والهدف من هذا البروتوكول هو توفير دليل مفصل خطوة بخطوة لتجميع البنى متعددة الجينات باستخدام نظام الاستنساخ المعياري القائم على استنساخ البوابة الذهبية. كما يقدم توصيات بشأن الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الأمثل استنادا إلى خبراتنا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمكن طريقة استنساخ البوابة الذهبية من التجميع السريع لجينات متعددة في أي ترتيب يحدده المستخدم. ويستخدم نوع IIS تقييد الإنزيمات التي تقطع خارج مواقع الاعتراف بها وخلق تراكم قصيرة. يستخدم نظام الاستنساخ المعياري هذا (MoClo) سير عمل هرمي يتم فيه استنساخ أجزاء الحمض النووي المختلفة ، مثل المروجين وتسلسلات الترميز (CDS) والمنهيين ، لأول مرة في متجه إدخال. ناقلات دخول متعددة ثم تجميع في وحدات النسخ. ثم تتصل عدة وحدات نسخ ببللازميد متعدد الجينات. استراتيجية الاستنساخ البوابة الذهبية هي ميزة هائلة لأنها تسمح ندبة أقل، والاتجاه، والتجمع وحدات في رد فعل وعاء واحد. ويمكن سير العمل الهرمي عادة من الاستنساخ السهل لمجموعة كبيرة ومتنوعة من البنى المتعددة الجينات دون الحاجة إلى التسلسل خارج ناقلات الدخول. يتيح استخدام التسرب من البروتين الفلوري الفحص البصري السهل. يوفر هذا العمل بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة الاستنساخ المعياري للخمائر (MoClo). نعرض النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل لتجميع البلازميد متعدد الجينات ونقدم دليلا لفحص المستعمرات. وتنطبق استراتيجية الاستنساخ هذه إلى حد كبير على هندسة التمثيل الغذائي للخمائر وغيرها من الحالات التي يلزم فيها استنساخ البلازميد المتعدد الجينات.
المقدمة
تهدف البيولوجيا التركيبية إلى هندسة النظم البيولوجية مع وظائف جديدة مفيدة للصناعات الصيدلانية والزراعية والكيميائية. تجميع أعداد كبيرة من شظايا الحمض النووي بطريقة عالية الإنتاجية هو تقنية أساسية في البيولوجيا الاصطناعية. مثل هذه العملية المعقدة يمكن أن تنهار إلى مستويات متعددة مع انخفاض التعقيد ، وهو مفهوم مستعار من العلوم الهندسية الأساسية1،2. في البيولوجيا التركيبية، عادة ما تتجمع شظايا الحمض النووي بشكل هرمي استنادا إلى الوظيفة: '1' مستوى الجزء: تشير "الأجزاء" إلى شظايا الحمض النووي ذات وظيفة محددة، مثل المروج، وتسلسل الترميز، والمنهي، وأصل النسخ المتماثل؛ و'2' العوامل التي يمكن أن تكون ذات طبيعة مختلفة. '....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يمكن تقسيم بروتوكول الاستنساخ الهرمي المعروض في مجموعة الأدوات هذه إلى ثلاث خطوات رئيسية: 1. استنساخ جزء البلازميدات؛ 2. 2. استنساخ وحدات النسخ (TUs)؛ 3. استنساخ البلازميدات متعددة الجينات (الشكل 1). يبدأ هذا البروتوكول من تصميم التمهيدي وينتهي بتطبيقات البلازميد المستنسخ متعدد الجينات.
1. تصميم التمهيدي لاستنساخ الجزء plasmid (pYTK001):
- تصميم التمهيديات الأمامية والعكسية التي تحتوي على النيوكليوتيدات المحيطة TTT في نهاية 5 ،وهو موقع التعرف على BsmBI مع النيوكليوتيدات الإضافية (CGTCTCN) ، وهو تراكم 4-nucleotides (NT) تكملة لنواقل الإدخال ، موقع التعرف على BsaI مع النيوكليوتيدات إضافية (GGTCTCN....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا نتائج أربعة plasmids متعددة الجينات المستنسخة لإنتاج β كاروتين (الأصفر) والليكوبين (الأحمر). تم بناء بلازميد متعدد الجينات التكاملي لتعطيل موقع ADE2 ، والمستعمرات منها حمراء.
