مقالة منهجية

تحديد برنامج ترجمة مرنا الأم أثناء النضوج في المختبر باستخدام اختبار مراسل Oocyte واحد

DOI:

10.3791/62041

⸱

يونيو 16, 2021

 ,  ,  , 
1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مقاهات المراسل لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي في البويضات المفردة أثناء النضج في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصفت جيدا الأحداث المرتبطة النضج النووي البويضات. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن المسارات والعمليات الجزيئية التي تحدث في السيتوبلازم استعدادا للإخصاب واكتساب التوبيتوتين. أثناء نضوج البويضات، تعتمد التغيرات في التعبير الجيني حصريا على ترجمة وتدهور الحمض النووي الريبي الرسولي الأمومي (mRNAs) بدلا من النسخ. وبالتالي، يلعب تنفيذ البرنامج الترجمي دورا رئيسيا في تأسيس كفاءة نمو البويضات للحفاظ على نمو الجنين. هذه الورقة هي جزء من التركيز على تحديد برنامج ترجمة الحمض النووي الريبي الأمومي الذي يحدث أثناء النضج المتوسط وفي الانتقال من البويضات إلى الزيجوتي. في ورقة الأسلوب هذه، يتم تقديم استراتيجية لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر. هنا، يتم دمج مراسل Ypet إلى المنطقة 3 'غير المترجمة (UTR) من جين الفائدة ومن ثم حقنها في البويضات جنبا إلى جنب مع ترميز ميرنا متعددة الأضلاع ل mCherry للسيطرة على حجم حقن. باستخدام المجهر الفاصل زمنيا لقياس تراكم المراسل، يتم حساب معدلات الترجمة في انتقالات مختلفة أثناء النضج الدموي البويضات. هنا، تم وصف بروتوكولات عزل البويضات وحقنها، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات، وذلك باستخدام مراسل Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3'UTR كمثال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضع البويضات الثديية الكاملة النمو لتغيرات سريعة استعدادا للإخصاب واكتساب التريبوتين. وهذه التغيرات ضرورية للحفاظ على النمو الجنيني بعد الإخصاب. على الرغم من أن الأحداث المرتبطة بالنضج النووي موصوفة بشكل جيد نسبيا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن العمليات والمسارات الجزيئية في السيتوبلازم البويضات. خلال المراحل النهائية من نضوج البويضات ، تكون البويضات صامتة نسخيا ، ويعتمد التعبير الجيني اعتمادا كليا على ترجمة ميرناوتدهورها 1،2. تركيب البروتينات الحاسمة للكفاءة التنموية، لذلك، يعتمد على برنامج الترجمة في الوقت المناسب من الحمض النووي الريبي طويلة الأجل التي تم توليفها في وقت سابق خلال نمو البويضات1،3. كجزء من التركيز على تعريف هذا البرنامج من ترجمة مرنا الأم المنفذة خلال النضج المطيسي وفي الانتقال البويضات إلى الزيجوتي، تقدم هذه الورقة استراتيجية لدراسة تفعيل وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي الأم المستهدفة في البويضات واحدة أثناء النضج المتوسطي في المختبر.

في هذه الطريقة، يتم استنساخ إطار القراءة المفتوحة YPet المنبع من UTR 3 'من نص الاهتمام. بعد ذلك، يتم حقن mRNAs ترميز هذا المراسل في البويضات جنبا إلى جنب مع mRNAs متعددة الأضلاع ترميز mCherry للسيطرة على حجم حقن. يتم قياس تراكم المراسل أثناء النضج الدموي في المختبر باستخدام المجهر الفاصل الزمني. يتم تسجيل تراكم البروتين الفلوري الأصفر (YFP) و mCherry في البويضات الفردية ، ويتم تصحيح إشارات YFP من خلال المستوى الهضب للمشيري المحقون. بعد الحصول على البيانات، يتم حساب معدلات الترجمة لفواصل زمنية مختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر عن طريق حساب منحدر المنحنى الذي تم الحصول عليه عن طريق تركيب المنحنى.

