البذر الخلايا Stepwise على السقالات تيسلاتيد لدراسة الأوعية الدموية تنبت

ملخص

تعتمد الأنسجة المهندسة بشكل كبير على شبكات الأوعية الدموية المناسبة لتوفير العناصر الغذائية والغازات الحيوية وإزالة النفايات الأيضية. في هذا العمل، يخلق بروتوكول البذر التدريجي للخلايا البطانية وخلايا الدعم شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم في منصة عالية الإنتاجية لدراسة تطوير سلوك الأوعية في بيئة ثلاثية الأبعاد خاضعة للرقابة.

الملخص

نظام القلب والأوعية الدموية هو لاعب رئيسي في فسيولوجيا الإنسان، وتوفير الغذاء لمعظم الأنسجة في الجسم. الأوعية موجودة في أحجام مختلفة، والهياكل، والأنماط الظاهرية، والأداء اعتمادا على كل نسيج معين perfused. يعتمد مجال هندسة الأنسجة، الذي يهدف إلى إصلاح أو استبدال أنسجة الجسم التالفة أو المفقودة، على تكوين الأوعية الدموية الخاضع للرقابة لخلق الأوعية الدموية المناسبة داخل الأنسجة المهندسة. بدون نظام الأوعية الدموية ، لا يمكن تغذية البنى الهندسية السميكة بما فيه الكفاية ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا ، وسوء الحرمان ، والفشل في نهاية المطاف. وبالتالي ، فإن فهم ومراقبة سلوك الأوعية الدموية المهندسة هو تحد بارز في هذا المجال. يقدم هذا العمل نظام إنتاجية عالية يسمح بإنشاء شبكات سفن منظمة وقابلة للتكرار لدراسة سلوك السفن في بيئة سقالة ثلاثية الأبعاد. يظهر بروتوكول البذر هذا ذو الخطوتين أن الأوعية داخل النظام تتفاعل مع تضاريس السقالة ، وتقدم سلوكيات مميزة تنبت اعتمادا على هندسة المقصورة التي تتواجد فيها السفن. يمكن تطبيق النتائج التي تم الحصول عليها وفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي من أجل إبلاغ تصاميم بناء سقالة ثلاثية الأبعاد ذات طباعة بيولوجية أفضل ، حيث لا يمكن تقييم تصنيع مختلف الأشكال الهندسية ثلاثية الأبعاد بسرعة عند استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد كأساس للبيئات البيولوجية الخلوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الفهم من هذا النظام الإنتاجي العالي لتحسين الفحص السريع للأدوية، والتطور السريع لنماذج الثقافات المشتركة، والتحقيق في المحفزات الميكانيكية على تكوين الأوعية الدموية لتعميق المعرفة بنظام الأوعية الدموية.

المقدمة

مجال هندسة الأنسجة يتقدم بسرعة نحو تصنيع البنى الهندسية لتحل محل الأعضاء والأنسجة المفقودة أو التالفة¹. ومع ذلك، لم يتم بعد تحقيق البنى الوظيفية بالكامل، جزئيا، لأن إنشاء شبكات الأوعية الدموية التشغيلية لتغذية الأنسجة لا يزال تحديا بارزا. دون الأوعية الدموية المناسبة، تقتصر الأنسجة المهندسة على نقل الانتشار السلبي للأوكسجين والمواد المغذية، وتقييد سمك الأنسجة قابلة للحياة القصوى إلى حد الانتشار، ما يقرب من 200 ميكرومتر². هذه السماكة ليست مناسبة لإصلاح عيوب الأنسجة الكبيرة أو لتصنيع الأعضاء الكاملة ، مما يجعل وجود شبكة الأوعية الدموية الوظيفية سمة إلزامية للأنسجة الوظيفية والغرسة³.

يتكون نظام الأوعية الدموية من مجموعة واسعة من الأوعية الدموية ، مع أحجام مختلفة ، والأنماط الظاهرية ، والتنظيم ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأنسجة المضيفة. فهم السلوك والاستجابة وقرارات الهجرة التي تتخذها السفن النامية وتنبت يمكن أن يرشد اندماجها في الأنسجة المهندسة⁴. حاليا، النهج الأكثر شيوعا لإنشاء شبكات الأوعية الدموية في المختبر هو الجمع بين الخلايا البطانية (ECs) مع خلايا الدعم (SCs، مع القدرة على التفريق إلى خلايا جدارية)، بذر داخل بيئة صغيرة ثلاثية الأبعاد. توفر هذه البيئة إشارات كيميائية ومادية للسماح للخلايا بإرفاق الخلايا وتكاثرهاوتجميعها ذاتيا في شبكات السفن^{2و5و6و7و8.} عندما تشارك في زراعة، SCs تفرز البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) مع توفير الدعم الميكانيكي لECs، والتي تشكل الهياكل الأنبوبية. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل المتبادل بين كلا النوعين من الخلايا يعزز تكوين الأنابيب، وتنبت الأوعية والهجرة، بالإضافة إلى نضوج SCs والتمايز إلى خلايا جدارية α الملساء للعضلات (αSMA)⁴. تتم دراسة تطوير شبكة السفن الأكثر شيوعا في بيئات ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها باستخدام الهيدروجيلات أو السقالات البوليمرية المسامية أو مزيج منها. يوفر الخيار الأخير بيئة صديقة للخلايا والدعم الميكانيكي المطلوب لكل من الخلايا و ECM^9.