استنساخ CDSs في متجه الإدخال (pYTK001)
تم تضخيم ERG20 من جينوم الخميرة والجينات الكاروتينويد الثلاثة crtE، crtYB، crtI من pLM49448 في ناقل الدخول pYTK001 كما هو موض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر مجموعة الاستنساخ القائمة على MoClo التي طورها Lee et al. موردا ممتازا للتجميع السريع لوحدات النسخ من واحد إلى خمسة في بلازميد متعدد الجينات إما للتكرار أو الاندماج في جينوم الخميرة. استخدام هذه المجموعة يلغي اختناق الاستنساخ المستهلكة للوقت التي توجد في كثير من الأحيان للتعبير عن جينات متعددة في الخميرة.
اختبرنا خمسة شروط مختلفة لدورات الهضم / الربط لاستنساخ البوابة الذهبية مع ربط الحمض النووي T4. وجدنا أن 30 دورة من الهضم في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وربط في 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث لجامعة ولاية نيويورك (الجائزة رقم: 71272) وجائزة IMPACT للجامعة في بافالو (الجائزة رقم: 000077).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5 مم خرز زجاجي | منتجات أبحاث RPI | 9831 | لخلايا الخميرة |
| Bacto Agar | BD & الشركة | 214010 | مكون من الخميرة الوسط الاصطناعي الكامل (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& الشركة | 211677 | مكون من مستخلص الخميرة الببتون سكر العنب وسط (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | نسخة عالية الكفاءة من إنزيم تقييد BsaI |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | مضاد حيوي للفحص على مستوى وحدة النسخ |
| الكواشف الحيوية | Chloramphenicol | 56-75-7 | مضاد حيوي للفحص في مستوى ناقلات الدخول |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | مكمل الأحماض الأمينية للخميرة الوسط الاصطناعي الكامل (CSM) |
| سكر العنب | فيشر الكيميائية | D16-500 | مصدر الكربون للخميرة الوسط الاصطناعي الكامل (CSM) |
| نيتروجين الخميرة Difco بدون الأحماض الأمينية | BD & الشركة | 291940 | مصدر النيتروجين للخميرة الوسط الاصطناعي الكامل (CSM) |
| dNTP مزيج | Promega | U1515 | dNTPs ل PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | متساوي انفصام عالي الكفاءة من BsmBI |
| المجمد EZ الخميرة Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | لتحويل الخميرة |
| الهكسان | فيشر الكيميائية | H302-1 | لاستخراج الكاروتينويد من خلايا الخميرة |
| كاناميسين | فيشر الكواشف الحيوية | 25389-94-0 | مضاد حيوي للفحص على مستوى البلازميد متعدد الجينات |
| LB Agar ، ميلر | فيشر Bioreagents | BP1425-2 | وسيط أجار ليزوجينيك ل E. القولوني< م > زراعة |
| مرق LB ، | كواشف ميلر فيشر الحيوية | BP1426-2 | وسط سائل ليزوجينيك ل E. قولونية< / em> زراعة |
| الليكوبين | كايمان للكيماويات | NC1142173 | لقياس الليكوبين |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | مختبر الإيداع: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | لتنقية البلازميد من E.coli< / em> |
| مقياس الطيف الضوئي النانوي | الحراري العلمي | ND2000c | لقياس تركيزات الحمض النووي الدقيقة |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | إنزيم التقييد لخطية البلازميد التكاملي متعدد الجينات |
| كبريتات نورسيوثريسين | Goldbio | N-500-100 | اختيار المضادات الحيوية لبلازميد pCAS المستخدم في هذه الدراسة |
| Phusion HF تفاعل عازلة (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer ل PCR باستخدام Phusion polymerase |
| Phusion عالية الدقة DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | بوليميراز عالي الدقة لجميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل |
| pLM494 | Addgene | 100539 | البلازميد المستخدم لتضخيم crtI و crtYB و crtE المستخدم في هذه الدراسة |
| الكوارتز كوفيت | الحرارية 10050801 الإلكترون | لقياس الكاروتينات | |
| T4 ligase | نيو إنجلاند Biolabs | M0202S | Ligase للذهبي بوابة استنساخ |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | لإجراء جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل والاستنساخ |
| خلاط رصاصة خالط الأنسجة | الموديل: BBX24 | لتجانس خلايا الخميرة | |
| مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis | Thermo Scientific | Genesys 150 | لقياس الكاروتينات |
| مستخلص الخميرة | فيشر الكواشف الحيوية | BP1422-500 | مكون من مستخلص الخميرة الببتون سكر العنب الوسط (YPD) |
| وبيتا كاروتين | ألفا إيسار | AAH6010603 | لقياس بيتا كاروتين |
المراجع
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
