في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة فقط عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC) في نظام ميكروفلويديك.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب المجالات الكهربائية الفسيولوجية (EF) أدوارا حيوية في هجرة الخلايا والتمايز والانقسام والموت. تصف هذه الورقة نظام زراعة الخلايا الدقيقة الذي تم استخدامه لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل باستخدام المجهر. يتكون النظام microfluidic من المكونات الرئيسية التالية: رقاقة كهربائية شفافة بصريا ، وسخان شفاف لأكسيد القصدير (ITO) ، ومضخة تعبئة وسائط الثقافة ، وإمدادات الطاقة الكهربائية ، ومكبر صوت عالي التردد ، ومضاعف EF ، ومرحلة آلية قابلة للبرمجة X-Y-Z ، ومجهر مقلوب على النقيض من الطور مجهز بكاميرا رقمية. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. يتضمن هذا العمل التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC). في المتوسط صيانة الخلايا الجذعية، وNPCs الماوس (mNPCs) تفرقت في الخلايا العصبية، والخلايا الفلكية، وoligodendrocytes بعد التحفيز نبض العاصمة. وتشير النتائج إلى أن العلاج البسيط لنبض DC يمكن أن يتحكم في مصير ال MNPCs ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية لاضطرابات الجهاز العصبي. يمكن استخدام النظام زراعة الخلايا في قنوات متعددة، لتحفيز EF على المدى الطويل، للمراقبة المورفولوجية الخلية، والحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني. هذا النظام microfluidic ليس فقط يقصر الوقت التجريبي المطلوب، ولكن أيضا يزيد من دقة السيطرة على البيئة الدقيقة.
المقدمة
يمكن أن تكون الخلايا السليفة العصبية (NPCs ، المعروفة أيضا باسم الخلايا الجذعية العصبية والذرية) كمرشح واعد للاستراتيجية العلاجية العصبية1. الشخصيات غير المتمايزة لديها قدرة التجديد الذاتي، متعددة الفعالية، والقدرة على الانتشار2،3. وقد ذكرت دراسة سابقة أن المصفوفة خارج الخلية والوسطاء الجزيئية تنظيم التمايز من المجلس الوطني للصحافه. عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) تعزيز انتشار المجلس الوطني للصحافه، وبالتالي الحفاظ على الدولة غير المتمايزة4.
وقد ذكرت الدراسات السابقة أن التحفيز الكهربائي يمكن تنظيم الأنش....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم وتصنيع رقاقة MOE
- رسم أنماط لطبقات الميثاكريل البولي ميثيل الفردية (PMMA) والشريط على الوجهين باستخدام البرامج المناسبة(الشكل 1A، جدول المواد). قطع كل من أوراق PMMA والشريط على الوجهين مع CO2 آلة الليزر ناسخ (الشكل 1B).
- قم بتشغيل جهاز نسخ ليزر CO2 وتوصيله بجهاز كمبيوتر شخصي. افتح ملف النقش المصمم باستخدام البرنامج.
- ضع أوراق PMMA (275 مم × 400 مم) أو الشريط على الوجهين (210 مم × 297 مم) على منصة كاتب الليزر(الشكل 2A). ركز الليزر على سطح أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام أداة التركيز التلقائي. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر التكوين التفصيلي لشريحة MOE في الشكل 1. توفر رقاقة microfluidic نهجا مفيدا لتقليل حجم الإعداد التجريبي وحجم العينة وحجم الكاشف. تم تصميم رقاقة MOE لإجراء ثلاث تجارب تحفيز EF مستقلة والعديد من حالات التثبيط المناعي في وقت واحد في دراسة واحدة(الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقاقة MOE ، التي تتمتع بشفافية بصرية عالية مناسبة لفحوصات المجهر confocal. تم تصميم رقاقة MOE أيضا للتحقيق في آثار ظروف ثقافة الخلايا المختلفة (على سبيل ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أثناء تصنيع رقاقة MOE ، يتم إرفاق المحولات بالطبقة 1 من رقاقة MOE مع غراء سيانواكريلات سريع المفعول. يتم تطبيق الغراء على 4 زوايا من المحولات، ومن ثم يتم تطبيق الضغط بالتساوي على محولات. يجب تجنب كمية زائدة من الغراء لضمان البلمرة كاملة من الغراء. وعلاوة على ذلك، يتم احتضان تجميع رقاقة MOE المكتملة في غرفة فراغ. تساعد هذه الخطوة على إزالة الفقاعات بين طبقة PMMA والشريط على الوجهين وزجاج الغطاء.
