مقالة منهجية

تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة

DOI:

10.3791/61917

⸱

أبريل 14, 2021

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة فقط عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC) في نظام ميكروفلويديك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب المجالات الكهربائية الفسيولوجية (EF) أدوارا حيوية في هجرة الخلايا والتمايز والانقسام والموت. تصف هذه الورقة نظام زراعة الخلايا الدقيقة الذي تم استخدامه لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل باستخدام المجهر. يتكون النظام microfluidic من المكونات الرئيسية التالية: رقاقة كهربائية شفافة بصريا ، وسخان شفاف لأكسيد القصدير (ITO) ، ومضخة تعبئة وسائط الثقافة ، وإمدادات الطاقة الكهربائية ، ومكبر صوت عالي التردد ، ومضاعف EF ، ومرحلة آلية قابلة للبرمجة X-Y-Z ، ومجهر مقلوب على النقيض من الطور مجهز بكاميرا رقمية. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. يتضمن هذا العمل التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC). في المتوسط صيانة الخلايا الجذعية، وNPCs الماوس (mNPCs) تفرقت في الخلايا العصبية، والخلايا الفلكية، وoligodendrocytes بعد التحفيز نبض العاصمة. وتشير النتائج إلى أن العلاج البسيط لنبض DC يمكن أن يتحكم في مصير ال MNPCs ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية لاضطرابات الجهاز العصبي. يمكن استخدام النظام زراعة الخلايا في قنوات متعددة، لتحفيز EF على المدى الطويل، للمراقبة المورفولوجية الخلية، والحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني. هذا النظام microfluidic ليس فقط يقصر الوقت التجريبي المطلوب، ولكن أيضا يزيد من دقة السيطرة على البيئة الدقيقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون الخلايا السليفة العصبية (NPCs ، المعروفة أيضا باسم الخلايا الجذعية العصبية والذرية) كمرشح واعد للاستراتيجية العلاجية العصبية1. الشخصيات غير المتمايزة لديها قدرة التجديد الذاتي، متعددة الفعالية، والقدرة على الانتشار2،3. وقد ذكرت دراسة سابقة أن المصفوفة خارج الخلية والوسطاء الجزيئية تنظيم التمايز من المجلس الوطني للصحافه. عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) تعزيز انتشار المجلس الوطني للصحافه، وبالتالي الحفاظ على الدولة غير المتمايزة4.

وقد ذكرت الدراسات السابقة أن التحفيز الكهربائي يمكن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية الخلية مثل القسم5، الهجرة6،7،8، التمايز1،9،10، وموت الخلية11. تلعب المجالات الكهربائية (EFs) أدوارا حيوية في تطوير وتجديد تطوير الجهاز العصبي المركزي12و13و14. من 2009 إلى 2019، قام هذا المختبر بالتحقيق في الاستجابات الخلوية لتطبيق EF في النظام الدقيق1، 6،7،8،15،16،17. تم تصميم رقاقة متعددة القنوات وشفافة بصريا والكهربائية (MOE) لتكون مناسبة لتلطيخ immunofluorescence للتنظير المجهري الكونف البؤري. كانت الشريحة ذات شفافية بصرية عالية ومتانة جيدة وسمحت بإجراء ثلاث تجارب تحفيز مستقلة في وقت واحد والعديد من الحالات الملطخة بالمناعة في دراسة واحدة. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. تصف هذه الورقة تطور نظام زراعة الخلايا الدقيقة التي استخدمت لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم وتصنيع رقاقة MOE

