (80٪ (v/v) acetonitrile، 0.5٪ (v/v) حمض الخليك) والطرد المركزي في 1000 x g لمدة 2 دقيقة.
3. اكويبير طرف المرحلة C18 بإضافة 200 ميكرولتر من العازل A (2٪ (v/v) الأسيتونيتريل، 0.1٪ (v/v) حمض ثلاثي الفلوراسيدتيك، 0.5٪ (v/v) حمض الخليك) والطرد المركزي في 1000 x g لمدة 3-5 دقيقة.
4. إضافة ~ 50 ميكروغرام من العينة المهضومة على تلميح C18 المرحلة والطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3-5 دقيقة، أو حتى عينة مرت من خلال العمود تدور. فلاش تجميد العينة هضم المتبقية في النيتروجين السائل وتخزينها في -20 درجة مئوية، حتى الحاجة.
5. اغسل طرف المرحلة C18 بـ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A والطرد المركزي عند 1000 × غم لمدة 3-5 دقائق.
6. أضف 50 ميكرولتر Buffer B إلى طرف C18 STAGE والطرد المركزي بسرعة 500 x g لمدة 2 دقيقة. جمع الببتيدات eluted في أنابيب PCR 0.2 مل.
7. جفف الببتيدات المائلة في جهاز طرد مركزي فراغي لمدة 30-40 دقيقة بالسرعة القصوى. قد يتم تخزين العينات المجففة تماما في درجة حرارة الغرفة أو عند -20 درجة مئوية حتى معالجتها.
  ملاحظة: الببتيدات المجففة والمزدّرة هي عينات مناسبة من الخضوع لمرافق قياس الطيف الكتلي للمعالجة ويمكن شحنها في درجة الحرارة المحيطة.

6. قياس الطيف الكتلي

إعادة الببتيدات في 10 ميكرولتر العازلة A وقياس التركيز اللازم لحقن ~ 1.5 إلى 3 ميكروغرام الببتيدات على العمود MS. كمية العينة تعتمد على الأجهزة.
استخدام تدرج محدد مسبقا من الأسيتونتريل (حوالي 5-60٪) في 0.5٪ حمض الخليك على مدى الوقت المطلوب (على سبيل المثال، 2 ح) لفصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء، تليها التأين الكهربائي في مطياف الكتلة.
الحصول على مسح MS باستخدام مطياف كتلة عالية الدقة في وضع الاعتماد على البيانات(م / ز 300 إلى 1650).
ملاحظة: يتم تحديد النسبة المئوية للتدرج والطول بواسطة التجربة والمستخدم. تعتمد إعدادات مطياف الكتلة الدقيقة على الأجهزة والتجربة وتفضيل المستخدم.

7 - تحليل البيانات

ملاحظة: يمكن معالجة بيانات MS مع العديد من خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية. في هذا البروتوكول، نحن وصف المعالجة باستخدام منصات MaxQuant و Perseus المتاحة للجمهور ولكن نوصي المستخدمين الفرديين لتقييم أدوات المعلوماتية الحيوية المناسبة للتحليل، والتفضيل، والاستخدام.

