يحدد هذا البروتوكول طريقة روتينية لاستخدام المجهر الإلكتروني للمسح التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM)، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قوية. يعتمد التطبيق الناجح ل SBF-SEM على تقنيات التثبيت وتلطيخ الأنسجة المناسبة ، بالإضافة إلى النظر بعناية في إعدادات التصوير. ويتضمن هذا البروتوكول اعتبارات عملية لهذه العملية برمتها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسمح المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) بجمع مئات إلى آلاف الصور فائقة الهيكلة المسجلة بشكل متسلسل ، مما يوفر رؤية ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة لاستئصال الأنسجة الدقيقة. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه. يستفيد نظام التصوير هذا من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد. ومع ذلك، دون إعداد الأنسجة المناسبة البنية الفوقية الخلوية يمكن تغييرها بطريقة يمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة أو مضللة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء الصور عن طريق مسح الوجه الكتلي لعينة بيولوجية مضمنة في الراتنج، وهذا غالبا ما يمثل تحديات واعتبارات يجب معالجتها. تراكم الإلكترونات داخل الكتلة أثناء التصوير، والمعروفة باسم "شحن الأنسجة"، يمكن أن يؤدي إلى فقدان التباين وعدم القدرة على تقدير الهيكل الخلوي. وعلاوة على ذلك، في حين أن زيادة كثافة شعاع الإلكترون / الجهد أو خفض سرعة مسح شعاع يمكن أن تزيد من دقة الصورة، وهذا يمكن أن يكون أيضا الآثار الجانبية المؤسفة من إتلاف كتلة الراتنج وتشويه الصور اللاحقة في سلسلة التصوير. هنا نقدم بروتوكول روتيني لإعداد عينات الأنسجة البيولوجية التي تحافظ على البنية الفوقية الخلوية ويقلل من شحن الأنسجة. كما نقدم اعتبارات التصوير للحصول السريع على صور تسلسلية عالية الجودة مع الحد الأدنى من الضرر لكتلة الأنسجة.
المقدمة
تم وصف المجهر الإلكتروني (SBF-SEM) لأول مرة من قبل Leighton في عام 1981 حيث صمم مجهرا إلكترون المسح الضوئي معززا بفغر صغير مدمج يمكن أن يقطع ويصور أقساما رقيقة من الأنسجة المضمنة في الراتنج. لسوء الحظ، القيود التقنية حصرت استخدامه في العينات التوصيلية، حيث تراكمت عينات غير موصلة مثل الأنسجة البيولوجية مستويات غير مقبولة من الشحن (تراكم الإلكترون داخل عينة الأنسجة)1. في حين طلاء كتلة الوجه بين التخفيضات مع الكربون المتبخر خفض شحن الأنسجة، وهذا الوقت زيادة كبيرة في اقتناء التصوير وتخزين الصور ظلت مشكلة كما تكنولوجيا الكمبيوتر في ذلك الوقت لم تكن كافية لإدارة أحجام الملفات الكبيرة التي أنشأها الجهاز. تمت إعادة النظر في هذه المنهجية من قبل دنك وهور....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية وطب العيون وكلية هيوستن للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات البصريات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل المؤسسات التي تم التعامل معها: الماوس والجرذ والأرنب وخنزير غينيا ، وتمت الموافقة على إجراءات الرئيسيات غير البشرية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في جامعة هيوستن ، وتمت الموافقة على إجراءات حمار وحشي من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ديباو ، ووافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في كلية بايلور للطب. وقد عولجت جميع الأنسجة البشرية وفقا لإعلان هلسنكي فيما يتعلق بالبحوث المتعلقة بالأنسجة البشرية وتم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ماوس كورنيا
تم تطبيق هذا البروتوكول بشكل مكثف على قرنية الماوس. باستخدام التصوير SBF-SEM شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين (EFMBs) تبين أن تكون موجودة داخل القرنية الماوس الكبار. وكان يعتقد في السابق أن هذه الشبكة لم تكن موجودة إلا أثناء النمو الجنيني والمبكر بعد الولادة. كشفت SBF-SEM عن شبكة EFMB واسعة النطاق في جميع أنحاء القرنية ، مع ألياف فردية تبين أن قطرها يتراوح بين 100-200 نانومتر عند قياسها في المقطع العرضي. كما وجد أن شبكة EFMB هذه تم تنظيمها في طبقات متميزة ، مع ألياف مرتبطة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الغرض من ورقة الأساليب هذه هو تسليط الضوء على منهجية إعداد الأنسجة والتصوير التي سمحت لمختبرنا بالتقاط صور المجهر الإلكتروني التسلسلي عالية الدقة بشكل موثوق ، والإشارة إلى الخطوات الحاسمة التي تؤدي إلى هذه النتيجة وكذلك المزالق المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إجراء التصوير SBF-SEM. النجاح باستخدام هذا البروتوكول يتطلب التثبيت السليم للأنسجة، وتلقيح المعادن الثقيلة في العينة، وتعديلات من الراتنج تضمين للحد من الشحن، فضلا عن فهم المجهر وإعدادات التصوير المستخدمة لجمع الصور. مقولة ، "الجودة في ، والجودة" هو بديهية مناسبة للت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر الدكتور سام هانلون وإيفلين براون ومارغريت غوندو على مساعدتهم التقنية الممتازة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 EY-018239 و P30 EY007551 (المعهد الوطني للعيون) ، جزئيا من قبل مؤسسة الأسد للبصر ، وجزؤا من قبل NIH 1R15 HD084262-01 (المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1/16 × 3/8 برشام الألومنيوم | الصناعي برشام & شركة السحابة | 6N37RFLAP / 1100 | تستخدم كدبابيس عينة. |
| 2.5 مم مفك براغي مسطح | الرأس Wiha أدوات الجودة | 27225 | |
| علوم المجهر الإلكتروني | الأسيتون RT 10000 | تستخدم لتخفيف الطلاء الفضي. | |
| حمض الأسبارتيك | سيجما ألدريتش | A8949 | |
| كلوريد الكالسيوم | فيشر Scientific | C79-500 | |
| طلاء فضي موصل | تيد بيلا | 16062 | |
| جهاز الاخرق بالفراغ Denton Desk-II مجهز بهدف رقائق الذهب القياسية | Denton Vacuum | N / A | هذا هو جهاز الاخرق الذهبي الذي يستخدمه المؤلفون ، البدائل مقبولة. |
| شفرات الحلاقة ذات الحدين | فيشر Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | علوم المجهر الإلكتروني | 14120 | |
| Gatan 3View2 مثبتة في انبعاث ميداني Tescan Mira3 SEM | Gatan & Tescan | N / A | هذا هو جهاز SBF-SEM الذي يستخدمه المؤلفون ، والبدائل مقبولة. |
| قوارير القشرة الزجاجية ، 0.5 DRAM (1.8 مل) | علوم المجهر الإلكتروني | 72630-05 | |
| علوم المجهر الإلكتروني | الجلوتيراالديهايد | 16320 | |
| Gorilla Super Glue - Impact Tough | NA | NA | يشار إليه باسم غراء السيانوا أكريليت في النص. |
| يشار إلى Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | على أنه أسود الكربون في النص. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| نترات الرصاص | فيشر Scientific | L62-100 | |
| ميكروويف | Pelco | BioWave Pro | هذا هو الميكروويف الذي يستخدمه المؤلفون ، البدائل مقبولة. |
| أوزميوم رباعي أكسيد | سيجما ألدريتش | 201030 | |
| البوتاسيوم فيروسيانيد | سيجما-ألدريتش | P9387 | |
| تضمين السيليكون | تيد بيلا | 10504 | |
| علوم المجهر الإلكتروني ثلاثي هيدرات الصوديوم | 12300 | ||
| سامكو نقل ماصة | ThermoFisher Scientific | 202 | تستخدم لصنع دبوس العينة أنابيب التخزين. |
| ملفات إبرة النمط السويسري | علوم المجهر الإلكتروني | 62115 | |
| ثيوكاربوهيدرازيد | سيجما ألدريتش | 223220 | |
| أورانيل أسيتات | بولي ساينسز ، إنك. | 21447-25< | |
| strong>Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N / A | تستخدم لإنشاء عمليات إعادة البناء الموجودة في الشكلين 5-7 و 9. |
| فيجي (فيجي هي مجرد ImageJ) | ImageJ.net | يمكن إضافة N / A | TrakEM2 إلى فيجي للمشاركة في التجزئة اليدوية. |
| متصفح الصور المجهري (MIB) | جامعة هلسنكي ، معهد التكنولوجيا الحيوية | N / A | |
| Reconstuct Software | Systems Lab | N / A | |
| SuRVoS Workbench | مصدر ضوء الماس & جامعة نوتنغهام | N / A | |
| SyGlass | IstoVisio، Inc. | غير متاح | يسمح بإعادة الإعمار في الواقع الافتراضي وطرق إعادة البناء القائمة على الرسم البياني. |
المراجع
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