  1. رسم أنماط لطبقات الميثاكريل البولي ميثيل الفردية (PMMA) والشريط على الوجهين باستخدام البرامج المناسبة(الشكل 1A، جدول المواد). قطع كل من أوراق PMMA والشريط على الوجهين مع CO2 آلة الليزر ناسخ (الشكل 1B).
    1. قم بتشغيل جهاز نسخ ليزر CO2 وتوصيله بجهاز كمبيوتر شخصي. افتح ملف النقش المصمم باستخدام البرنامج.
    2. ضع أوراق PMMA (275 مم × 400 مم) أو الشريط على الوجهين (210 مم × 297 مم) على منصة كاتب الليزر(الشكل 2A). ركز الليزر على سطح أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام أداة التركيز التلقائي.
    3. حدد كاتب الليزر كطابعة، ثم "طباعة" النمط باستخدام كاتب الليزر لبدء الاستئصال المباشر على ورقة PMMA أو الشريط على الوجهين والحصول على أنماط فردية على ورقة PMMA أو الشريط(الشكل 2B).
  2. إزالة الفيلم واقية من أوراق PMMA، وتنظيف السطح باستخدام غاز النيتروجين.
    ملاحظة: الرسم نمط PMMA والآلات المباشرة من ورقة PMMA تم تنفيذها وفقا لتقرير سابق17.
  3. للترابط معا طبقات متعددة من أوراق PMMA، كومة ثلاث قطع من أوراق PMMA 1 ملم (طبقات 1 و 2 و 3)، والسندات لهم تحت ضغط من 5 كجم / سم2 في عبودية الحرارية لمدة 30 دقيقة في 110 درجة مئوية لتشكيل تدفق / الكهربائية تنشيط قناة التجميع (الشكل 2C).
    ملاحظة: دفعات مختلفة من ورقة PMMA التي تم الحصول عليها تجاريا لها درجة حرارة انتقال الزجاج مختلفة قليلا (TG). درجة الحرارة الترابط الأمثل يحتاج إلى اختبار في 5 درجة مئوية زيادات قريبة من TG.
  4. الالتزام 12 قطعة من محولات لفتحات الفردية في طبقة 1 من التجمع رقاقة وزارة التربية والتعليم مع الغراء سيانواكريلات سريع المفعول.
    ملاحظة: يتم إجراء محولات من PMMA عن طريق حقن صب. الأسطح المسطحة في الأسفل هي للاتصال بشريحة MOE. محولات تحمل 1/4W-28 الخيط المسمار الإناث هي لربط المقابس البيضاء إصبع ضيق، موصلات أسفل شقة، أو محولات لوير. كن حذرا عند استخدام الغراء سيانواكريلات سريع المفعول. تجنب الرش في العينين.
  5. تطهير ركائز PMMA 1 مم (طبقات 1-3)، الشريط على الوجهين (طبقة 4)، و3 مم درجة بصرية PMMA (طبقة 5) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) لمدة 30 دقيقة قبل تجميع رقاقة (الشكل 1A).
  6. الالتزام ركائز PMMA 1 ملم (طبقات 1-3) على 3 مم درجة بصرية PMMA (طبقة 5) مع الشريط على الوجهين (طبقة 4) لإكمال التجميع PMMA (طبقات 1-5) (الشكل 1A).
  7. إعداد الزجاج غطاء نظيفة للتجميع على رقاقة.
    1. ملء تخفيف عشرة أضعاف من المنظفات في جرة تلطيخ (انظر جدول المواد)،وتنظيف الزجاج الغطاء في هذا المنظفات باستخدام منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
    2. شطف جيدا جرة تلطيخ تحت مياه الصنبور الجارية لإزالة جميع آثار المنظفات.
    3. استمر في الشطف بالماء المقطر لإزالة جميع آثار مياه الصنبور، وكرر الخطوة 1.7.2 مرتين.
    4. جفف زجاج الغطاء النظيف عن طريق نفخه بغاز النيتروجين.
  8. تطهير التجمع PMMA (طبقات 1-5)، الشريط على الوجهين (طبقة 6)، والزجاج الغطاء (طبقة 7) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية داخل خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة قبل تجميع رقاقة(الشكل 1A).
  9. الالتزام الزجاج غطاء تنظيف (طبقة 7) إلى التجمع PMMA (طبقات 1-5) مع الشريط على الوجهين (طبقة 6) (الشكل 1A).
  10. احتضان رقاقة وزارة التربية والتعليم في غرفة فراغ بين عشية وضحاها; استخدام تجميع رقاقة MOE للإجراءات اللاحقة (الشكل 3).

