Method Article

البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي

DOI:

10.3791/61908

⸱

October 28th, 2020

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح من الواضح أن الحمض النووي الريبي موجود في تجويف الأمعاء والبراز في الحيوانات والبشر. يعزل البروتوكول الموصوف أدناه إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي من عينات البراز من الحيوانات والبشر. الهدف هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي بنقاوة وكمية عالية للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول الأمثل في عزل miRNA في قدرات عزل منتجات الحمض النووي الريبي عالية النقاء مع خطوات غسيل إضافية موصوفة ، وزيادة كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بطريقة محسنة في إعادة تعليق العينة ، ونصائح مهمة لإزالة التلوث. أحد القيود هو عدم القدرة على معالجة وتنقية عينة أكبر من أكثر من 200 ملغ لأن أحجام العينات هذه قد تسبب صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالتالي ، فإن حجم العينة الكبير قد يلوث المرحلة المائية المراد استخراجها كما هو موضح في البروتوكول مع المواد العضوية التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي المعزول في النهاية. ومع ذلك ، فإن عزلات الحمض النووي الريبي من عينة تصل إلى 200 ملغ كافية لمعظم التحليلات النهائية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التعرف على الحمض النووي الريبي خارج الخلية كعامل مهم يتوسط العديد من العمليات البيولوجية1. تم الإبلاغ عن الحمض النووي الريبي خارج الخلية في البراز لأول مرة في عام 2008 كعلامة لسرطان القولون والتهاب القولون التقرحيالنشط 2 ، وتم الكشف عنه مؤخرا كمكون طبيعي لتجويف الأمعاء والبراز ويتوسط اتصالات ميكروب المضيف3،4،5. الغرض من بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هذا هو استخراج الحمض النووي الريبي خارج الخلية عالي الجودة من عينات البراز التي تم جمعها من الحيوانات والبشر. تم تكييف البروتوكول من مجموعة عزل miRNA التجارية. يتم استخدام الح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على البحث الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بريغهام والنساء ، كلية الطب بجامعة هارفارد.

تتوافق جميع الطرق التي تتضمن موضوعات البحث البشري الموضحة هنا مع الإرشادات التي وضعتها لجنة الأبحاث البشرية للشركاء.

1. جمع عينات البراز

  1. الأوتوكلاف أو إعداد أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وخالي من النيوكلياز سعة 2 مل مع غطاء لولبي لكل موضوع في التجربة.
    1. بالنسبة للبشر ، قم بتوفير جهاز جمع عينات براز مناسب وخالي من النيوكلياز ومعقم لكل موضوع.
  2. جمع 25-100 ملغ (حوالي 1-4 كريات برازية لعينات براز الفأر) من عينات البر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الحمض النووي الريبي التمثيلي من عينات براز الفئران 50 ملغ (2 كريات براز الفئران) و 100 ملغ من عينات البراز البشري على التوالي واستخلصت في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. يشير تحليل مقياس الطيف الضوئي للتركيز إلى عزل كمية إجمالية قدرها 49 ميكروغرام و 16 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي على التوالي (الجدول 1). كانت نقاء الحمض النووي الريبي عالية كما هو موضح بنسبة A260 / A280 ~ 2.0 ونسبة A260 / A230 ~ 1.8 (الجدول 1). كما ورد في3 ، فإن غالبية الحمض ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المهم استخدام تقنية خالية من RNase لمنع تلوث RNase أثناء العزل7. بعد الطرد المركزي وتشكيل الطور البيني المضغوط ، من المهم تجنب الطور البيني والمرحلة السفلية وملوث الجسيمات العائم على قمة الطور المائي عند استعادة المرحلة المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوتين للغسيل بمحلول غسيل 500 ميكرولتر و 250 ميكرولتر 2/3 للتخلص من الملوثات في غشاء المرشح للحصول على جودة محسنة. علاوة على ذلك ، لا ينصح باستخدام مادة عينة بداية تزيد عن 200 مجم لأنها قد تخلق صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالمثل ،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بطريقة البحث الموضحة في ورقة البروتوكول هذه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقينا مساعدة فنية من مرفق البوليمرات الحيوية في كلية الطب بجامعة هارفارد للمحلل الحيوي. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد RG-1707-28516 (H.L.W. و S.L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الفينول: الكلوروفورم ، درجة الحموضة 4.5 (مع IAA ، 125: 24: 1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيومThermo Fischer Scientific14190-144
قفازات
الطرد
الدقيق mirVana miRNAIsolation Kit Thermo Fischer ScientificAM1561
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من النوكلياز (1.5 مل ، 2 مل)
مياه خالية من النوكلياز (غير معالجة ب DEPC)Thermo Fischer ScientificAM9937
وأطراف ماصة خالية من النوكلياز (مع فلتر)
PowerLyzer 24 HomogenQIAGEN13155
RNaseZap RNase محلول إزالة التلوثThermo Fischer ScientificAM9780
دوامة شاكر
المركزيماصة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fecal RNA IsolationMicroRNA ExtractionAcid Phenol ChloroformRNA PurificationSample ResuspensionCentrifugation ProtocolFilter Cartridge WashNuclease Free WaterChip ElectrophoresisAbsorbance Ratio

Related Articles