وقد تم تنفيذ قدر كبير من العمل لدراسة تطور الأوعية الدموية، بما في ذلك المشاركة في زراعة الخلايا على^{الهيدروجيلس 10،}hydrogels-سقالة تركيبات^11،12،منصات 2D، والأجهزة microfluidic¹³. ومع ذلك، يمكن أن تشوه الهيدروجيل بسهولة من قبل القوات التي تمارسها الخلية^14،في حين أن أنظمة 2D وmicrofluidics تفشل في إعادة بيئة أقرب إلى الطبيعة للحصول على استجابة أكثر استقراء^15،16. ويمكن أن يوفر فهم كيفية تفاعل السفن المشكله مع بيئتها المحيطة رؤية حاسمة قد تسمح بتلفيق بيئات هندسية مع القدرة على توجيه تطور السفينة بطريقة يمكن التنبؤ بها. فهم ظواهر تكوين الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لمواكبة الظهور السريع لتقنيات التصنيع من تحت الميكرون إلى ميكرون ، مثل التصوير الحجري المجسم ، والطباعة الحجرية الرقمية الإسقاط ، وإنتاج واجهة السائل المستمر ، والكتابة النفاثة ثلاثية الأبعاد ، والحل القائم على الكتابة النفاثة الكهربائية ثلاثية الأبعاد ، وتقنيات الطباعة الحيوية الناشئة^17و18و19و^20و21. إن مواءمة التحكم في تقنيات التصنيع الدقيق هذه مع فهم عميق لبيولوجيا الأوعية الدموية هو المفتاح لإنشاء الأوعية الدموية المهندسة المناسبة للأنسجة المستهدفة.

هنا، نقدم نظام 3D لدراسة استجابة السفن تشكيل وتنتشر جديدة لهندسة السقالة المحيطة بها، ومراقبة أصلها تنبت والهجرة اللاحقة²². من خلال استخدام السقالات ثلاثية الأبعاد مع هندسة المقصورة تيسلاتيد ، وتقنية البذر من خطوتين ، نجحنا في إنشاء شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم بطريقة واضحة وسهلة التحليل. توفر الهندسة تيسلاتيد نظام الإنتاجية العالية مع وحدات فردية تحتوي على السفن التي تستجيب لبيئتهم المحلية. باستخدام ECs متعددة الألوان ، تتبعنا أصول تكوين البراعم وأنماط الهجرة اللاحقة ، المرتبطة بهندسة المقصورة وموقع SCs²².

على الرغم من أن البروتوكول المقترح قد تم إعداده لتحليل آثار الإشارات الهندسية على سلوك الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن توسيع هذا النهج وتطبيقه على مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة. تسمح السقالة تيسلاتيد والشبكات القابلة للصور بسهولة بإجراء تحليل مباشر لمختلف تفاعل ECs و SCs ، وإضافة خلايا عضوية محددة وتفاعلها مع شبكات الأوعية الدموية ، وتأثير الدواء على شبكات الأوعية الدموية ، وأكثر من ذلك. لدينا نتائج النظام المقترح تنوعا للغاية وتصنيع بسيطة وتجهيز.

البروتوكول

1. تيسلاتيد تصنيع السقالة

ملاحظة: التصوير الضوئي تقنية واسعة الانتشار تتطلب معدات متخصصة تقع عادة داخل منشأة/مختبر لتصنيع النانو. وقد تم تعميم الطريقة المنصوص عليها في هذا البروتوكول قدر الإمكان للجمهور؛ ومع ذلك، قد تكون هناك ضرورة لتغييرات طفيفة في الإجراءات اعتمادا على المعدات المتاحة للقارئ. نوصي بإجراء هذه الإجراءات في غرفة نظيفة في منشأة تصنيع النانو لضمان أعلى جودة عملية. قبل البدء، احصل على إمكانية الوصول إلى جهاز محاذاة القناع (أو بعض أجهزة إعداد التعرض للأشعة فوق البنفسجية)، ومعطف الدوران، والصحون الساخنة، ومحطة غسيل المذيبات، وقناع ضوئي، ومنظف البلازما. المذيبات والمواد الكيميائية المستخدمة في الإجراء هي خطرة، لذا يرجى اتخاذ أقصى درجات الحذر لتجنب أي التعرض للمواد الكيميائية. عند تصميم قناع ضوئي، حدد ما هي رقائق السيليكون الحجم والأقنعة الضوئية متوافقة مع المغلف الدوران وقناع المحاذاة. بالإضافة إلى ذلك، فإن المصامد الضوئي الموجود نحو حواف رقاقة السيليكون عادة ما يكون مشوها من المناولة. وبالتالي، جعل التصاميم نحو منطقة وسط رقاقة.