2. طلاء بولي L-ليسين (PLL) على الركيزة في مناطق ثقافة الخلية

  1. إعداد أنبوب البوليتيترافلوروإيثيلين، موصل شقة القاع، موصل مخروط، محول مخروط لوير، أبيض الاصبع ضيق المكونات (وتسمى أيضا سدادة)، محول لوير، حقنة قفل لوير، والمطاط الأسود بونغ (الشكل 4A، جدول المواد). تعقيم جميع المكونات المذكورة أعلاه في الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. ختم فتحات محولات جسر أجار(الشكل 1A)مع المقابس إصبع ضيق أبيض. قم بتوصيل الموصل المسطح السفلي بتجميع شرائح MOE عبر محولات المدخل والمأخذ المتوسطة(الشكل 4B). قم بتوصيل محول مخروط Luer ب stopcocks ثلاثية الاتجاه.
  3. إضافة 2 مل من محلول PLL 0.01٪ باستخدام حقنة 3 مل التي تتصل ب stopcock 3-way من مدخل المتوسطة (الشكل 4B- figure-protocol-1 ).
  4. توصيل حقنة فارغة 3 مل إلى stopcock 3-طريقة من منفذ المتوسطة (الشكل 4B- figure-protocol-2 ).
  5. ملء مناطق ثقافة الخلية مع الحل PLL. ضخ يدويا حل الطلاء ذهابا وإيابا ببطء. أغلق الحطابين الثلاثيين لإغلاق الحل داخل مناطق الثقافة.
  6. احتضان رقاقة MOE عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة مليئة بجو ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.

3. إعداد شبكة جسر الملح

  1. بعد الخطوة 2.6، افتح اثنين من stopcocks 3-way وطرد الفقاعات في القنوات عن طريق ضخ يدويا حل الطلاء ذهابا وإيابا في القناة باستخدام الحقنتين.
  2. رسم 3 مل من المتوسطة كاملة (الخلايا الجذعية صيانة المتوسطة تتكون من Dulbecco تعديل النسر المتوسطة / هام خليط المواد الغذائية F-12 (DMEM/F12), 2٪ B-27 الملحق, 20 نانوغرام / مل EGF، و 20 نانوغرام / مل bFGF) في حقنة 3 مل الذي يربط إلى stopcock 3-way من مدخل المتوسطة (الشكل 4B- figure-protocol-3 والشكل 4B- figure-protocol-4 ).
  3. إضافة 3 مل من المتوسطة كاملة لتحل محل حل الطلاء في مناطق ثقافة الخلية. توصيل حقنة فارغة 5 مل إلى stopcock 3-way من منفذ متوسط (الشكل 4B- figure-protocol-5 ).
  4. إعداد شبكة جسر الملح (الشكل 5).
    1. قطع بونغ المطاط الأسود لإنتاج فجوة، وإدراج الفضة (Ag) / كلوريد الفضة (AgCl) الأقطاب الكهربائية من خلال بونغ المطاط الأسود وإلى حقنة قفل لوير(الشكل 4A).
    2. استبدال المكونات إصبع أبيض مع محول لوير، وحقن 3٪ الآغاروز الساخن لملء محول لوير.
      ملاحظة: لإعداد الآغاروز الساخن، حل 3 غرام من مسحوق الآغاروز في 100 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) وتعقيمها في الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بتوصيل حقنة قفل Luer بمحول Luer. حقن 3٪ agarose الساخنة من خلال بونغ المطاط الأسود لملء حقنة قفل لوير باستخدام الحقنة مع إبرة. السماح 10 إلى 20 دقيقة لأغاروز لتهدئة وترسيخ.
      ملاحظة: من أجل زيادة سعة حجم agarose، يتم تركيب حقنة قفل Luer على محول Luer(الشكل 4 والشكل 5). ثم يتم إدخال الأقطاب الكهربائية الكبيرة في حقنة قفل Luer. القطب قادر على توفير التحفيز الكهربائي مستقرة للتجربة على المدى الطويل.

4. إعداد ال MNPCs

  1. ثقافة mNPCs1 في الوسط الكامل في قارورة ثقافة الخلية 25T في 37 درجة مئوية في حاضنة مليئة 5٪ CO2 الغلاف الجوي. زراعة الخلايا الفرعية كل 3-4 أيام، وإجراء جميع التجارب مع الخلايا التي خضعت 3-8 مقاطع من المصدر الأصلي.
  2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وتدور أسفل الأعصاب في 100 × غرام لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant ، وغسل الأعصاب مع برنامج تلفزيوني 1x دولبيكو (DPBS). تدور أسفل الأعصاب في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
  3. يستنشق DPBS 1x ومن ثم إعادة إنفاق الأعصاب في الوسط الكامل. تخلط جيدا وبلطف.
  4. إضافة 1 مل من تعليق العصبي باستخدام حقنة 1 مل الذي يربط إلى stopcock 3-طريقة للمنفذ (الشكل 4B- figure-protocol-6 ).

5. إعداد نظام microfluidic لتحفيز نبض العاصمة (الشكل 6)

  1. قم بتثبيت رقاقة MOE ذات البذور الخلوية على سخان ITO الشفاف المثبت على مرحلة قابلة للبرمجة مزودة بمحرك X-Y-Z.
    ملاحظة: يتم التحكم في درجة حرارة سطح ITO بواسطة وحدة تحكم مشتقة متكاملة نسبيا ويتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية. يتم تثبيت مزدوج حراري من نوع K بين الشريحة وسخان ITO لمراقبة درجة حرارة مناطق ثقافة الخلية داخل الشريحة. يتم تثبيت رقاقة MOE على مرحلة قابلة للبرمجة X-Y-Z الآلية ومناسبة للحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني في أقسام القناة الفردية. وقد وصفت تصنيع سخان ITO والإعداد لنظام التدفئة ثقافة الخلية سابقا18،19.
  2. غرس mNPCs عن طريق الضخ اليدوي في رقاقة MOE عبر منفذ متوسط. احتضان رقاقة MOE المصنفة بالخلايا على سخان ITO 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
  3. بعد 4 ساعة، ضخ المتوسطة كاملة من خلال رقاقة MOE عبر مدخل المتوسطة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة باستخدام مضخة حقنة.
    ملاحظة: نمت والحفاظ على mNPCs في رقاقة إضافية 24 ساعة قبل التحفيز EF للسماح مرفق الخلية والنمو. يتم جمع السائل النفايات في حقنة فارغة 5 مل متصلة stopcock 3-الاتجاه للمنفذ، كما هو موضح في "النفايات" في الشكل 6A. يظهر تكوين نظام MOE microfluidic في الشكل 6. يوفر هذا النظام microfluidic إمدادات مستمرة من التغذية للخلايا. يتم ضخ المتوسطة الطازجة كاملة باستمرار في رقاقة وزارة التربية والتعليم للحفاظ على قيمة درجة الحموضة ثابت. لذلك، يمكن استزراع الخلايا خارج حاضنة CO2.
  4. استخدم الأسلاك الكهربائية لتوصيل جهاز EF متعدد الأجهزة بشريحة MOE عبر أقطاب Ag/AgCl الكهربائية على الشريحة. توصيل متعدد EF ومولد دالة إلى مكبر للصوت لإخراج نبضات DC الموجة المربعة مع حجم 300 mV/mm على تردد 100 هرتز في دورات واجب 50٪ (50٪ وقت على و 50٪ إجازة) (الشكل 6B).
    1. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بمضاعف EF. توصيل الأسلاك الكهربائية إلى رقاقة MOE عبر أقطاب Ag / AgCl.
    2. قم بتوصيل جهاز EF متعدد الأجهزة بالمكبر باستخدام الأسلاك الكهربائية. قم بتوصيل مولد الوظيفة بالمكبر للصوت والمنظار الذبذب الرقمي.
      ملاحظة: يعد جهاز EF multixer دائرة تتضمن مقاومة غرفة الثقافة في الدائرة وتربط جميع الغرف الفردية في شبكة إلكترونية متوازية. كل غرفة من غرف الثقافة الثلاث متصلة كهربائيا بمقاوم متغير (Vr) ومقياس (يظهر على شكل μA في الشكل 6A)في المضاعف. يختلف التيار الكهربائي من خلال كل غرفة ثقافة من خلال التحكم في الواقع الافتراضي ، ويظهر التيار على مقياس الأمتر المقابل. تم حساب قوة المجال الكهربائي في كل منطقة ثقافة الخلية من قبل قانون أوم، I = σEA، حيث أنا التيار الكهربائي، σ (تعيين 1.38 S·m-1 لDMEM/F1220)هو الموصلية الكهربائية للوسط الثقافة، E هو المجال الكهربائي، و A هي المنطقة المقطعية من الغرفة الكهربائية. بالنسبة لبعد منطقة ثقافة الخلية الموضح في الشكل 1، فإن التيار الكهربائي هو ~ 87 mA و ~ 44 mA لنبض DC و DC عند دورة عمل 50٪ على التوالي.
  5. إخضاع ال MNPCs لنبضات DC مربعة بحجم 300 mV/mm عند تردد 100 هرتز ل 48h. ضخ باستمرار المتوسطة كاملة بمعدل 10 ميكرولتر / ساعة لتوفير التغذية الكافية للخلايا والحفاظ على قيمة درجة الحموضة ثابت في المتوسط.

6. اختبارات immunofluorescence من الشخصيات غير المناهمة بعد التحفيز DC نبضي

ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم ضخ جميع الكاشفات عبر مدخل متوسط باستخدام مضخة حقنة.

  1. بعد 3, 7, أو 14 أيام في المختبر (DIV) زراعة بعد البذر1, غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
  2. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). ضخ 4٪ PFA في رقاقة بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة لتحل محل برنامج تلفزيوني 1x. لاستبدال PFA 4٪، اغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
  3. ضخ 0.1٪ تريتون X-100 في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق ل permeabilize الخلايا. خفض معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة لمدة 30 دقيقة إضافية للرد مع الخلايا. لاستبدال 0.1٪ تريتون X-100، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق.
  4. منع الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) للحد من ربط الأجسام المضادة غير محددة. ضخ 1٪ BSA في الشريحة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق. خفض معدل التدفق إلى 100 ميكرولتر / ساعة وضخ لمدة 1 ساعة.
  5. ضخ الأجسام المضادة لاحتواء المناعة المزدوجة في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق، واحتضان رقاقة لمدة 18 ساعة في 4 درجة مئوية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  6. ضخ الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور المترافقة في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق. خفض معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة، وضخ الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  7. للتلطيخ النووي، قم بضخ Hoechst 33342 في الشريحة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر/دقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  8. بعد الالتهاز المناعي، لاحظ الخلايا باستخدام مجهر مضان كونفوكال.

