نقدم بروتوكول لتطوير واستخدام نموذج الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية مع H2O2، وتحليل مورفولوجيا الخلايا ، وقابلية البقاء ، والكثافة ، الجلوتاثيون ، ومستوى UCP-2. وهو نموذج مفيد للتحقيق في التأثير المضاد للأكسدة من البروتينات التي تفرزها الخلايا المتحولة جنسيا لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في الجمال النائم Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يلعب الإجهاد التأكسدي دورا حاسما في العديد من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض يصيب حوالي 30 مليون مريض في جميع أنحاء العالم. وهو يؤدي إلى انخفاض في ظهارة صبغ الشبكية (RPE) توليفها العوامل العصبية، على سبيل المثال، عامل مشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) وعامل تحفيز مستعمرة الحبيبية الضامة (GM-CSF)، تليها فقدان خلايا RPE، وفي نهاية المطاف مستقبلات ضوئية وخلية العقدة الشبكية (RGC) الموت. نحن نفترض أن إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية من خلال زرع تحت الشبكية لخلايا RPE المصابة التي تفرط في التعبير عن PEDF و GM-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية من خلال التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي ، وتثبيط الالتهاب ، ودعم بقاء الخلية. باستخدام نظام الإرسال والاستقبال الجمال النائم (SB100X)وقد تم تحويل خلايا RPE الإنسان مع الجينات PEDF وجنرال موتورز-CSF وأظهرت التكامل الجيني مستقرة، والتعبير الجيني على المدى الطويل، وإفراز البروتين باستخدام qPCR، وصمة عار الغربية، ELISA، و immunofluorescence. لتأكيد وظائف وفعالية PEDF و GM-CSF التي تفرزها خلايا RPE المصابة ، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لتحديد الحد من الإجهاد التأكسدي H2O2- الناجم عن خلايا RPE في الثقافة. تم تقييم حماية الخلايا من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا والكثافة ومستوى الجلوتاثيون داخل الخلايا والتعبير الجيني UCP2 وقابلية بقاء الخلية. وأظهر كل من خلايا RPE المصابة التي تزيد من التعبير عن PEDF و / أو GM-CSF والخلايا غير المصابة ولكن المعالجة مع PEDF و / أو GM-CSF (المتاحة تجاريا أو النقية من الخلايا المصابة) حماية كبيرة للخلايا المضادة للأكسدة مقارنة بالضوابط غير المعالجة. النموذج الحالي H2O2هو نهج بسيط وفعال لتقييم التأثير المضاد للأكسدة للعوامل التي قد تكون فعالة لعلاج AMD أو الأمراض العصبية المماثلة.
المقدمة
النموذج الموصوف هنا، يقدم نهجا مفيدا لتقييم كفاءة العوامل الصيدلانية الحيوية للحد من الإجهاد التأكسدي في الخلايا. لقد استخدمنا النموذج للتحقيق في الآثار الوقائية ل PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي H2O2- بوساطة على الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية ، والتي تتعرض لمستويات عالية من O2، والضوء المرئي ، وداء البلعومية لأغشية الجزء الخارجي مستقبلات ضوئية ، مما يولد مستويات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)1، 2. وهي تعتبر مساهما رئيسيا في الإمراض من الضمور البقعي المرتبط بالعمر الوعائي (aAMD)3،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت اللجنة الأخلاقية للبحوث الكانتونية (رقم 2016-01726) على إجراءات جمع العين البشرية واستخدامها.
1. عزل الخلية وظروف الثقافة
- خط الخلية ARPE-19 البشري
- الثقافة 5 × 105 خلايا ARPE-19، خط الخلية RPE الإنسان، في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة / المغذيات خليط F-12 لحم الخنزير (DMEM / هام F-12) تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 80 U/mL البنسلين، 80 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و2.5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين B (متوسط كامل) عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ CO2 و95٪ هواء في قارورة T75 (لكثافة الخلايا الأخرى انظر الجدول 1).
- تغيير المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع.