1. إعداد السقالات باستخدام تقنية التصوير الضوئي مع الهندسة المختارة من الفائدة.
   1. قبل طلاء تدور، وتنظيف رقاقة السيليكون. ويمكن القيام بذلك مع تنظيف البلازما أو تقنية القائمة على المذيبات. إذا تنظيف البلازما، اتبع الإجراء التشغيلي القياسي للجهاز للحصول على تفاصيل التشغيل. رش مع غاز النيتروجين المضغوط وفحص رقاقة للتأكد من أنها خالية من الحطام قبل تدور الطلاء. هذه الرقاقة ستكون بمثابة الركيزة التي يتم إنشاء السقالات عليها.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ابدأ مع رقاقة جديدة. يمكن إعادة استخدام رقائق ولكن ينبغي أن تكون خالية من الاحتراس الضوئي القديم، والعيوب السطحية والحطام. من المفيد استخدام الملقط الرقائقي للتعامل معها.
   2. مركز رقاقة السيليكون على تشاك تدور coater باستخدام دليل. تدور لفترة وجيزة رقاقة لضمان أنه قد تركزت بشكل صحيح على تشاك، وضبط حسب الضرورة حتى تركزت بشكل صحيح. يجب أن يتم ذلك في كل مرة يتم فيها وضع رقاقة على المغلف الدوراني. الاستغناء عن 1-4 مل من كاشف الإقلاع على رقاقة (وهذا سوف يعتمد على حجم رقاقة). ما يقرب من 2 مل من كاشف الإقلاع يعمل بشكل جيد لرقائق 4 بوصة.
      1. تعيين سرعة انتشار تدور coater في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان، وتدور السرعة إلى 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية، ثم تدور كاشف الإقلاع. تفقد رقاقة للتأكد من أنه يحتوي على طلاء حتى عبر رقاقة. أي حطام يترك على الرقاقة سيكون واضحا جدا في هذه المرحلة أي سقالات في منطقة مع الحطام من المرجح أن تكون غير صالحة للاستعمال. بعد طلاء تدور، ونقل إلى لوحة ساخنة وخبز لمدة 1 دقيقة في 200 درجة مئوية.
   3. كرر الخطوة السابقة مرتين أخريين لما مجموعه ثلاثة طلاءات.
   4. تدور معطف كاشف رفع قبالة رقاقة السيليكون المغلفة مع SU-8 2050 الضوئية حتى الحصول على سمك ما يقرب من 100 ميكرومتر.
      1. الاستغناء عن 1 مل من مقاومة لكل 25 ملم من قطر الركيزة.
         ملاحظة: كن حذرا لتجنب الفقاعات أثناء صب المقاومة. ل SU-8 2050، صب ما يقرب من دائرة قطرها 2 بوصة، عند استخدام رقاقة السيليكون 4 بوصة يعمل بشكل جيد.
      2. تدور معطف SU-8 2050. انتشار بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان، تليها سرعة دوران بين 1700 إلى 1800 دورة في الدقيقة لتحقيق سمك 100 ميكرومتر تقريبا.
      3. اختياري:بعد الغزل، وترك رقائق المغلفة تدور إلى إزالة الغاز بين عشية وضحاها على سطح مستوى محمية من الضوء قبل قبل خبز. وهذا قد يساعد على تخليص مقاومة أي فقاعات والسماح للعيوب إلى مستوى.
         ملاحظة: يمكن أن تختلف السماكة الفعلية للمقاومة والسقالات الناتجة مع خطأ المستخدم ومعلمات المعدات. لذلك ، يجب التحقق من سمك السقالات لاحقا ، في الخطوة 1.6. تعديل إجراءات الطلاء تدور وفقا لذلك لتحقيق سمك المطلوب.
   5. قبل التعرض، قبل خبز رقائق في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم 95 درجة مئوية لمدة 40-50 دقيقة. قبل التعرض، اختبر سطح المقاومة بالضغط على الحافة باستخدام زوج من الملاقط لضمان أنها لم تعد مبتذلة / لزجة. من المفيد سحب الرقاقة من الطبق الساخن والسماح له بالتبريد لمدة 0.5-1 دقيقة قبل تقييم التافهة.
      ملاحظة: قد تساعد أوقات درجات الحرارة البطيئة (التدفئة والتبريد) على منع تزييف السقالات.
2. تعريض مقاومة للضوء للأشعة فوق البنفسجية (350-400 نانومتر) من خلال قناع ضوئي مع طاقة التعرض من 215-240 ملليجول / سم² لسمك مقاومة من 85 -110 ميكرومتر. راجع إرشادات الشركة المصنعة لأخصائية الكواتر الضوئية للارتباطات الموصى بها لسمك الطاقة.
   1. تأكد من معايرة التعرض بشكل صحيح بحيث يتم التحقق من الطاقة. ضبط وقت التعرض حسب الضرورة لتحقيق طاقة التعرض المطلوبة. وعلاوة على ذلك، قد تسمح أجهزة محاذاة القناع بأوضاع تعرض مختلفة: الاتصال الفراغي، والاتصال الثابت، والاتصال الناعم، والاتصال عن قرب (قد تختلف المصطلحات المحددة). بشكل عام، ستؤثر هذه الدقة ومحاذاة المعالم. استخدم المؤلفون عادة وضع "الاتصال الثابت".
   2. بالنسبة للمعالم الصغيرة أو الطبقات المتعددة، حيث ستكون المحاذاة مهمة، فكر في أوضاع التعريض الضوئي وإجراءات محاذاة القناع بعناية أكبر. تأكد من النظر في ارتفاع مقاومة عند ضبط قيمة سمك. راجع إجراءات التشغيل القياسية لصفيح القناع للحصول على تفاصيل العملية.
      ملاحظة: تصميم قناع ضوئي سيحدد حجم السقالات، هندسة المقصورة، وعدد السقالات التي تم الحصول عليها لكل دفعة. استخدام الزجاج الصلب أو قناع ضوئي الكوارتز سوف تسفر عن أعلى دقة. ومع ذلك، يمكن استخدام قناع ضوئي شفاف البوليمر لينة عموما لهذه الأحجام ميزة كبيرة (>10 ميكرومتر). قد يؤدي استخدام قناع ضوئي للفيلم إلى ميزات طوبوغرافية على طول محور z لمسام السقالة نتيجة لضعف دقة الميزة. قد يكون لهذا تأثير على سلوك الخلية. تحقق من القرار المطلوب التشاور مع كل من ينتج قناع ضوئي لضمان تحقيق القرار المطلوب.
3. خبز رقاقة مباشرة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في 65 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق ثم في 95 درجة مئوية لمدة 8-10 دقائق.
4. تطوير السقالات لإزالة مقاومة غير متطورة.
   1. تزج السقالات باستخدام حجم منخفض من SU-8 حل المطور لمدة 7-10 دقائق لإذابة أي مقاومة غير المطورة.
   2. شطف مع الكحول ايزوبروبيل (IPA).
   3. رقاقة جافة مع النيتروجين المضغوط.
      ملاحظة: كن حذرا خلال الخطوة 1.4 لعدم التسبب في الإفراج المبكر عن السقالات. كميات منخفضة من المطور والتعامل لطيف ضرورية لتحقيق ذلك.
5. بعد التطوير، من الصعب خبز رقائق في 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: بعد خبز الثابت، إيقاف hotplate للسماح الرقاقات لتبرد ببطء شديد قد يكون من المفيد في منع تزييف / الشباك من السقالات النهائية.
6. اختياري: بعد الخبز الصلب وقبل الإقلاع، تقييم سمك السقالة منذ السقالات لا يزال ينبغي أن تلتزم بلطف إلى سطح رقاقة. لهذا الإجراء، الاتصال profilometry يعمل بشكل جيد; ومع ذلك، يمكن استخدام أي طريقة مناسبة.
7. ارفع السقالات من الرقاقة
   1. غمر السقالات في مطور SU-8 لجعلها ترفع الرقائق على الفور. إذا لم ترفع السقالات ، فادفع السقالات برفق مع زوج من الملاقط.
   2. إزالة المطور الزائد.
   3. نقل السقالات في حاوية جديدة وتغمر في الكحول isopropyl. شطف في وكالة الألعاب الشعبية لمدة لا تقل عن 6 مرات لضمان إزالة جميع المطور.
8. الهواء يجفف السقالات لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام.