7. تحليل الصور ومعالجة البيانات

  1. تحليل الصور الفلورية باستخدام البرمجيات مع المدمج في أدوات القياس (انظر جدول المواد).
  2. قارن النواة الملطخة المضادة للهويشت (العدد الإجمالي للخلايا) في مجموعات التحكم والعلاج، واحسب النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن كل علامة فينوتيبيبيك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر التكوين التفصيلي لشريحة MOE في الشكل 1. توفر رقاقة microfluidic نهجا مفيدا لتقليل حجم الإعداد التجريبي وحجم العينة وحجم الكاشف. تم تصميم رقاقة MOE لإجراء ثلاث تجارب تحفيز EF مستقلة والعديد من حالات التثبيط المناعي في وقت واحد في دراسة واحدة(الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقاقة MOE ، التي تتمتع بشفافية بصرية عالية مناسبة لفحوصات المجهر confocal. تم تصميم رقاقة MOE أيضا للتحقيق في آثار ظروف ثقافة الخلايا المختلفة (على سبيل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تصنيع رقاقة MOE ، يتم إرفاق المحولات بالطبقة 1 من رقاقة MOE مع غراء سيانواكريلات سريع المفعول. يتم تطبيق الغراء على 4 زوايا من المحولات، ومن ثم يتم تطبيق الضغط بالتساوي على محولات. يجب تجنب كمية زائدة من الغراء لضمان البلمرة كاملة من الغراء. وعلاوة على ذلك، يتم احتضان تجميع رقاقة MOE المكتملة في غرفة فراغ. تساعد هذه الخطوة على إزالة الفقاعات بين طبقة PMMA والشريط على الوجهين وزجاج الغطاء.