ويوفر هذا النهج أداة للتأكد تجريبيا من التغيرات في ترجمة الرنانات الذاتية المختارة. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا الأسلوب توصيف العناصر التنظيمية التي تتحكم في الترجمة أثناء النضج البويضي من خلال التلاعب بالعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من 3' UTR من mRNAs الهدف4،5،6. التلاعب في طول ذيل بولي (A) يسمح أيضا نظرة ثاقبة النشاط adenylase / deadenylase في البويضات5. يمكن استخدام موتاجينيسيس من عناصر رابطة الدول المستقلة بالنيابة أو RNA المناعي لدراسة التفاعلات مع cognate الحمض النووي الريبي ملزمة البروتينات6،7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المكونات الأساسية لبرنامج الترجمة التي تعتبر حاسمة لكفاءة نمو البويضات من خلال قياس الهدف 3' ترجمة UTR في النماذج المرتبطة بانخفاض جودة البويضات 8و9و10. تقدم ورقة الأسلوب هذه تجربة تمثيلية حيث تم حقن البويضات الناضحة لفئران C57/BL6 البالغة من العمر 21 يوما بالحقن الدقيق مع مراسل Ypet المنصهر في UTR 3 من IL-7. وقد وصفت الإعداد والبروتوكول لحقن البويضات، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية التي تشمل الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (البروتوكول AN182026).

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. إضافة جميع المكونات، كما هو موضح في الجدول 1،لجعل مجموعة البويضات الأساسية المتوسطة والمتوسطة نضوج البويضات. بالنسبة إلى وسيطة التجميع الأساسية، قم بتعيين درجة الحموضة إلى 7.4. لكل من جمع ونضوج المتوسطة, إضافة 3 ملغم / مل من الألبومين مصل البقري (جيش العمل الأميركي) و 1 ميكرومتر cilostamide في يوم الاستخدام.

2. إعداد ترميز مرنا لYpet-3 'UTR و mCherry

  1. الحصول على تسلسل UTR 3 من mRNAs من الفائدة.
    ملاحظة: لهذه الدراسة، تم الحصول على تسلسل سابقا من الماوس البويضات cDNA.
  2. تصميم التمهيديات لتضخيم الهدف 3 'UTRs من cDNA البويضات وأجزاء من ناقلات PCDNA 3.1 التي تحتوي على تسلسل الترميز Ypet، V5-epitope العلامة، والمروج T7.
  3. تضخيم باستخدام مجموعة بوليمرات الحمض النووي عالية الدقة. تشغيل البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (PCR) المنتجات على هلام للتحقق مما إذا كانت شظايا لها الحجم الصحيح، وقطع العصابات، واستخراج الحمض النووي من هلام باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. دمج شظايا PCR إلى متجه باستخدام عدة استنساخ PCR.
    ملاحظة: تم احتضان شظايا PCR على الجليد لمدة 4 ساعة لتسهيل عملية إعادة التركيب الأكثر كفاءة. وهذا يتعارض مع تعليمات الشركة المصنعة، التي توصي بفترة حضانة 45 دقيقة فقط.
  5. شظايا PCR ترانسفيكت إلى المختصة 5-α Escherichia القولونية البكتيريا.
    1. يضاف المزيج والبلازميد إلى البكتيريا، ويحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. الحرارة صدمة المزيج وplasmid عن طريق وضع الخليط في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 45 ق، وتبرد على الفور على الجليد لمدة 3 دقائق.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من مرق سوبر الأمثل مع قمع تقويض (SOC) المتوسطة واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    4. تدور أسفل في 7000 × غرام لمدة 2 دقيقة، وإزالة معظم supernatant. ريسوسبند ولوحة على لوحة لوريا مرق (LB) أجار مع المضادات الحيوية الاختيار المناسب.
      ملاحظة: تم استخدام كاربينسيلين في هذه الدراسة.
    5. حضانة بين عشية وضحاها في 37 °C. عزل المستعمرات عن طريق الضغط بخفة على طرف ماصة على واحدة من المستعمرات ووضعه في 3 مل من LB المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل من كاربينسيلين. حضانة لمدة 12-24 ساعة في 37 درجة مئوية.
    6. استخراج الحمض النووي للplasmids باستخدام عدة عزل الحمض النووي البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتأكيد تسلسل عن طريق تسلسل الحمض النووي.
  6. لYpet / 3 ' UTR:
    1. إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر. استخدام التمهيدي إلى الأمام المنبع من تسلسل Ypet والتمهيدي العكسي مع 20 بقايا الثيمين إضافية. انظر الجدول 2 لتسلسل Ypet/IL-7 3'UTR وتسلسلات التهيئة الأمامية والعكسية.
      ملاحظة: هذه بقايا الثيمين إضافية سوف تضيف oligo(A) إلى مرنا الخطية بعد النسخ في المختبر .
    2. في المختبر نسخ المنتج PCR باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. تنقية الحمض النووي الريبي التكميلي الناتج (cRNA) باستخدام عدة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. Elute cRNA المنقى في المياه الخالية من RNAse، وقياس التركيز وتقييم السلامة عن طريق إلكتروفورسيس agarose. يخزن عند -80 درجة مئوية.
  7. ل mCherry:
    1. إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر باستخدام إنزيم تقييد عالي الدقة؛ استخدام تقييد إنزيم mfEI-HF إذا تكرار هذا المثال. هضم في عازل الهضم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. تشغيل هلام لتنقية العينة، واستخراج الحمض النووي الخطي باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. في المختبر نسخ المنتج PCR باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. Polyadenylate الرنا (150-200 النيوكليوتيدات) باستخدام عدة المخلفات بولي (A) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    5. تنقية cRNA الناتجة باستخدام عدة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    6. Elute cRNA المنقى في المياه الخالية من RNAse، وقياس تركيزات مرنا، وتقييم سلامة الرسالة عن طريق الكهربائي هلام. يخزن عند -80 درجة مئوية.

3. إجراء تجريبي

ملاحظة: يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية للحقن المجهري البويضات والمجهر الفاصل الزمني اللاحق في الشكل 1.

  1. اليوم الأول
    1. حقن Intraperitoneally الفئران 21 يوما من العمر مع 5 وحدة IU من gonadotropin مصل فرس الحوامل لتعزيز نمو الجريبات إلى المرحلة الأنترال11.
  2. اليوم الثالث
    1. جمع البويضات
      1. الفئران التضحية 44-48 ح بعد فتيلة لجمع المبيضين، ووضعها في طبق بيتري البلاستيك مع المتوسطة جمع البويضات الأساسية.
      2. افتح بصيلات الأنترال بعناية عن طريق إجراء قطع صغير في جدار الجريب بإبرة 26 G. عزل البويضات المغلقة الركلس سليمة (COCs) مع عدة طبقات من خلايا الركامي باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم.
      3. استخدام ماصة أصغر (أكبر قليلا من قطر البويضات)، وdenude ميكانيكيا COCs عن طريق الأنابيب المتكررة.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بإجراء الحقن الدقيق على COCs سليمة.
      4. باستخدام ماصة أكبر، يستنشق البويضات النضح ووضعها في طبق بيتري مع متوسط النضج تستكمل مع 1 ميكرومتر من مثبط فوسفوديستيراز، cilostamide، لمنع استئناف النضج الميوتي12. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 2 ساعة للسماح للبويضات بالشفاء من الإجهاد الناجم عن عزل البويضات عن الجريبات.
    2. Oocyte حقن الصغرى
      1. إعداد الإبر الحقن عن طريق وضع 10 سم طويلة البوروسيليكات الزجاج أنبوب الشعرية في سحب الميكانيكية. للحقن الأمثل، ثني طرف الإبرة في زاوية 45 درجة باستخدام خيوط ساخنة.
      2. إعداد أطباق البوليسترين مع قطرات 20 ميكرولتر من المتوسطة جمع البويضات الأساسية، وتغطية قطرات مع الزيت المعدني الخفيف.
      3. إعداد مزيج مراسل بإضافة 12.5 ميكروغرام / μL Ypet - 3 'UTR و 12.5 ميكروغرام / μL mCherry. إعداد حجم أكبر وجعل aliquots للتجارب المستقبلية لضمان تركيزات مراسل مماثلة. تخزين هذه aliquots في -80 درجة مئوية. عند ذوبان الجليد، أول جهاز طرد مركزي وaliquot لمدة 2 دقيقة في 20،000 x ز،ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد.
        ملاحظة: سيمنع هذا الطرد المركزي إبرة الحقن من انسدادها بواسطة المجاميع المحتملة في مزيج المراسل.
      4. تحميل إبرة الحقن عن طريق الشعيرات الدموية مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من مزيج المراسل.
      5. وضع ماصة عقد وإبرة حقن محملة في أصحاب، والموقف في قطرة من البويضات جمع المتوسطة. يستنشق بعض من المتوسطة في ماصة عقد.
      6. فتح إبرة الحقن عن طريق التنصت بلطف ضد ماصة عقد.
      7. ضع البويضات في قطرة من وسيط التجميع الأساسي ، وحقن 5-10 pL من مزيج المراسل.
      8. احتضان البويضات في المتوسط النضج مع 1 ميكرومتر cilostamide لمدة 16 ساعة للسماح للإشارة mCherry إلى الهضبة.
      9. إعداد طبق بيتري التي سيتم استخدامها للمجهر الفاصل الزمني مع ما لا يقل عن اثنين من قطرات 20 ميكرولتر من متوسط النضج لكل مراسل حقن: قطرة واحدة مع 1 ميكرومتر cilostamide للسيطرة على البويضات البروبهاز الأول اعتقل وقطرات واحدة دون cilostamide للبويضات النضج. تغطية قطرات مع الزيت المعدني الخفيف ومكان في حاضنة.
    3. المجهر الفاصل الزمني
      1. بعد مرحلة ما قبل الحضانة، قم بإزالة البويضات المحقونة من الحاضنة، وغسلها أربع مرات في وسط النضج دون السيلوستاميد. الحفاظ على بعض البويضات في المتوسط النضج مع 1 ميكرومتر cilostamide كمجموعة مراقبة البويضات بروبهاز I-القبض.
      2. نقل البويضات المحقونة إلى قطرات كل منها على طبق المجهر الفاصل الزمني المعد مسبقا. الكتلة البويضات باستخدام ماصة زجاجية مغلقة (يمكن إعداد ماصة مغلقة عن طريق عقد غيض في لهب لبضع ثوان).
        ملاحظة: تجميع البويضات يساعد على منع حركتهم أثناء التسجيل.
      3. ضع الطبق تحت المجهر المجهز بنظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء ومرحلة مزودة بمحرك مجهز بغرفة بيئية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2. لتكرار هذه الدراسة، استخدم المعلمات التالية: مجموعة عوامل التصفية: مرآة ديكهروبيك YFP/CFP/mCherry 69008BS; قناة YFP (الإثارة (على هيئة): S500/20 × 49057؛ الانبعاثات (EM): D535/30 m 47281)، قناة mCherry (على: 580/25 × 49829؛ م: 632/60 م).
      4. أدخل الإعدادات المناسبة لتجربة الفاصل الزمني (راجع جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة): انقر على التطبيقات | اكتساب متعدد الأبعاد. حدد علامة التبويب الرئيسية الأولى وحدد الفاصل الزمني، ومواضع المراحل المتعددة، والأطوال الموجية المتعددة.
      5. حدد علامة التبويب حفظ لإدخال الموقع الذي يجب حفظ التجربة فيه.
      6. حدد علامة التبويب Timelapse لإدخال عدد النقاط الزمنية والمدة والفاصل الزمني.
        ملاحظة: تعتمد مدة تجربة الفاصل الزمني على الأنواع الحيوانية التي تمت دراستها ، حيث يختلف توقيت النضج الدموي بين الأنواع. في هذه التجربة مع البويضات الماوس، تم تسجيل البويضات كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة.
      7. حدد مرحلةعلامة التبويب . قم بتشغيل brightfield وحدد موضع البويضات عن طريق فتح نافذة جديدة عن طريق تحديد الحصول على | الحصول على | عرض مباشر. مرة واحدة يتم تحديد موقع البويضات، والتحول مرة أخرى إلى نافذة اكتساب الأبعاد المتعددة، واضغط + لتعيين موقع البويضات.
      8. حدد علامات التبويب الأطوال الموجية، وتعيين 3 أطوال موجية مختلفة ل brightfield (التعرض 15 مللي ثانية) ، YFP (التعرض 150 مللي ثانية لYpet / IL7 3 'UTR) ، وmCherry (التعرض 75 مللي ثانية لYpet / IL7 3 ' UTR).
        ملاحظة: ضبط التعرض لكل مراسل UTR Ypet/3 'استنادا إلى مستوى تراكم المراسل وحجم حقن. تأكد من أن إشارة YFP تقع في وسط نطاق الكشف في بداية التجربة لمنع التقليل من شأن أو التشبع في حالة تنشيط الترجمة. بالنسبة إلى mCherry، قم بضبط التعرض لكل دفعة من mCherry حيث تعتمد الإشارة على عدد النيوكليوتيدات الأدينينية التي تمت إضافتها أثناء إجراء تعدد الغدد. بسبب الاختلاف في كفاءة تعدد ال ملادين، استخدم نفس الدفعة من mCherry في تجارب مختلفة لإجراء مقارنة أفضل بين التجارب.
      9. ابدأ تجربة الفاصل الزمني بالنقر على اكتساب. انظر الشكل 2 والملف التكميلي للحصول على مثال لتسجيل الفاصل الزمني في بويضة واحدة.
    4. تحليل ترجمة Ypet-3 'UTR
      1. لهذا التحليل (انظر جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة) ، قم بإجراء قياسين للمنطقة لكل بويضة: البويضات نفسها انقر فوق منطقة القطع الناقص وتحيط بالبويضات - ومنطقة صغيرة قريبة من البويضات لاستخدامها في النقر على خلفية الطرح على منطقة مستطيلة.
        ملاحظة: تأكد من عدم تحرك البويضات خارج المنطقة المحددة أثناء التسجيل الفاصل الزمني. إيلاء اهتمام خاص لوضع قياس المنطقة حول قذف الجسم القطبي، لأن هذا يسبب الحركة في البويضات، ويمكن أن تشوه التسجيل.
      2. تصدير بيانات قياس المنطقة إلى جدول بيانات بالنقر أولا على فتح سجل ثم على تسجيل البيانات لتصدير برنامج تحليل البيانات.
      3. لكل بويضة فردية ولجميع النقاط الزمنية المقاسة، قم بطرح قياس منطقة الخلفية من قياس منطقة البويضات. القيام بذلك لأطوال موجية YFP و mCherry بشكل منفصل.
      4. تسجيل توقيت انهيار الحويكل الجرثومي (GVBD) وبث الجسم القطبي (PBE) للرجوع إليها في وقت لاحق.
        ملاحظة: استبعاد البويضات الماوس maturing عندما يتجاوز GVBD 2 ساعة.
      5. رسم YFP والتعبير mCherry مع مرور الوقت لكل البويضات للتحقق من القيم المتطرفة.
        ملاحظة: يجب أن يكون هذا منحنى سلس، إذا لم يكن هذا قد يشير إلى أن البويضات انتقلت أثناء التسجيل.
      6. لكل البويضات الفردية، حساب متوسط التعبير mCherry لآخر عشر نقاط زمنية من التسجيل. لكل نقطة زمنية، قم بتقسيم تعبير YFP على متوسط التعبير mCherry لتصحيح الحجم المحقون للحصول على نسبة YFP/mCherry في كل نقطة زمنية لكل بويضة فردية.
      7. حساب معدلات الترجمة لفترة زمنية محددة عن طريق تركيب المنحدر من منحنى الانحدار الخطي. تقييم الفروق في معدلات الترجمة باستخدام الاستدلال الإحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم حقن البويضات التي تم القبض عليها من قبل Denuded prophase I لفئران C57/BL6 البالغة من العمر 21 يوما بمزيج مراسل يحتوي على ترميز الحمض النووي الريبي لمراسل Ypet المنصهر في UTR 3 من IL-7 و mRNA ترميز mCherry. تم تسجيل تعبير YFP و mCherry في 39 بويضة ، منها 30 نضجت ، وألقي القبض على 9 في prophase I كتحكم سلبي. تم استبعاد ثلاث بويضات ناضجة للتحليل لأنها إما تأخرت GVBD (N = 2) أو انتقلت في الطبق أثناء التسجيل (N = 1). الشكل 3 يظهر mCherry وتعبير YFP في prophase I والبويضات الناضجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف الطريقة المقدمة استراتيجية لدراسة تنشيط وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف في التحولات المختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر. IL-7، تم اختيار السيتوكين الصادر عن البويضات التي قد تشارك في الاتصالات الخلية البويضات-الركامية8،13،لغرض وصف هذه الطريقة. ومن المعروف IL-7 أن تترجم على نحو متزايد خلال نضوج البويضات8 ويسمح لتصور جيد للتنشيط الترجمة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك، إذا حدثت الترجمة بمعدل ثابت طوال التجربة، فإن تراكم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM097165، GM116926 ومراكز يونيس كينيدي شرايفر NICHD الوطنية للبحوث التحويلية في الإنجاب والعقم P50 HD055764 لماركو كونتي. 10- وتحظى إنريكو م. دالديلو بدعم من زمالة من مؤسسة لالور، وتحظى ناتاسيا ج. ج. كوسترمانز بدعم من زمالة روبيكون من المنظمة الهولندية للبحث العلمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> تحضير الوسائط < / قوي >