2. سقالة طلاء فيبروكتين

1. للتطهير، غمر السقالات في الإيثانول 70٪ (v/v) لمدة لا تقل عن 15 دقيقة، وغسل 2 مرات في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) قبل الاستخدام.
   تنبيه: السقالات SU-8 ضعيفة ويمكن كسرها بسهولة. ينصح بالمعالجة باستخدام ملقط حاد ومتعرج ، ويجب التعامل معها بعناية فائقة. يمكن تحقيق سهولة التعامل عن طريق غمر السقالات في السائل ، لتجنب التفاعلات الكهروستاتيكية بين السقالات والسطح.
2. إعداد تخفيف 50 ميكروغرام / مل من فيبروكتين الإنسان في برنامج تلفزيوني وتغطية السقالات عن طريق امتصاص البروتين.
   1. مزيج 1.5 ميكرولتر من محلول الأسهم فيبروكتين (1 ملغ / مل) مع 28.5 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل سقالة لتكون البذور. ويفضل، وإعداد واحد فقط فيبروكتين تخفيف لاستخدامها لجميع السقالات لتجنب أخطاء الأنابيب.
      1. ل10 سقالة, مزيج 15 ميكرولتر من الأسهم فيبروكتين حل في 285 μL من برنامج تلفزيوني, تصل إلى ما مجموعه 300 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل فيبروكتين تخفيف.
   2. ضع السقالات بشكل متفرق فوق سطح مسعور (أي زراعة غير نسيجية (nonTC) طبق 10 سم) وقم بتغطية كل سقالة ب 30 ميكرولتر من تخفيف فيبروكتين المعد في الخطوة 2.2.1.
      تنبيه: تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة في مقصورات السقالات. إذا كانت الفقاعات موجودة ، يمكن إزالتها عن طريق هز السقالة بلطف داخل القطرة أو الأنابيب الخفيفة.
   3. استبدل غطاء اللوحة وضع السقالات المغطاة بالفيبروكتين في حاضنة مع 37 درجة مئوية ورطوبة 100٪ لمدة ساعة على الأقل.
   4. بعد الحضانة، شطف طفيفة السقالات في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا فيبروكتين. يمكن الاحتفاظ السقالات في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل الاستخدام.

3. الخلايا البطانية البذر

1. إعداد المتوسطة EC عن طريق خلط المتوسط القاعدي مع مكوناته مجموعة متوسطة مراسل, بما في ذلك محلول مضاد حيوي (القلم / ستريب), مصل الأبقار الجنين (FBS), ومكملات نمو الخلايا البطانية, كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
2. جعل تعليق الخلية البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الدهنية البشرية (HAMEC) في وسط المفوضية الأوروبية مع تركيز 4 × 10⁶ خلايا / مل.
   ملاحظة: يمكن إجراء التصوير في الوقت الحقيقي إذا تم إعادة إصابة الخلايا البطانية المستخدمة سابقا للتعبير عن بروتين فلوري ، أو ملطخة مسبقا باستخدام صبغة غشاء سيتوبلازمي غير سامة (يشار إليها كذلك باسم ECs).
3. باستخدام ملقط، ضع سقالة واحدة مغلفة فيبروكتين لكل بئر على لوحة غيرTC 24-well well.
4. تغطية كل سقالة مع 25 قطرات ميكرولتر من تعليق HAMEC. حذار عدم السماح للتعليق تدفق بعيدا عن السقالة، لأنه يمكن أن يعوق الالتصاق الخلية.
5. ضع الغطاء على اللوحة وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ و 100٪ رطوبة. دع الحضانة لمدة لا تقل عن 60 دقيقة وبحد أقصى 90 دقيقة.
   ملاحظة: أثناء الحضانة، يؤدي وضع اللوحة على شاكر مداري داخل الحاضنة إلى تحسين ارتباط الخلية بجدران السقالة. يجب تعيين شاكر المداري في ما لا يزيد عن 5 دورة في الدقيقة.
6. بعد الحضانة، ملء كل بئر مع 700 ميكرولتر من المتوسطة EC باستخدام ماصة.
   ملاحظة: نتوقع أن نرى ECs في الجزء السفلي من البئر، لأن بعض الخلايا لا نعلق على سقالة وتسقط من خلال الفراغات سقالة.
7. احتضان السقالات البطانية حتى يمكن ملاحظة التقاء EC باستخدام المجهر الفلوري على جدران السقالة (عند استخدام ECs المسمى) ، أو لمدة 3 أيام (عند استخدام ECs غير المسمى) ، مما يوفر وقتا كافيا لتحقيق التقاء EC. تغيير المتوسطة كل يومين.

4. دعم بذر الخلايا والثقافة المشتركة

1. إعداد الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSC) المتوسطة (DPSCm) عن طريق خلط 500 مل من متوسط النسر المعدلة Dulbecco منخفضة الجلوكوز (منخفضة الجلوكوز DMEM)، 57.5 مل من FBS، 5.75 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 5.75 مل من الغلوتاماكس، و 5.75 مل من محلول البنسلين-العقدية-النيستاتين.
2. نقل السقالات البطانية إلى لوحة جديدة غيرTC 24 جيدا لتجاهل ECs تعلق على أسفل الآبار باستخدام ملقط.
   1. تجاهل جميع الوسائط من اللوحة الحالية باستخدام ماصة 1 مل، أو شفط الفراغ. يجب الحرص على عدم تطبيق فراغ مباشرة على السقالة.
   2. ضع سقالة واحدة لكل بئر ، ويفضل أن تكون في وسط البئر لتجنب تشغيل السائل نحو الجدران بسبب آثار التوتر السطحي. جفف المنطقة المحيطة بالسقالة مع فراغ خفيف ولكن تجنب التجفيف الكامل للسقالة.
3. إعداد تعليق DPSC في حل ما قبل هلام الفيبرين.
   1. تمييع thrombin وحلول الأسهم الفيبرينوجين مع برنامج تلفزيوني حتى الحصول على تركيز النهائي من 5 U / مل و 15 ملغ / مل، على التوالي.
   2. إعداد تعليق 8 ×^{10 6} DPSC / مل في تخفيف 5 U / مل thrombin وتوزيعها في eppendorfs الفردية 12.5 ميكرولتر من تعليق وقال لكل سقالة لتكون المصنف.
   3. تعيين ماصة 5-50 ميكرولتر (أو ما شابه ذلك) إلى 12.5 ميكرولتر وملئه مع محلول الفيبرينوجين 15 ملغ / مل.
   4. دون إزالة طرف، تعيين ماصة إلى 25 ميكرولتر. يجب أن ترتفع المادة الموجودة في الطرف وتترك حجما فارغا نحو فتحة الطرف.
   5. اضغط ببطء على زر المكبس حتى يصل السائل إلى فتحة الطرف ولكن لا يتسرب. عقد المكبس في هذا الموقف ووضع غيض في واحدة من أنابيب الطرد الدقيق التي تحتوي على الخلايا في تعليق الثرومبين، والتأكد من طرف على اتصال مع السائل.
      تنبيه: سيبدأ الربط العرضي للفيبرين مباشرة بعد ملامسة الثرومبين والفيبرينوجين. وينبغي أن تتم الخطوة التالية بسرعة.
   6. حرر زر المكبس برفق وارسم تعليق الخلية في الطرف. مزيج تماما كل من المواد، وتجنب تشكيل فقاعة.
4. الاستغناء بسرعة المواد المختلطة على رأس سقالة البطانية. كرر الخطوات السابقة لكل سقالة، مع التأكد من تغيير النصائح دائما بين الاستخدامات لتجنب تشكيل هلام الفيبرين غير متوقع داخل الطرف.
5. استبدل غطاء اللوحة واحتضن السقالات عند 37 درجة مئوية و5٪ CO₂ ورطوبة 100٪ لمدة 30 دقيقة.
6. بعد الحضانة، ملء كل بئر مع 1 مل من 1:1 DPSC و EC المتوسطة.
   1. الثقافة لمدة أسبوع واحد ، وتغيير المتوسطة كل يومين.
   2. أثناء الثقافة، قم بإزالة الوسط من البئر وصورة البنى باستخدام مجهر كونفوجكال في نقاط زمنية مختلفة لدراسة تطور الأوعية الدموية أو أي معلمة أخرى ذات أهمية.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة فقط إذا تم إجراء التجربة باستخدام ECs المسمى. انظر الخطوة 6 - ملاحظة لمزيد من التوضيح.

5. تلطيخ immunofluorescent لعلامات الأوعية الدموية المميزة

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية في الآبار نفسها حيث تم cultured الإنشاءات. من المهم التأكد دائما من أن الحلول تغطي السقالات تماما. وعلاوة على ذلك، عند الإمكان، ينصح تنفيذ الخطوات على شاكر المداري، وإن لم يكن إلزاميا.

1. في اليوم السابع، تخلص من الوسائط من الآبار وشطف السقالات بإضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار، وإزالتها باستخدام الفراغ.
2. إصلاح السقالات بإضافة 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 20 دقيقة. يغسل في PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل.
3. Permeabilize الخلايا الثابتة باستخدام 0.3 ٪ تريتون العاشر في برنامج تلفزيوني (الخامس / الخامس) لمدة 15 دقيقة. يغسل في PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل.
4. إعداد 5٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني (ث / الخامس) حل حجب وتغطية السقالات. يترك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
   ملاحظة: جميع المبالغ الحل المطلوب سوف تعتمد على عدد من السقالات لتكون ملطخة. إعداد الحلول حسب الحاجة الحفاظ على التركيزات المذكورة.
5. إعداد وتطبيق الأجسام المضادة الأولية تلطيخ الحل.
   1. تمييع أرنب المضادة فون Willebrand عامل (vWF) الأجسام المضادة 1:150 والفأر المضادة SMA الأجسام المضادة 1:50 في حل حظر جديدة.
      ملاحظة: يمكن استخدام علامات الخلايا البطانية الأخرى، مثل CD31 أو VE-Cadherin.
   2. تغطية السقالات مع حل الأجسام المضادة الأولية والحفاظ على 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل في PBS ثلاث مرات، 5 دقائق لكل غسل.
6. إعداد وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية تلطيخ الحل.
   1. تمييع الماعز المضادة للفأرة Cy3 الأجسام المضادة 1:150 والماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 1:400 في برنامج تلفزيوني.
   2. تغطية السقالات مع حل الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل 3 مرات في PBS، 5 دقائق لكل غسل. الحفاظ على سقالة ملطخة في 0.3٪ PFA في برنامج تلفزيوني (v/v) لمدة تصل إلى شهر.

6. سقالة التصوير confocal وتحليل تطوير الأوعية

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية على السقالات الثابتة والملطخة عند النقطة الزمنية النهائية المختارة أو، إذا تم استخدام الخلايا الفلورية، أثناء فترة ثقافة الخلية دون الحاجة إلى إنهاء التجربة. وبالنسبة لهذه الأخيرة، يوصى بتحديد نقاط زمنية محددة؛ يظهر هذا العمل اليوم 0 (قبل البذر SCs)، والأيام 1 و 3 و 5 و 7 بعد البذر SCs(الشكل 3A).

1. صورة السقالات باستخدام المجهر confocal مع عدسة 5X والتكبير من 0.5 ومجموعة z الكامل من السقالة. سيسمح هذا بالتقاط 9 مقصورات منفصلة للهندستين التربيعية والتعميمية ، أو 8 مقصورات كاملة للهندسة السداسية. صورة إشارة الفلورسنت والضوء المرسلة، للحصول على كل من هيكل شبكة السفينة وهندسة المقصورة(الشكل 3A).
2. باستخدام ImageJ (أو أي برنامج معالجة صور آخر)، قم بقص كل مقصورة فردية؛ لهذه العملية، فقط علامات شبكات الأوعية الدموية هي ذات الصلة. إزالة أي وعاء لا يقع داخل منطقة المقصورة. إنشاء إسقاط كثافة الحد الأقصى وحفظ كل مقصورة اقتصاص الفردية كصورة TIFF.
   1. في ImageJ، اضغط على ملف > فتح وحدد صورة TIFF المطلوبة التي تحتوي على عدة مقصورات. يجب أن تحتوي الصورة على قناتين على الأقل، شبكة المراكب الفلورية، والصورة الضوئية المرسلة.
   2. من شريط الأدوات، حدد أداة تحديد المضلع. حدد قناة الضوء المرسلة. انقر على واحدة من زوايا المقصورة سداسية، في واجهة بين منطقة المقصورة وجدار السقالة، وهذا سوف تبدأ تعريف القناع. استمر في النقر على الزوايا التالية بترتيب تسلسلي حتى يتم تحديد الزاوية الأولية، وإغلاق القناع.
      ملاحظة: ينطبق هذا التفسير على حجرة سداسية. عندما تكون المقصورة إما مربعة أو دائرية، استخدم أدوات المستطيل أو البيضاوي، على التوالي، لإنشاء قناع مناسب. بغض النظر عن الشكل، تناسب دائما قناع لمتابعة الجدار الداخلي للسقالة.
   3. انقر على تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار (ROI، منطقة الاهتمام)، انقر فوق الزر إضافة لحفظ القناع الذي تم إنشاؤه. سيظهر القناع الجديد في قائمة الجانب الأيسر. تسمح هذه الخطوة للتحليل أن يكون متسقا بين الصور المختلفة.
      ملاحظة: في مدير ROI، فمن الممكن لحفظ ملف مع جميع الأقنعة التي تم إنشاؤها عن طريق النقر على المزيد من > حفظ. في إطار حفظ التحديد، اختر اسما وموقعا، واحفظ الملف .roi. لاسترداد القناع، في مدير عائد الاستثمار، انقر على المزيد من > فتح واختيار الملف المطلوب .roi.
   4. حدد صورة شبكة السفينة الفلورية وانقر على تحرير > واضح خارج. ستبقى الصورة الموجودة في القناع فقط، بينما سيتم القضاء على الباقي.
   5. مع صورة شبكة مسح مفتوحة، انقر على صورة > مكررة. في الإطار المنبثق مكررة، اكتب اسم الصورة. إذا تم تحديد hyperstack مكررة، إلغاء تحديده وانقر فوق موافق. سيتم إنشاء صورة جديدة تحتوي فقط على شبكات السفن الفلورية المزروعة.
   6. حفظ الصورة اقتصاص بالنقر على ملف > حفظ كما > Tiff. اختر الاسم والدليل وانقر فوق موافق.
3. تحليل تطور الأوعية الدموية على الصور اقتصاص.
   1. تحميل وتثبيت البرمجيات التحليلية الحرة AngioTool، الذي يوفر أدوات كمية لتحديد مجموعة متنوعة من المعلمات الأوعية الدموية. يمكن الحصول على البرنامج من العنوان التالي https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. تعيين قيمة مقياس الصور للحصول على نتائج في وحدات ملليمتر وتحميل صورة.
      1. انقر على علامة التبويب الإعداد وملء المسافة بالبكسل والمسافة في مم مع القيم التمثيلية من الصور التي تم التقاطها. باستخدام معلمات التصوير المذكورة أعلاه، تبلغ القيم المطلوب تعبئتها 400 بكسل لكل 1 مم.
      2. اضغط على الزر فتح الصورة واستعرض الصورة التي تهمك.
   3. اختر معلمات التحليل لتحديد كمية تطوير السفن في علامة التبويب تحليل.
      1. تحت قطر السفينة وكثافة المجال، إلغاء تحديد أي علامة الحالية من محدد النطاق العلوي، وتفعيل علامة تمثل عدد 3.
      2. تحت قطر السفينة وكثافة المجال، على محدد النطاق السفلي، نقل علامة النطاق السفلي إلى 60، وترك صانع الحارس عالية في 255.
      3. قم بتنشيط مربع إزالة الجسيمات الصغيرة وقم بتعيين العلامة إلى 100.
      4. ضمن الحقل حفظ التفضيلات، حدد اسم وموقع ملف ورقة الانتشار الذي سيتم حفظ النتائج فيه واضغط على زر تشغيل التحليل. إذا تم تحديد مربع صورة حفظ النتيجة، سوف Angiotool توليد وحفظ صورة JPEG جديدة تظهر المعلمات شبكة السفينة كميا.
         ملاحظة: لكل تحليل تنفيذ دون تغيير اسم ملف ورقة انتشار، سيتم إضافة صف جديد في الجزء السفلي من الملف، مع نتائج المكتسبة حديثا.
4. تنظيم البيانات وتشغيل تحليل إحصائي.
   1. بالنسبة لجميع الصور المعالجة، اختر المعلمة ذات الأهمية من ورقة الانتشار (مثل إجمالي طول السفينة ومنطقة السفينة)وادخلها في برنامج تحليل إحصائي لدراسة النتائج التي تم الحصول عليها بشكل صحيح(الشكل 3C).