تحميل ملفات البيانات غير المجهزة (مباشرة من أداة MS) باستخدام برنامج MaxQuant. تحديد البروتينات تحت معلمات البحث MaxQuant المعدلة؛ الحد الأدنى من اثنين من الببتيدات الفريدة اللازمة لتحديد البروتين باستخدام نهج الخداع الهدف لمعدل اكتشاف كاذبة من 1٪، تنفيذ الكم خالية من التسمية مع مطابقة بين أشواط، وتشمل الكائنات الحية ملف FASTA التي تم الحصول عليها من قاعدة بيانات UniProt (أي، Cryptococcus neoformans H99، musculus) لتحديد وتحديد كمية الببتيدات مع محرك البحث أندروميدا. استشارة أدوات MaxQuant العامة على الانترنت للحصول على الدروس التفصيلية (انظر جدول المواد).
تحميل ملف إخراج MaxQuant ('proteingroups.txt') في Perseus.
تصفية الصفوف التي تحتوي على ايجابيات كاذبة المحتملة والملوثات، فضلا عن تعديل فقط من قبل الببتيدات الموقع مع 'تصفية الصفوف على أساس عمود قاطع'.
تحويل قيم البيانات على مقياس السجل_2.
إنشاء مجموعات مجموعات البيانات عن طريق توفير تعليق توضيحي قاطع للصفوف.
تصفية مجموعة البيانات حسب القيم الصالحة لتحديد قطع للكشف عن البروتين.
ملاحظة: لإجراء تحليل صارم وقوي، يقترح معدل تعريف 50٪. على سبيل المثال، إذا تمت معالجة أربعة نسخ متماثلة ثم سيتم تحديد عدد أدنى من ثلاث قيم صالحة.
إذا كان المفضل، البيانات من قبل استبدال القيم المفقودة من التوزيع العادي.
ملاحظة: يتم تحسين القيم المُقَلَّرة استناداً إلى التوزيع العادي وتوفر كثافة LFQ عشوائية لاستبدال العناصر النائبة 'NaN' لمحاكاة قياسات الوفرة النموذجية. ويوفر هذا التسريب منصة للتحليل الإحصائي في المراحل النهائية التي تتطلب بيانات قابلة للقياس الكمي.
إضافة تعليقات توضيحية إلى صفوف البروتين (مثل أسماء البروتينات، مصطلحات علم الجينات).
ملاحظة: هذا سير العمل Perseus ولدت الآن إطار عمل قوي لمزيد من المعالجة الحيوية، والتحليل الإحصائي، وتصور البيانات، والتشاور العامة Perseus أدوات على الانترنت للدروس مفصلة (انظر جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المبين أعلاه يتيح تحديد وكمية البروتينات المستمدة من كل من الممرض الفطري، C. neoformans،والمضيف، خلايا الضامة، في تجربة واحدة. وبعد الاستزراع المشترك، يتم جمع الخلايا ومعالجتها معًا وفصلها بيولوجيًا على أساس ملامح الببتيد الخاصة بكل نوع. هذا هو نهج قوي لتحديد التفاعل بين العلاقة المضيفة - الممرض أثناء العدوى. يعتمد عدد البروتينات التي تم تحديدها من التجربة على مادة البداية، وإعداد العينة، وطول التدرج، وأدوات التصلب المتعدد، وسير العمل الحيوي. باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، فإننا عادة ما نحدد حوالي 8...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد خلايا الضامة وجمع عينات من الثقافة المشتركة لمعالجة البروتين مع الحد الأدنى من التعطيل للخلايا. من المهم تنفيذ خطوات الغسيل والتطعيم وإزالة خلايا الضامة المتمسكة بلطف وعناية لمنع تحلل الخلايا غير الضرورية قبل جمعها. إنشاء وزارة الداخلية الصحيح للتجربة هو أيضا أمر بالغ الأهمية كما تلقيح مع وزارة الداخلية عالية بشكل مفرط يمكن أن يسبب موت الخلايا الضامة السريع وصعوبة في جمع ومعالجة العينات للتصلب المتعدد. على العكس من ذلك، فإن أعداد وزارة الداخلية منخفضة يؤدي إلى خلايا فطرية أقل بال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عن عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور جوناثان كريغر من شركة حلول المعلوماتية الحيوية لتشغيله مطياف الكتلة للتجارب التمثيلية ، وكذلك أعضاء مجموعة Geddes-McAlister لمساعدتهم في الإعداد التجريبي والتغذية المرتدة للمخطوطة. يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي، جزئياً، من مؤسسة بانتينغ للبحوث – جائزة اكتشاف الزمالة Jarislowsky, صندوق أبحاث الحدود الجديدة – استكشاف (NFRFE-2019-00425)، والمؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) لJ.G.M.، فضلا عن منحة الدراسات العليا NSERC كندا – منحة الماجستير والدراسات العليا أونتاريو لB.B., والملكة إليزابيث الثانية منحة الدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا ل.S.S..