ويستند اختيار مادة القطب على حقيقة أن أيونات الكلوريد ، الموجودة بوفرة في الوسط ، هي المنتجات المنحل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون البروفيسور تانغ ك. تانغ، معهد العلوم الطبية الحيوية، أكاديميا سينيكا، على مساعدته في توفير الخلايا الجذعية العصبية للفأر والخلايا السلف (mNPCs). كما يشكر المؤلفان البروفيسور تانغ ك. تانغ والسيدة ينغ شان لي على مناقشتيهما القيمة بشأن التمييز بين الشخصيات غير الوطنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ركائز PMMA 1 مم (طبقات 1-3) | BHT | K2R20 | بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) ، أنبوب بلاستيكي http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 مل | Protech Technology Enterprise Co.، Ltd | CT-15-PL-TW | أنبوب مخروطي القاع مع غطاء ، مجمعة ، معقمة |
| مسبقا 3 مل حقنة | TERUMO | DVR-3413 | 3 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة |
| 3 مم من الدرجة البصرية PMMA (الطبقة 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA ورقة | بصرية الصف PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | معقمة يمكن التخلص منها 3 اتجاهات محبس |
| 5 مل حقنة | TERUMO | DVR-3410 | 5 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة |
| محول | Dong Zhong Co.، Ltd. | محول PMMA | مخصص |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose ، مكبر للصوت في درجة حرارة التبلور المنخفضة |
| AA Lab Systems Ltd | A-304 | مضخم الجهد | |
| العالي برنامج AutoCAD | Autodesk | النسخة التعليمية | صياغة |
| الملحق B-27 مكمل | Gibco | 12587-010 | B-27 (50x) ، ناقص فيتامين أ |
| عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) ؛ | Peprotech | AF-100-18B | يسمى أيضا المؤتلف البشري FGF-bas |
| المطاط الأسود سداد المطاط | TERUMO | DVR-3413 | من 3 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | كاشف حجب ؛ |
| جهاز الطرد المركزي | HSIANGTAI | CV2060 | جهاز الطرد المركزي |
| CO2< / sub> ليزر كاتب | أدوات الليزر والتقنيات Corp. | ILS-II | تم شراؤها من موصل |
| مخروطي | IDEX Health & Science | F-120X | قطعة واحدة محكمة الإصبع 10-32 مخروط ، لمحول مخروطي طبيعي 1/16 بوصة OD |
| IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 أنثى إلى أنثى Luer ، نظرة خاطفة | |
| مجهر مضان متحد البؤر | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 دليل مستخدم ، كاميرا رقمية |
| http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf OLYMPUS | E-330 | الحصول التلقائي على الصور بفاصل زمني | |
| راسم الذبذبات الرقمي | Tektronix | TDS2024 | قياس إشارات الجهد أو التيار بمرور الوقت في دائرة إلكترونية أو مكون لعرض السعة والتردد. |
| شريط على الوجهين | 3M | PET 8018 | تم شراؤها من http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco' s النسر المعدل s متوسط / خليط المغذيات هام F-12 (DMEM / F12) | Gibco | 12400024 | DMEM / F-12 ، مسحوق ، HEPES |
| Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS ، مسحوق ، بدون كالسيوم ، لا مغنيسيوم |
| مضاعف EF | Asiatic Sky Co.، Ltd. | مراقبة مخصصة | والتحكم في التيار الكهربائي في القنوات الفردية |
| عامل نمو البشرة (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | وتسمى أيضا EGF البشري |
| المؤتلف غراء سيانوا أكريليت سريع المفعول | 3M & nbsp ؛ | 7004T | لاصق فوري قوي (سائل) |
| موصل القاع المسطح | IDEX Health & Science | P-206 | الجوز الذكور بدون شفة Delrin ، 1 / 4-28 قاع مسطح ، ل 1/16 "OD الأزرق |
| مولد وظيفة | Agilent Technologies | 33120A | عالي الأداء 15 ميجاهرتز مركبة ؛ مولد الوظيفة مع قدرة مدمجة على شكل موجة تعسفية |
| الماعز المضادة للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | الماعز المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 488) الماعز الممتزة |
| مسبقا المضادة للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | الماعز الجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة للأرانب IgG - H& L (Alexa Fluor 555) ، الممتزة |
| مسبقا Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear Staining |
| ImageJ software | المعاهد الوطنية للصحة | 1.48 فولت | تحليل صور الفلورسنت ؛ |
| الإنديوم– القصدير – أكسيد (ITO) زجاج | Merck | 300739 | لسخان ITO |
| مجهر تباين الطور المقلوب | OLYMPUS | CKX41 | لمراقبة مورفولوجيا الخلية |
| مزدوجة حرارية من النوع K | Tecpel | TPK-02A | درجة الحرارة ؛ المزدوجات الحرارية |
| محول لور | IDEX Health & Science | P618-01 | محول لور أنثى لوير إلى 1 / 4-28 ذكر بولي بروبيلين |
| لوير قفل حقنة | TERUMO | DVR-3413 | لجسور ملح أجار |
| الماوس المضاد ل GFAP | eBioscience | 14-9892 | علامات الخلايا النجمية |
| Oligodendrocyte ؛ علامة O4 الأجسام المضادة | R & D Systems | MAB1326 | Oligodendrocyltes علامة |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing عامل |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | الحياة الأساسية | BL2651 | محلول الغسيل |
| Poly-L-Lysine (PLL) | محلول طلاء SIGMA | P4707 | |
| غطاء دقيق سماكة نظارات رقم 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| للبرمجة XYZ المرحلة الآلية | Tanlian تم شراء شركة | Inc حسب الطلب | من http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional– متكامل &ndash ؛ وحدة تحكم مشتقة (PID) | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | وحدة تحكم في درجة الحرارة ؛ |
| أنبوب PTFE | المهنية البلاستيك Inc. فرع تايوان | القطر الخارجي 1/16 بوصة | PTFE بيضاء شفافة |
| الأرنب المضادة ل Tuj1 | Abcam | ab18207 | مضخة حقنة علامة الخلايا العصبية |
| New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 مضخة حقنة واحدة قابلة للبرمجة | |
| TFD4 منظف | FRANKLAB | TFD4 | منظف زجاج |
| بوندر حراري | شركة Kuan-MIN Tech | تم شراؤها حسب الطلب | من http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | محلول نفاذية |
| منظف بالموجات فوق الصوتية | LEO | LEO-300S | منظف بالموجات فوق الصوتية غرفة |
| فراغ | DENG YNG INSTRUMENTS CO.، LTD. | DOV-30 | فرن تجفيف بالفراغ |
| قابس أبيض محكم | الإصبع IDEX Health & العلوم | P-316 | 1 / 4-28 مسطح القاع ، https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
المراجع
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orient....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