ويستند اختيار مادة القطب على حقيقة أن أيونات الكلوريد ، الموجودة بوفرة في الوسط ، هي المنتجات المنحل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون البروفيسور تانغ ك. تانغ، معهد العلوم الطبية الحيوية، أكاديميا سينيكا، على مساعدته في توفير الخلايا الجذعية العصبية للفأر والخلايا السلف (mNPCs). كما يشكر المؤلفان البروفيسور تانغ ك. تانغ والسيدة ينغ شان لي على مناقشتيهما القيمة بشأن التمييز بين الشخصيات غير الوطنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ركائز PMMA 1 مم (طبقات 1-3)BHTK2R20بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) ، أنبوب بلاستيكي http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 ملProtech Technology Enterprise Co.، LtdCT-15-PL-TWأنبوب مخروطي القاع مع غطاء ، مجمعة ، معقمة
مسبقا 3 مل حقنةTERUMODVR-34133 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة
3 مم من الدرجة البصرية PMMA (الطبقة 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA ورقةبصرية الصف PMMA
3-way stopcockNIPRONCN-3Lمعقمة يمكن التخلص منها 3 اتجاهات محبس
5 مل حقنةTERUMODVR-34105 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة
محولDong Zhong Co.، Ltd.محول PMMAمخصص
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose ، مكبر للصوت في درجة حرارة التبلور المنخفضة
AA Lab Systems LtdA-304مضخم الجهد
العالي برنامج AutoCADAutodeskالنسخة التعليميةصياغة
الملحق B-27 مكملGibco12587-010B-27 (50x) ، ناقص فيتامين أ
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF)   ؛PeprotechAF-100-18Bيسمى أيضا المؤتلف البشري FGF-bas
المطاط الأسود سداد المطاطTERUMODVR-3413من 3 مل محاقن عن طريق الفم ، بدون إبرة
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichB4287كاشف حجب   ؛
جهاز الطرد المركزيHSIANGTAICV2060جهاز الطرد المركزي
CO2< / sub> ليزر كاتبأدوات الليزر والتقنيات Corp. ILS-IIتم شراؤها من موصل
مخروطيIDEX Health & ScienceF-120Xقطعة واحدة محكمة الإصبع 10-32 مخروط ، لمحول مخروطي طبيعي 1/16 بوصة OD
IDEX Health & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 أنثى إلى أنثى Luer ، نظرة خاطفة
مجهر مضان متحد البؤرLeica MicrosystemsTCS SP5Leica TCS SP5 دليل مستخدم ، كاميرا رقمية
http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf OLYMPUSE-330الحصول التلقائي على الصور بفاصل زمني
راسم الذبذبات الرقميTektronixTDS2024قياس إشارات الجهد أو التيار بمرور الوقت في دائرة إلكترونية أو مكون لعرض السعة والتردد.
شريط على الوجهين3M PET 8018تم شراؤها من http://en.thd.com.tw/
Dulbecco' s النسر المعدل s متوسط / خليط المغذيات هام F-12 (DMEM / F12)Gibco12400024DMEM / F-12 ، مسحوق ، HEPES
Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)Gibco21600010DPBS ، مسحوق ، بدون كالسيوم ، لا مغنيسيوم
مضاعف EFAsiatic Sky Co.، Ltd.مراقبة مخصصةوالتحكم في التيار الكهربائي في القنوات الفردية
عامل نمو البشرة (EGF)PeprotechAF-100-15وتسمى أيضا EGF البشري
المؤتلف غراء سيانوا أكريليت سريع المفعول3M & nbsp ؛7004Tلاصق فوري قوي (سائل)
موصل القاع المسطحIDEX Health & ScienceP-206الجوز الذكور بدون شفة Delrin ، 1 / 4-28 قاع مسطح ، ل 1/16 "OD الأزرق
مولد وظيفةAgilent Technologies33120Aعالي الأداء 15 ميجاهرتز مركبة   ؛ مولد الوظيفة  مع قدرة مدمجة على شكل موجة تعسفية
الماعز المضادة للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117الماعز المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 488) الماعز الممتزة
مسبقا المضادة للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086الماعز الجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة للأرانب IgG - H& L (Alexa Fluor 555) ، الممتزة
مسبقا Hoechst 33342InvitrogenH3570Nuclear Staining
ImageJ softwareالمعاهد الوطنية للصحة1.48 فولتتحليل صور الفلورسنت   ؛
الإنديوم– القصدير – أكسيد (ITO) زجاجMerck300739لسخان ITO
مجهر تباين الطور المقلوبOLYMPUSCKX41لمراقبة مورفولوجيا الخلية
مزدوجة حرارية من النوع KTecpelTPK-02Aدرجة الحرارة   ؛ المزدوجات الحرارية
محول لورIDEX Health & ScienceP618-01محول لور أنثى لوير إلى 1 / 4-28 ذكر بولي بروبيلين
لوير قفل حقنةTERUMODVR-3413لجسور ملح أجار
الماوس المضاد ل GFAPeBioscience14-9892علامات الخلايا النجمية
Oligodendrocyte   ؛ علامة  O4  الأجسام المضادةR & D SystemsMAB1326Oligodendrocyltes علامة
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148Fixing  عامل
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)الحياة الأساسيةBL2651محلول الغسيل
Poly-L-Lysine (PLL)محلول طلاء SIGMAP4707
غطاء دقيق سماكة نظارات رقم 1.5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
للبرمجة XYZ المرحلة الآليةTanlian تم شراء شركةInc حسب الطلبمن http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional– متكامل &ndash ؛ وحدة تحكم مشتقة (PID)Toho ElectronicsTTM-J4-R-ABوحدة تحكم في درجة الحرارة   ؛
أنبوب PTFEالمهنية البلاستيك Inc. فرع تايوانالقطر الخارجي 1/16 بوصةPTFE بيضاء شفافة
الأرنب المضادة ل Tuj1Abcamab18207مضخة حقنة علامة الخلايا العصبية
New Era Systems IncNE-1000NE-1000 مضخة حقنة واحدة قابلة للبرمجة
TFD4 منظفFRANKLABTFD4منظف زجاج
بوندر حراريشركة Kuan-MIN Techتم شراؤها حسب الطلبمن http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787محلول نفاذية
منظف بالموجات فوق الصوتيةLEOLEO-300Sمنظف بالموجات فوق الصوتية غرفة
فراغDENG YNG INSTRUMENTS CO.، LTD.DOV-30فرن تجفيف بالفراغ
قابس أبيض محكمالإصبع IDEX Health & العلومP-3161 / 4-28 مسطح القاع ، https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html
http://www.lttcorp.com/index.htm قابلة أنابيب غطاء

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

XYZ

مقالات ذات صلة