7. التصوير الفاصل الزمني لاكتشاف المنشأ وتتبع الهجرة

1. بدلا من ذلك، لزراعة السقالات في الحاضنة كما هو موضح في الخطوة 4.6، تعيين غرفة ثقافة المجهر confocal إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ و 100٪ الرطوبة.
   1. ضع اللوحة التي تحتوي على السقالات المصنفة بالكامل في غرفة المجهر الكونفوجكال وحدد معلمات التصوير للقيم المطلوبة.
   2. تعيين الفاصل الزمني لالتقاط الصورة إلى 30 دقيقة، وإجمالي وقت التصوير 72 ساعة. وهذا سيمكن من تشغيل الفاصل الزمني تماما دون الحاجة إلى تغيير متوسط.
      تنبيه: في حالة الرغبة في تصوير الفاصل الزمني الأطول، يجب إجراء معايرة موقف دقيق لتكون قادرة على استرداد موقع التصوير الأصلي، لأن التغييرات المتوسطة تتطلب إزالة لوحة من حاضنة confocal وإلى غطاء محرك السيارة البيولوجية العقيمة.
      ملاحظة: سيبدأ انفصال المركبات من جدران السقالة وتشكيل الهياكل الأنبوبية في غضون الساعة الأولى بعد بذر مركبات الكربون الهيدروفلورية (الخطوة 4) وقد يستغرق إكماله ما يصل إلى 50 ساعة. بعد تشكيل الأنبوب الأولي ، ستبدأ براعم جديدة في الهجرة إلى المقصورة من السفن المحيطة بها. سوف تنتشر وإعادة عرض الشبكة اللاحقة تستمر طوال التجربة تقريبا حتى اليوم 10، عندما تصبح شبكات السفن مستقرة²². استخدم هذه المعلومات لاختيار نقطة البداية الفاصل الزمني وخطوة الوقت وفقا لذلك.
2. حفظ ملف الفيلم الفاصل الزمني الكامل كتسلسل TIFF.
3. افتح ImageJ وانقر فوق ملف > استيراد تسلسل > الصورة وحدد الملفات. سيؤدي هذا إلى فتح تسلسل TIFF كفيلم.
4. فتح دليل تتبع البرنامج المساعد عن طريق النقر على الإضافات > التتبع اليدوي. سيؤدي هذا إلى فتح إطار التتبع.
5. مراقبة الفيلم وحدد السفينة ليتم تعقبها. انتبه إلى أصلها وهجرتها.
6. تنشيط مربع إظهار المعلمات وإدخال 30 دقيقة للفاصل الزمني. تعتمد معايرة x/y على مقدار البكسل الذي تم تحديده أثناء التصوير.
7. المضي قدما لتتبع يدويا السفن تنبت من كفاف سقالة.
   1. اضغط على الزر إضافة مسار. في الإطار الأول للفيلم، اضغط على موقع السفينة ليتم تعقبها. بعد ذلك، سيتم تغيير الفيلم إلى الإطار التالي تلقائيا.
   2. انقر على صورة الإطار الثاني حيث يقع السفينة. مرة أخرى، سيتم تغيير الفيلم إلى الإطار التالي تلقائيا.
   3. المضي قدما مع نفس السفينة حتى يتم الانتهاء من تتبع الهجرة الكامل.
   4. في إطار التتبع، انقر فوق تراكب النقاط والخطوط لطبع مسار مرئي لترحيل السفينة على الفيلم. سيؤدي ذلك إلى فتح نسخة من الفيلم مع نقطة تمثل الموضع الحالي للمتعقب ، وخط يظهر المسار السابق.
   5. انقر على زر نهاية المسار لإنهاء تسجيل حركة السفينة الحالية.
   6. انقر على زر إضافة المسار مرة أخرى لتبدأ من جديد مع سفينة جديدة. عند القيام بذلك، فإن علامات الخط والنقطة تغير لونها تلقائيا للسفينة الجديدة. كرر حتى يتم تعقب جميع السفن المطلوبة.
      ملاحظة: يمكن استرجاع الموقع x/y وسرعة السفينة والمسافة المنقولة من نتائج النافذة المنبثقة. سيتم تحديد كل سفينة من خلال رقم مسارها في العمود الموجود في أقصى اليسار. يمكن نسخ هذه البيانات ولصقها في ورقة انتشار لإجراء مزيد من التحليل.

النتائج

البروتوكول المقدم، وذلك باستخدام تقنيات التصوير المجسم، يسمح لتصنيع السقالات تيسلاتيد مصنوعة من SU-8 الضوئي. تم الحصول على السقالات مع هندسات مقصورة متميزة (المربعات ، السداسي ، والدوائر) ، وميزات دقيقة للغاية وقابلة للتكرار(الشكل 1).

الشكل 1:صور المجهرالإلكتروني المسح التمثيلي ...

المناقشة

الحاجة إلى الأوعية الدموية الغنية داخل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة المهندسة أمر بالغ الأهمية لبناء البقاء على قيد الحياة والوظيفة المناسبة¹. على الرغم من أن هندسة نظام الأوعية الدموية كانت محور كمية كبيرة من البحوث ، إلا أنه لم يتبق الكثير للتحقيق وفهم^24. على وجه الخصوص ، عند إعادة إنشاء نسيج معين ، يجب أن تتصرف الميكروسكولاتور وتنظم وفقا^{لذلك 12.} النهج الأكثر شيوعا لتوليد microvessels هو المشاركة في البذر البطانية ودعم الخلايا داخل بيئة 3D مناسبة متوافق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
تنزيل برنامج Angiotool المجاني	NIH-CCR		مجانا في https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
مصل ألبومين البقر Probumin	Millipore	82-045-1
الخلايا الجذعية لب الأسنان	Lonza	PT-5025
ECM media + طقم رصاصة	Sciencell	# 1001
الإيثانول 96٪	مجموعة Gadot-Group	64-17-5
مانع التسرب الفيبرين Evicel	Johnson& جونسون	EVB05IL	يوفر كلا من حلول الثرومبين والفيبرينوجين (BAC2)
جلوتاماكس	جيبكو	35050061
الماعز المضاد للفأر Cy3 الجسم المضاد	جاكسون	115-166-072
الماعز المضاد للأرانب Alexa-Fluor 488	Thermo- Fisher Scientific	A11034
خلايا الأوعية الدموية الدقيقة الدهنية البشرية	Sciencell	# 7200
Human فيبرونيكتين	سيجما	F0895-5MG	تركيز المخزون: 1 مجم / مل
ImageJ	للمعاهد الوطنية للصحة		في https://imagej.nih.gov/ij/download.html
كحول الأيزوبروبيل	Gadot-Group	67-63-0
كاشف الإقلاع	Kayaku Advanced Materials، Inc	G112850	الاسم التجاري Omnicoat
منخفض الجلوكوز DMEM	الصناعات	البيولوجية01-050-1A
الفأر المضاد للجسم المضاد SMA	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
محلول بارافورمالديهايد 4٪ في PBS	ChemCruz	SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution	الصناعات البيولوجية	03-032-1B
محلول ملحي مخزن بالفوسبات (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
الأرانب المضادة للجسم المضاد ل vWF	Abcam	ab9378
رقاقة السيليكون	وادي السيليكون للإلكترونيات الدقيقة (SVM)		رقائق 4 "، نوع N-1-10 ، 500-550 ميكرون
SU-8 2050 مقاوم للضوء	Kayaku Advanced Materials، Inc	Y11058
SU-8 المطور	Kayaku Advanced Materials، Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	57836