- مرة واحدة تزرع ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحريض الإجهاد التأكسدي في الخلايا الظهارية صبغ الشبكية البشرية
تم التعامل مع ARPE-19 وخلايا hRPE الأولية بتركيزات متفاوتة من H2O2 لمدة 24 ساعة وتم قياس مستوى الجلوتاثيون المضاد للأكسدة داخل الخلايا كميا(الشكل 2A،B). H2O2 في 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر لم يؤثر على إنتاج الجلوتاثيون، في حين كان هناك انخفاض كبير في الجلوتاثيون في ARPE-19 والخلايا HRPE الأولية عند 350 ميكرومتر. أظهر ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا لتحليل وظيفة مكافحة الأكسدة والحماية ل PEDF و GM-CSF التي تنتجها الخلايا المصابة ، والتي يمكن تطبيقها على الخلايا المصابة بأي جين مفيد مفترض. في الاستراتيجيات العلاجية الجينية التي تهدف إلى إيصال البروتينات إلى الأنسجة عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، من الأهمية بمكان الحصول على معلومات حول مستوى التعبير عن البروتين، وطول عمر التعبير، وفعالية البروتين المعبر عنه في نموذج للمرض. في مختبرنا، كان البروتوكول المعروض هنا مفيدا لتحديد فعالية PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي، والذي تم افترا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يشكرا غريغ سيلي وألان كونتي على المساعدة التقنية الممتازة والبروفيسور زوزسانا إزفاك من مركز ماكس دلبروك في برلين على التكرم بتوفير PSB100X و pT2-CAGGS-فينوس بلاميدز. وقد دعم هذا العمل كل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم والمفوضية الأوروبية في سياق البرنامج الإطاري السابع. تم تمويل Z.I من قبل مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742].
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألواح 24 بئر | Corning | 353047 | |
| 6 ألواح آبار | Greiner | 7657160 | |
| 96 بئر لوحة ثقافة بيضاء مع قاع مسطح واضح ؛ | Costar | 3610 | يسمح بفحص الخلايا قبل قياس اللمعان (فحص GSH-Glo) |
| لوحات 96 بئر | Corning | 353072 | |
| أكريلاميد 40٪ | Biorad | 161-0144 | |
| أمفوتريسين ب | AMIMED | 4-05F00-H | |
| أجسام مضادة مضادة ل GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| أجسام مضادة مضادة للفأر IgG / IgA / IgM ؛ | Agilent | P0260 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل PEDF ؛ | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية Inc | sc-390172 | |
| الأجسام المضادة للخماسية-His | Qiagen | 34660 | |
| الأجسام المضادة للفوسفو Akt | تقنية إشارات الخلية | 9271 | |
| الأجسام المضادة للأرانب IgG H& L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| الأجسام المضادة الحمار المضادة للأرانب Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| الأجسام المضادة للماعز المضادة للفأر Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 خط الخلية | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA ؛ | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| ثقافة الزجاج الشرائح Corning | 354118 | ||
| CytoTox-Glo Cellular Toxicity Assay | بروميجا | G9291 | |
| دابي | سيجما ألدريتش | D9542-5MG | |
| DMEM / هام F12 | مجموعة Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Duo مجموعة ELISA | R& D Systems | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Fluoromount تصاعد مائي متوسط | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| قارئ لوحة أوميغا FLUOstar | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism (الإصدار 8.0) | GraphPad Software، Inc. | ||
| GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
| بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) برنامج | Merck | 107209 | |
| ImageJ (برنامج معالجة الصور) | WS Rasband ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ https://imagej.nih.gov/ij/ ؛ 1997 & ndash ؛ 2014 | ||
| إيميدازول | مجهر Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B | لايكا مايكروسيستمز | ||
| لايت سايكل 480 الأداة II | الجزيئية | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 برنامج | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| نظام تعداء النيون | MPK5000 | ThermoFisher Scientific | |
| 10 & micro ؛ L كيت | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| غرفة Neubauer | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
| نيتروسليلوز | VWR | 732-3197 | |
| نظام تصوير جل أوميغا لوم جي | Aplegen علوم | ||
| الحياة PBS 1X | سيجما-ألدريتش | D8537 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | سيجما ألدريتش | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| بيرس BCA بروتين الفحص كيت | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Primers | Invitrogen | انظر الجدول 1 في المواد التكميلية | |
| pSB100X (250 نانوغرام /&ميكرو; ل) | م & aacute ؛ ر & إيكوت; s et al., 2009. مقدمة من البروفيسور Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µ L) | تم إنشاؤه باستخدام البلازميد الحالي pT2-CMV-PEDF-EGFP المبلغ عنه في Johnen، S. et al. (2012) IOVS، 53 (8)، 4787-4796. | ||
| pT2-CMV-PEDF-الحمض النووي البلازميدي الخاص به (250 نانوغرام/&ميكرو; L) | تم إنشاؤه باستخدام البلازميد الحالي pT2-CMV-PEDF-EGFP المبلغ عنه في Johnen، S. et al. (2012) IOVS، 53 (8)، 4787-4796. | ||
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
| المؤتلف hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| المؤتلف hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA Cell Miniprep | System Promega | Z6011 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase Free Set | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| نقل شبه جاف نظام ل WB | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| محلول ملحي مخزنة ثلاثي (TBS) | ThermoFisher | Scientific 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Trypsin / EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP الركيزة | Advansta | K-12045-D50 | |
| غشاء واتمان النيتروسليلوز | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
المراجع
- Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
- Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