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.5	فيشر Scientific	BP152-1	تحافظ على 4 درجة ؛ طبق C
60 × 15 مم ، Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
لوحة ثقافة الخلايا المكونة من 6 آبار	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrile ، درجة MS	بيرس	TS-51101
حمض الخليك	سيجما ألدريتش	1099510001
الأسيتون	سيجما ألدريتش	34850-1 لتر
الأمونيوم بيكربونات (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	قم بإعداد محلول ABC سعة 50 ملي مولار ، مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر واحد.
بيل آرت & تجارة; نظام جمع شفاط الفراغ HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	ليس ضروريا ، يمكن استخدام الماصات المصلية لإزالة الوسائط.
C18 راتنج	3M Empore	3M2215
كاشطات الخلايا	VWR	10062-906	ليست ضرورية ، يمكن استخدام طرق أخرى لإطلاق خلايا البلاعم.
مكثف فراغ الطرد المركزي	Eppendorf	07-748-15
وحدة الترشيح الكاملة	VWR	10040-436
أنابيب الصقر المخروطية (15 مل)	فيشر ساينتفيك	05-539-12
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآلي	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	ليس ضروريا ، يمكن استخدام مقياس الدم كبديل.
CytoTox 96 فحص السمية الخلوية غير المشعة	Promega	G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher	Scientific	R0861	تحضير محلول مخزون سائب من 1 M DTT ، مجمد ومفاجئ ومخزن عند -20 درجة ؛ ج حتى الاستخدام. تخلص منها بعد كل استخدام (لا تجمد وتذوب بشكل متكرر).
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	تعطيل الحرارة عن طريق الحضانة عند 60 درجة ؛ ج لمدة 30 دقيقة. تحضير 50 مل من الكميات وتجميدها سريعا. ذوبان الجليد قبل تحضير الوسائط
الدم	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	تحضير 40 ملي مولار HEPES / 8 M اليوريا في محلول مخزون سائب ، مجمد فلاش ، تخزينه عند -20 درجة ؛ ج حتى الاستخدام. تخلص منها بعد كل استخدام (لا تجمد وتذوب بشكل متكرر).
يعتمد طول التدرج في نظام الكروماتوغرافيا السائلة عالي الأداء	ThermoFisher Scientific	LC140	على تعقيد العينة ، وهو تدرج موصى به لمدة 120 دقيقة لعينات العدوى.
مطياف الكتلة عالي الدقة	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	تحضير محلول مخزون سائب 0.55 متر ، مجمد فلاش ، تخزين في -20 درجة ؛ ج حتى الاستخدام. تخلص منها بعد كل استخدام (لا تجمد وتذوب بشكل متكرر).
25030081	L-glutamine	ThermoFisher Scientific	وتجميدها للتخزين. قم بإذابة الثلج قبل إعداد الوسائط.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant هي منصة عامة تقدم دروسا تعليمية ، مثل مدرسة MaxQuant الصيفية ، تحدد خطوات التحليل الحسابي لمجموعات بيانات MS الكبيرة
الطرد المركزي	الدقيقة Eppendorf	13864457
Penicillin: Streptomycin 10k / 10k	VWR	CA12001-692	يمكن أن تكون متجمدة ومجمدة للتخزين. قم بإذابة الثلج قبل إعداد الوسائط.
أعمدة فصل الببتيد	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
الفوسفات المخزنة المالحة	VWR	CA12001-676	Puchase غير مطلوبة. يمكن أيضا تحضير PBS ولكن يجب إجراء الترشيح المعقم قبل الاستخدام.
بيرس BCA فحص البروتين	ThermoFisher العلمية	23225
ماصة ، مصلية يمكن التخلص منها (10 مل)	فيشر Scientific	13-678-11E
، مصلية يمكن التخلص منها (25 مل) باسيكس	فيشر 14955235
مسبار سونسيتور	ThermoFisher Scientific	100-132-894
قرص كوكتيل مثبط للبروتياز	روش	4693159001
كبريتات دوديسيل الصوديوم	ThermoFisher Scientific	28364	20٪ (وزن / حجم)
مقياس الطيف الضوئي (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE قلب جهاز الطرد المركزي	Sonation	STC-V2
شاكر حراري	VWR	NO89232-908
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك	ThermoFisher Scientific	85183
مزيج البروتياز Trypsin / Lys-C ، درجة MS	بيرس	A40007	الحفاظ على -20 درجة مئوية.
حمام بالموجات فوق الصوتية	برانسونيك	A89375-450	مخزنة في غرفة باردة (4 درجة مئوية)
اليوريا	سيجما ألدريتش	U1250-1KG	تحضير 40 ملي مولار HEPES / 8 M اليوريا في محلول مخزون سائب ، مجمدة ، تخزينها عند -20 درجة ؛ ج حتى الاستخدام. تخلص منها بعد كل استخدام (لا تجمد وتذوب بشكل متكرر).
مرق سكر العنب بمبتون الخميرة	BD Difco	BM20

مقياس يمكن أجهزة ماصة العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles