يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق في تكلس الصمام الأبهري عن طريق العزلة وثقافة الخلايا الليمفاوية T باستخدام الخلايا المغذية من معطف بافي المشعع

3.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62059

⸱

فبراير 4, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Campus Benjamin Franklin, Charité Universitätsmedizin Berlin and German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), 2Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Berlin Institute of Health, 4Department of Cardiology, German Heart Centre Berlin (DHZB), 5Sod of Interdisciplinary Internal Medicine, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi (AOUC), 6Department of General and Interventional Cardiology, Helios Klinikum Erfurt

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة، ونحن نصف عملية عزل الخلايا الليمفاوية T من عينات جديدة من الصمامات الأبهري المتكلسة والخطوات التحليلية لاستنساخ الخلايا التائية لتوصيف المجموعات الفرعية الكريات البيض التكيفية باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.

الملخص

يرتبط مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD)، وهو عملية مرض نشطة تتراوح بين سماكة خفيفة للصمام إلى تكلس شديد، بارتفاع معدل الوفيات، على الرغم من الخيارات العلاجية الجديدة مثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR).

المسارات الكاملة التي تبدأ مع تكلس الصمام وتؤدي إلى تضيق الأبهر الشديد لا تزال مفهومة جزئيا فقط. من خلال توفير تمثيل وثيق لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي ، يمكن أن يكون فحص الخلايا الليمفاوية T من أنسجة الصمام الشهوتي طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس. بعد الختان الجراحي ، يتم تشريح عينة الصمام الأبهري الطازجة في قطع صغيرة ويتم استزراع الخلايا الليمفاوية T ، واستنساخها ثم تحليلها باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).

إجراء تلطيخ بسيط ويمكن أيضا أن تكون ثابتة أنابيب ملطخة باستخدام 0.5٪ من paraformaldehyde وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. ويمكن استخدام النتائج الناتجة عن لوحة تلطيخ لتتبع التغيرات في تركيزات الخلايا التائية مع مرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن بسهولة مواصلة تطويرها لتقييم حالات التنشيط للأنواع الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام. في هذه الدراسة، نظهر عزلة الخلايا التائية، التي أجريت على عينات الصمام الأبهري المتكلسة الطازجة وخطوات تحليل استنساخ الخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي لزيادة فهم دور المناعة التكيفية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD.

المقدمة

مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD) هو واحد من أكثر اضطرابات صمام القلب شيوعا ، مع تأثير كبير على الرعاية الصحية. ازدادت وتيرة استبدال الصمام الأبهري في السنوات الأخيرة بشكل كبير ومن المتوقع أن تزيد أكثر، بسبب تزايد عدد السكان المسنين1.

الفيزيولوجيا المرضية الأساسية من CAVD معروفة جزئيا فقط وتقتصر الاستراتيجيات العلاجية الحالية على التدابير المحافظة أو استبدال الصمام الأبهري ، إما من خلال الإجراءات الجراحية أو عن طريق الجلد. حتى الآن، لا يمكن لأي علاج طبي فعال أن يعيق أو يعكس تطور CAVD ويرتبط ارتفاع معدل الوفيات بظهور الأعراض المبكر، ما لم يتم إجراء استبدال الصمام الأبهري (AVR)2. في المرضى الذين يعانون من تضيق الأبهر أعراض حادة، تم الإبلاغ عن البقاء على قيد الحياة خالية من الأعراض لمدة 3 سنوات منخفضة حتى 20٪3. يمثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR) خيارا جديدا ، مما أحدث ثورة في علاج المرضى المعرضين لخطر كبير ، خاصة بين كبار السن ، وخفض بشكل كبير معدل الوفيات ، الذي كان مرتفعا في جوهره في هذه الفئة من السكان 4،5،6. على الرغم من النتائج الواعدة ل TAVR ، من الضروري إجراء مزيد من الأبحاث لفهم الفيزيولوجيا المرضية CAVD لتحديد الأهداف العلاجية المبكرة الجديدة7،8،9.

كان يعتقد سابقا أن تكون سلبية, عملية التنكسية, ومن المسلم به الآن CAVD كمرض التقدمية النشطة, تتميز التبديل الظاهري العظمي من الخلايا الخلالية الصمام الأبهري10. هذا المرض ينطوي على التمعدن التدريجي، والتغيرات الليفية وانخفاض حركية منشورات الصمام الأبهري (التصلب)، والتي تعوق في نهاية المطاف تدفق الدم مما يؤدي إلى تضييق (تضيق) من فتح الصمام الأبهري11.

يعتبر الالتهاب عملية رئيسية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD ، على غرار عملية تصلب الشرايين الوعائية. إصابة البطانية تمكن من ترسب وتراكم أنواع الدهون، وخاصة البروتينات الدهنية المؤأكسدة في الصمام الأبهري12. تثير هذه البروتينات الدهنية المؤأكسدة استجابة التهابية ، لأنها سامة للخلايا ، مع النشاط الالتهابي الذي يؤدي إلى التمعدن. وقد تم مؤخرا تسليط الضوء على دور المناعة الفطرية والتكيفية في تطوير CAVD وتطور المرض13. تم توثيق تنشيط وتوسع التخفي من مجموعات فرعية محددة من خلايا الذاكرة T في المرضى الذين يعانون من CAVD ومنشورات الصمام الأبهري المعدنية ، بحيث يفترض أن العمليات الالتهابية تشارك على الأقل في تطوير CAVD ويفترض في تطور المرض كذلك 14. في الواقع ، على الرغم من وجود خلايا عرض المستضدات والكواعم في كل من الصمام الصحي والمرض ، فإن وجود الخلايا الليمفاوية T يدل على صمام الأبهر المسن والمرض. هذا التسلل اللمفاوي جنبا إلى جنب مع زيادة في الأوعية الدموية الجديدة و metaplasia هي علامات النسيجية المميزة من CAVD15.

نحن نفترض وجود تفاعل بين الخلايا الخلالية الصمام الأبهري وتنشيط الجهاز المناعي، مما قد يؤدي إلى بدء عملية التهابية مزمنة في الصمام الأبهري. يمكن أن يكون فحص الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري النتنة طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس ، حيث يمكن أن يوفر تمثيلا وثيقا لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي. في العمل الحالي ، باستخدام أنسجة الصمام الأبهري ، نعزل الخلايا الليمفاوية التائية ، والثقافة واستنساخها ، ونقوم بعد ذلك بتصنيفها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS). تم استئصال عينات الصمام الأبهري الطازجة من مرضى CAVD الذين تلقوا استبدال الصمام الجراحي للتوضيق الأبهري الشديد. بعد استئصال الجراحية، تم تشريح عينة صمام جديد في قطع صغيرة وزراعة الخلايا التائية، استنساخ ثم تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. إجراء تلطيخ بسيط ويمكن إصلاح الأنابيب الملطخة باستخدام 0.5٪ من البارافورمالديهايد وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. يمكن استخدام البيانات الناتجة من لوحة التلطيخ لتتبع التغيرات في توزيع الخلايا الليمفاوية T بمرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن تطويرها بسهولة لتقييم حالات التنشيط للمجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام.

يمكن أن يكون استخراج الأنسجة المتكلسة وعزل الكريات البيض عن الأنسجة المتكلسة وخاصة استخدام قياس التدفق الخلوي على هذا النوع من الأنسجة أمرا صعبا ، بسبب مشكلات مثل الفلورة الذاتية. ولا توجد سوى منشورات قليلة مع بروتوكولات لهذا الغرض المحدد16,17,18. هنا نقدم بروتوكول مصمم خصيصا لعزل مباشرة والثقافة من الخلايا الليمفاوية T من عينات الصمام الأبهري البشري. التوسع الكلوني للخلايا الليمفاوية هو السمة المميزة للحصانة التكيفية. دراسة هذه العملية في المختبر يوفر معلومات ثاقبة على مستوى التغايرية الخلايا الليمفاوية19. وبعد فترة حضانة مدتها ثلاثة أسابيع، أصبحت استنساخات الخلايا التائية جاهزة للتنضح، حيث تم الحصول على كمية كافية من الخلايا التائية من كل استنساخ، وذلك للسماح بإجراء دراسة فينوتبيك ووظيفية. في وقت لاحق يتم دراسة النمط الظاهري من استنساخ تي عن طريق قياس الخلايا.

هذا البروتوكول المناعي هو تكييف لطريقة سبق أن طورتها أميدي وآخرون لعزل الخلايا التائية وتوصيفها من الأنسجة البشرية ، والمصممة خصيصا للأنسجة البشرية المتكلسة ، كما هو الحال في CAVD20،21،22. البروتوكول هنا لعزل PBMCs (خلايا الدم المحيطية أحادية النووية) باستخدام معطف برتقالي مشع يصف طريقة فعالة للحصول على الخلايا المغذية (FC)، تعديلها خصيصا لمرحلة استنساخ الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية صمام. تتكون الطبقة المغذية من الخلايا الموقوفة للنمو ، والتي لا تزال قابلة للحياة وحيوية. دور الخلايا المغذية مهم لدعم البقاء على قيد الحياة في المختبر ونمو الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية صمام23. من أجل تجنب انتشار الخلايا المغذية في الثقافة، يجب أن تخضع هذه الخلايا لوقف النمو. ويمكن تحقيق ذلك بطريقتين: من خلال الطرق الفيزيائية مثل التشعيع، أو من خلال العلاج بالمواد الكيميائية السامة للخلايا، مثل الميتوميسين C (MMC)، وهو مضاد حيوي مضاد للورم يمكن تطبيقه مباشرة على سطح الثقافة24. هنا نظهر تغذية خلية النمو اعتقال يتحقق من خلال تشعيع الخلية.

تقدم هذه الطريقة طريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لعزل وتوصيف الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري ، مما يساهم في توسيع نطاق الطرق المناعية لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية CAVD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت الدراسة وفقا للنظام الأساسي للهيئة الخيرية لضمان الممارسة العلمية الجيدة، كما تم احترام المبادئ التوجيهية والأحكام القانونية المتعلقة بالخصوصية والأخلاق. ووافقت لجنة الأخلاقيات على جميع التجارب البشرية، وتم الحفاظ على خصوصية المرضى وعدم الكشف عن هويتهم وفقا للقواعد المبلغ عنها في نموذج الأخلاقيات.

ملاحظة: للبروتوكول المذكور أدناه تم استخدام عينات صمام النتنة البشرية الطازجة.

1. إعداد الكاشف

  1. إعداد المتوسطة RPMI المخصب كاملة بإضافة في RPMI 1640 المتوسطة: الأحماض الأمينية غير الأساسية; الصوديوم بيروفات، L- الجلوتامين، ß-ميركابتوثانول وبينيسلين-ستريبتوميسين (القلم / ستريب). فلتر قبل الاستخدام. يخزن عند +4 درجة مئوية ويستخدم في غضون شهرين.
  2. إعداد وسيطة زراعة الخلايا (CCM) لمرحلة الاستنساخ باستخدام RPMI 1640 المخصب المتوسط الكامل المضافة الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، HB المتوسط القاعدي، 50 U من إنترلوكين 2 (IL-2) والمصل البشري (HS). تصفية واستخدامها في غضون يوم. لا تخزن.
  3. إعداد وسيطة ثقافة الخلية لمرحلة إعادة التغذية باستخدام وسيط RPMI 1640 الكامل الغني مع إضافة FBS وBB المتوسط القاعدي و30 U من IL-2 وHS. تصفية واستخدامها في غضون يوم. لا تخزن.
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 250 مل من RPMI و5 مل من القلم/العقدية. يخزن عند +4 درجة مئوية، ويستخدم في غضون شهرين.

2. عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة في قوارير T-25

  1. ضع عينة الصمام النتنة في طبق بيتري معقم مليء بحاجز الغسيل، مع ضمان تغطية عينة الصمام بأكملها به. دعك تقف لمدة 15 دقيقة.
  2. قطع الصمام النتنطي في قطع صغيرة باستخدام مشرط والسماح لها الوقوف مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
  3. إعداد وسيطة ثقافة الخلية مع 50 U من IL-2، كما هو موضح سابقا، وتصفية ذلك.
  4. إضافة CCM داخل قوارير T25 واستخدام plier البلاستيك العقيمة، ووضع قطع صمام داخل القوارير.
  5. تخزين قوارير في وضع عمودي داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد، مع الحرص على مراقبة حالة القارورة تحت المجهر. وينبغي أن تكون استنساخات الخلايا التائية مرئية بعد ثلاثة أيام تقريبا من خطوة الثقافة؛ لمراقبة أفضل فإنه من المستحسن لوضع قوارير في وضع أفقي لمدة 20 دقيقة قبل التحليل المجهري.
    ملاحظة: تعتمد كمية وسيطة زراعة الخلية على مقدار العينة الموجودة وعلى عدد قوارير T25 التي سيتم استخدامها. وبالنظر إلى أن كل قطعة من صمام يتطلب 10 مل من CCM داخل قارورة، 25 مل من CCM في قارورة T25 مناسب ل3 قطع من صمام.

3. مرحلة الاستنساخ

ملاحظة: بالنسبة لمرحلة الاستنساخ للخلايا التائية، من الضروري البدء بعزل الخلايا المغذية من معطف برتقالي مشع (BC)، باتباع بروتوكول PBMCs.

  1. افتح كيس BC تحت غطاء تدفق صفح باستخدام ارتفاع الحقيبة مع صمام خال من الإبر ونقل 50 مل من الدم في قارورة T150. إضافة 70 مل من برنامج تلفزيوني لتخفيف الدم داخل القارورة.
  2. تأخذ أربعة أنابيب مخروطية 50 مل ووضع 20 مل من متوسط التدرج الكثافة في كل وطبقة بعناية 30 مل من الدم أكثر من ذلك.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 25 دقيقة عند 800 × ز و 20 درجة مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  4. يستنشق بعناية supernatant والتخلص منه كنفايات. جمع حلقة PBMCs في أنبوب مخروطي 50ml جديدة إضافة داخل حل برنامج تلفزيوني تصل إلى حجم 50ml.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
  6. تجاهل supernatant وتعليق بيليه بإضافة داخل حل برنامج تلفزيوني يصل إلى حجم 50 مل. كرر مرحلة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
  7. تجاهل supernatant وتعليق FCs في 10 مل من الخلايا ثقافة المتوسطة.
  8. تأخذ أنبوب جمع جديدة وتمييع FCs مع برنامج تلفزيوني 1:10 بإضافة داخل 9.9 مل من برنامج تلفزيوني و 100 ميكرولتر من أنبوب مع FCs وخلية ثقافة المتوسطة. شطف جيدا مع ماصة واتخاذ 7 ميكرولتر من هذا التخفيف والعد الخلايا تحت المجهر.
  9. إعداد وسيطة زراعة الخلايا لمرحلة الاستنساخ: 70 مل مع 50 U من IL-2، ومن ثم تقسيمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 50 مل، وسيحتوي كل أنبوب على 25 مل من متوسط زراعة الخلايا، كما هو موضح أدناه:
    • أنبوب 1: 25 مل من CCM + FCs + 0.6٪ من phytohemagglutinin (PHA)
    • أنبوب 2: 25 مل من CCM + T الخلايا الليمفاوية
      ملاحظة: الهدف من طريقة PMBCs هو الحصول على 2 × 106 خلايا لكل مل، لذلك يجب حساب 25 مل من CCM المعدة (الأنبوب 1) وفقا لذلك. الصيغة العامة المستخدمة هي: عدد الخلايا المحصاة × 106: 1 مل = CCM × 106: X

4. T الخلايا الليمفاوية الثقافة في لوحات متعددةويل

  1. باستخدام ماصة الإلكترونية، وجمع كل وسيلة ثقافة الخلية داخل قوارير ونقله إلى أنبوب مخروطي 50 مل. يمكن رمي القوارير الفارغة بعيدا.
  2. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 × ز و 20 درجة مئوية.
  3. تجاهل supernatant، تعليق بيليه في 50 مل من برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 × ز و 20 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. تجاهل supernatant وتعليق بيليه في 1 مل من CCM. خذ 7 ميكرولتر من هذا التخفيف واحسب الخلايا تحت المجهر.
    ملاحظة: يجب ضرب عدد الخلايا التي تم عدها لحجم الغرفة وللتخفيف المطبق.
  5. المضي قدما لتخفيف الخلايا التي تم عدها من 105 إلى 103 في خلية الثقافة المتوسطة ومن ثم اتخاذ 500 ميكرولتر من 103 ووضعها داخل الأنبوب 2.
  6. صب 25 مل خلية الثقافة المتوسطة من أنبوب 1 داخل 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري البلاستيك.
  7. اتخاذ أربعة لوحات متعددة الآبار 96-U أسفل واستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر FCs البذور في كل بئر.
  8. خذ الأنبوب 2 وصب وسط ثقافة الخلية داخل طبق بيتري. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر، البذور الخلايا التائية في كل بئر.
  9. تخزين لوحات متعددة بويل داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد.

5. مرحلة إعادة التغذية الأولى

  1. باستخدام حقيبة معطف برتقالي مشع، اتبع طريقة PBMCs للحصول على مركبات الكربون الهيدروفلورية كما هو موضح في الطريقة السابقة.
  2. إعداد كمية مناسبة من CCM دون PHA وتصفيته.
  3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 ميكرولتر من كل بئر، مع ضمان عدم لمس الجزء السفلي من البئر.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من FCs في جميع الآبار كطبقة تغذية لتوفير المواد الغذائية ثقافة الخلية وتغيير المتوسط.
    ملاحظة: لكل متعددة الميزات ينصح بالنظر في 6 مل من CCM، وبالتالي فإن الكمية الموصى بها ل4 multiwells حوالي 30 مل. PHA (0.4٪ من إجمالي كمية CCM) يحتاج إلى إضافته إلى CCM مرة واحدة كل أسبوعين.

6. مرحلة إعادة التغذية الثانية

  1. كرر مرحلة إعادة التغذية بعد المقطع الموضح أعلاه. 0.4٪ PHA يحتاج إلى إضافته إلى وسيط ثقافة الخلية.

7. مرحلة التقسيم الأولى من بئر/عينة واحدة إلى بئرين/عينة

  1. تحقق من جميع الآبار الأربعة تحت المجهر وامضي قدما في تقسيم تلك الآبار مع استنساخ الخلايا التائية (TCCs).
  2. اتبع بروتوكول PBMCs لعزل الخلايا المغذية من كيس معطف برتقالي مشع.
  3. إعداد الوسط ثقافة الخلية مع 30 U من IL-2. إضافة FCs واتخاذ لوحة جديدة متعددة الآبار 96 جيدا مع أسفل يو.
  4. باستخدام ماصة تعيين إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل آبار العينات المختارة وتقسيم 200 ميكرولتر من حجم الواردة في كل بئر إلى بئرين جديدة من لوحة متعددة الآبار الجديدة، من أجل أن يكون 100 ميكروغرام من حجم لكل بئر من الآبار الجديدة 2.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من FCs داخل جميع الآبار الجديدة. يجب أن يحتوي كل بئر على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر.
  6. تعيين ماصة في 100 ميكرولتر وإضافة 100 ميكرولتر في بئرين إضافية، تحتوي على FCs فقط لتكون بمثابة عنصر تحكم.
    ملاحظة: استخدم المجهر الخفيف لمراقبة جميع لوحات متعددة الآبار من أجل تحديد الآبار التي نمت بنجاح TCC. لجعل اختيار المستنسخين أسهل ، يمكن إجراء مقارنة مع عنصر التحكم (البئران اللذين يحتويان على FCs فقط) ، مع ظهور المستنسخ أكثر قتامة وأكبر مقارنة بالتحكم. الآبار التي سيتم اختيارها هي تلك التي لديها استنساخ كبير وواضح وجولي ، مع الخلايا الليمفاوية معبأة بكثافة معا. إذا لم تكن هناك أية مراكز إعادة تغذية بعد أسبوعين من إعادة التغذية، فمن المستحسن الانتظار أسبوعا إضافيا وإجراء مرحلة إعادة تغذية إضافية.

8. مرحلة التقسيم الثانية من بئرين/عينة إلى 4 آبار/عينة

  1. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل بئرين من كل عينة والبذور بئرين جديدة من 100 ميكرولتر لكل واحد.
  2. إعداد الوسط ثقافة الخلية مع 30 U من IL-2 واتبع تقنية PBMCs لاستخراج FCs من حقيبة معطف بافي ووضع FCs داخل CCM.
  3. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر والبذور FCs في جميع الآبار. تخزين الحيوانات المتعددة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد.

9. مرحلة التقسيم الثالث من 4 آبار / عينة إلى 8 آبار / عينة:

  1. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 100 ميكرولتر، شطف جيدا داخل جميع الآبار الأربعة من كل عينة والبذور 100 ميكرولتر في كل من الآبار الأربعة الجديدة في لوحة جديدة 96 جيدا.
  2. إعداد الخلايا ثقافة المتوسطة واتبع تقنية PBMCs لاستخراج FCs من كيس معطف برتقالي مشع.
  3. ضع FCs داخل CCM. تعيين ماصة إلى 100 ميكرولتر والبذور FCs في جميع الآبار. تخزين الفيتامينات المتعددة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد

10. تحليل القياسات الخلوية

  1. خذ لوحة متعددة العينات مع أقدم تاريخ من حاضنة ثاني أكسيد الكربون وحدد أنابيب التجميع مع أرقام العينة لتحليلها.
  2. باستخدام ماصة متعددة القنوات تعيين إلى 200 ميكرولتر مع 2 نصائح، شطف جيدا داخل بئرين من نفس العينة ووضع كل من داخل أنبوب جمع نفسه. كرر هذه الخطوة لكافة العينات.
    ملاحظة: لن يتم تحليل عينات FCs، كما أنها تعمل فقط كعناصر تحكم.

11. الأجسام المضادة تلطيخ لوحة التحضير لتحليل السيتوفلوريومتري

  1. أضف 1 مل من محلول PBS لكل أنبوب وطارد مركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
  2. بعد مرحلة الطرد المركزي التخلص من supernatant.
    ملاحظة: يمكن العثور على لوحة تلطيخ الأجسام المضادة في الجدول 1. كل تركيز الأجسام المضادة واحد محسوبة حوالي 2 ميكرولتر / عينة. فمن المستحسن أن تدور لفترة وجيزة أنابيب الأجسام المضادة قبل الاستخدام. لحماية الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفوري من الضوء ، يجب تنفيذ جميع الخطوات في الظلام.
  3. إعداد مزيج الأجسام المضادة داخل أنبوب 1.5 مل ودوامة ذلك.
  4. إضافة الأجسام المضادة داخل العينات وترك عينات لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل عينة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 400 × ز و 20 درجة مئوية.
  6. تجاهل supernatant وتعليق بيليه مع 500 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني.
  7. 10 - المضي قدما في تحليل القياسات الخلوية (تحليل المركبات الهيدروفلورية، الجدول 1).
    ملاحظة: يمكن إصلاح العينات الملطخة باستخدام 0.5٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في حل PBS وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق.
    تنبيه: PFA سام ويجب التعامل معه بعناية.
علامهفلوروفور
CD3PE/Cy7
CD4أليكسا فلور 488
CD8البنفسجي الرائعة 510
CD14البنفسجي الرائعة 421
CD25PE
CD45البنفسجي الرائعة 711

الجدول 1 - الجداول لوحة تلطيخ الأجسام المضادة للكشف عن السكان T الخلايا الليمفاوية في مرض الصمام الأبهري تكلس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوصيف مجموعة الكريات البيض من عينات الصمام الأبهري الطازجة المستمدة من المرضى البشريين الذين يعانون من تضيق الصمام الأبهري الشديد (الرجوع إلى البروتوكول). 10- تعتبر طريقة عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور خطوة حيوية في الحصول على الخلايا المغذية، التي تستخدم في كل خطوة من مراحل التجربة (الاستنساخ وإعادة التغذية وتقسيم المراحل) وتمكن من الكشف عن الخلايا البيضاء المتسللة في عينات الصمام الأبهري وتوصيفها. تظهر الخطوات الرئيسية لهذا الأسلوب في الشكل 1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم طريقة لتوصيف الخلايا الليمفاوية T الخلايا الفرعية معزولة عن عينات الصمام الأبهري النتنة، وذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. تتطلب هذه الطريقة استخدام معطف برتقالي مشع لعزل PBMCs. تردد الإشعاع الذي يجب أن تتعرض أكياس معطف بافي هو 9000 راد /90 غراي (Gy) ويمثل خطوة حاسمة لوقف انتشار الخلايا المغذية. دور الخلايا المعزولة عن أكياس معطف بافي هو العمل فقط كخلايا مغذية وتوفير المواد الغذائية للخلايا التائية المعزولة عن الصمامات. ومن شأن استخدام كيس معطف برتقالي أحادي التشعيع أن يعزز انتشار مركبات PBMCs في الثقافة، كما لو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم تشعيع جميع أكياس معطف بافي المستخدمة لهذا البروتوكول بفضل توافر الدكتور بيتر روزنتال والدكتور ديرك بومر والفريق بأكمله من قسم الأشعة في شاريتيه بنجامين فرانكلين. حامل المنحة / ماري روكسانا كريستوفر ، ويدعم هذا العمل من خلال منحة دراسية من الجمعية الألمانية للقلب (DGK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
50 مل محاقن بلاستيكيةFisherbrand9000701
96- جيدا U- أسفل ألواح MultiwellGreiner Bio-One10638441
Bag Spike (خالية من الإبرة)SigmaP6148تمييع إلى 4٪ مع PBS
CD14 Brilliant violet 421  ؛ Biolegend560349
CD25 PE& nbsp ؛ Biolegend302621
CD3 PE / Cy7  ؛ Biolegend300316
CD4 Alexa Fluor 488  Biolegend317419
CD45 بنفسجي لامع 711  ؛ Biolegend304137
CD8 بنفسجي لامع 510  Biolegend301047
أنبوب Eppendorf 1.5 ملأنبوب Eppendorf13094697
Eppendorf 0.5 ملThermo ScientificAB0533
Falcon 15 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيFalcon10136120
Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةFalcon10788561
Falcon أنابيب البوليسترين المستديرةالقاع BD2300E
قراءة سريعة 102 غرفة عد بلاستيكيةKOVA INTERNATIONAL630-1893
مرشحات للثقافة المتوسطة 250 ملNalgeneThermo Fisher Scientific168-0045
مرشحات للثقافة المتوسطة 500 ملNalgeneThermo Fisher Scientific166-0045
HB 101 مكمل مجفف بالتجميدIrvine ScientificT151
HB Basal MediumIrvine ScientificT000
FBS معطل بالحرارة (مصل الأبقار الجنينية)EurocloneECS0180L
HS (مصل بشري)سيجما ألدريتشH3667
الإنسان IL-2 ISMiltenyi Biotec130-097-744
L-GlutamineGibco11140050
LymphoprepFalcon352057
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةسيجما11082132001
بارافورمالدهيدثيرمو فيشر العلمي10538931
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)10010023ثيرمو فيشر العلمي
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو1507006310000 وحدة / مل
PHA (هيماجلوتينين نباتي)الخلايا الجذعية تقنيات7811
أطباق بتريبلاستيكية R80115TS علمية حرارية10 0 مم × 15 مم
RPMI 1640 وسائل الإعلامHyClone15-040-CV
بيروفات الصوديومGibco من Life technologies11360070
مرشحات حقنة 0،45 وميكرو ؛ لRotilabo-SpritzenfilterP667.1
T-25 قوارير ثقافة الخلاياInvitrogenThermo Fisher ScientificAM9625
T-75 قارورة ثقافة الخليةThermo Fisher Scientific10232771
& beta - MercaptoethanolGibcoA2916801

المراجع

  1. Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
  2. Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
  3. Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
  4. Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
  5. Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
  6. Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
  7. Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
  8. Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
  9. Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
  10. Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).
  11. Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
  12. Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
  13. Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
  14. Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
  15. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
  16. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  17. Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).
  18. Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
  19. Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
  20. Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
  21. Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
  22. Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).
  23. Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
  24. Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
  25. Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).
  26. Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
  27. Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
  28. Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
  29. Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
  30. Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا اللمفاوية التائيةمرض الصمام الأبهري التكلسيقياس التدفق الخلوياستنساخ الخلايا التائيةعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيالخلايا التائية CD4التنشيط المناعي
التحقيق في تكلس الصمام الأبهري عن طريق العزلة وثقافة الخلايا الليمفاوية T باستخدام الخلايا المغذية من معطف بافي المشعع
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.