مصل الألبومين مسحوق Bioxtraسيجما ألدريتشSIAL-A3311
سيلوستاميدEMD ميليبور231085
MEM ألفاجيبكو12561-056
الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي   ؛محلول Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x ، شركة Genesee Scientific Corporation المعقمة المفلترة(GenClone)25-512
بيكربونات الصوديوم   ؛JT-Baker3506-1
بيروفات الصوديومGibco  11360-070
الماء المقطر عالي النقاءInvitrogen10977-015<
strong> إعداد mRNA الذي يشفر YFP / 3 'UTR و mCherry< / strong>
AgaroseApex Biomedical  20-102QD
كربينيسيلين ملح ثنائي الصوديومسيجما-ألدريتشC1389-1G
Choo-Choo طقم استنساخMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)صبغة تحميل الحمض النووي New England BiolabsB7204
(6x)محلول Thermo ScientificR0611
dNTPNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 كيلو بايت سلم الحمض النوويThermo FisherSM1333
LB Agar Plates مع 100 & micro ؛ جم / مل كاربينيسيلين ، تكنوفا   ؛TeknovaL1010
LB متوسط (كبسولات)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife Technologies LifeAM1908
MfeI-HF إنزيم تقييدنيو إنجلاند BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 طقم النسخInvitrogenAM1344
Phusion الحمض النووي عالي الدقة بوليميرازنيو إنجلاند بيولابسM0530
بولي (أ) طقم مخلفاتInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit   ؛Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. متوسطThermo Fisher15544034
TAE buffer   ؛أبيكس بيوميديكال 20-193
Ultra Pure Ethidium BromideSolution Life Technologies15585011<
strong> Ovcyte collection< / قوي >
تجميع أنبوب الشفاط للماصات الدقيقة المعايرةSigma-AldrichA5177-5EA
الماصات الدقيقة المعايرةDrummond Scientific Company2-000-025 & nbsp ؛
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide إبرة 26 جم × 1/2د.ب305111
حقنة 1 ملBD309659
<قوية> حقن دقيق للبويضات < / قوي >
35 مم طبق | رقم 0 غطاء | قطر الزجاج 20 مم | غير مصقولMatTekP35G-0-20-Cللفحص المجهري بفاصل زمني
زجاج البورسليكات مع أداة Sutter الفتيلBF100-78-10
زيت لزراعة الأجنةIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006للحقن
الدقيق لطبق زراعة الأنسجةFalcon353001لحضانة البويضات
VacuTip القابضة الشعريةEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderإعداد الشكل 1S
MetaMorph، الإصدار 7.8.13.0 الجزيئية  للفحص المجهري بفاصل زمني ، تحليل ترجمة UTR 3 '  ؛
البقر الأجهزة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399(2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Maternal mRNA TranslationOocyte MaturationSingle Oocyte AssayIn Vitro MaturationReporter AccumulationTime Lapse MicroscopyOocyte InjectionCumulus Oocyte ComplexTranslation RegulationYFP mCherry Ratio

مقالات ذات صلة