إنشاء وصيانة بيوبنك الحية -- كيف نفعل ذلك

في السنوات الأخيرة، أدت المعرفة المتراكمة لخصائص السرطانات السريرية والجينية إلى تصور السرطان كمرض فردي غير متجانس. وبالتالي، اكتسب توصيف الطفرات للأورام، بالإضافة إلى الميزات السريرية والمرضية، أهمية لاتخاذ القرارات السريرية وتم تطوير العديد من العلاجات المستهدفة لمختلف التعديلات الجزيئية. على سبيل المثال، يمكن التنبؤ بفعالية cetuximab في علاج سرطان القولون والمستقيم من خلال تحليل حالة الطفرات KRAS وPIK3CA ¹. الطب الدقيق يهدف إلى اتباع نهج مصمم خصيصا لتوفير أعلى استجابة العلاج في كل مريض وتجنب سمية العلاجات غير المهينة². تحتوي البنوك الحيوية على الأنسجة والدم والمواد البيولوجية الأخرى لمرضى السرطان ، والتي ترتبط بالبيانات السريرية ، وبالتالي فهي أداة ممتازة لأبحاث السرطان الترجمية. نظراً للعدد الكبير من العينات السريرية، تمكن البنوك الحيوية من الكشف عن الطفرات النادرة، ولكن يحتمل أن تكون قابلة للأدوية، والتي توفر فرص علاج جديدة للمريض الفردي³.

لتغطية أوسع قدر ممكن من طيف البحوث الأورام، ونحن لم تقييد نشاطنا على حصاد العينة وحدها، ولكن ركزت على إنشاء خطوط الخلايا السرطانية المستمدة من المريض وxenografts (PDX). تبقى خطوط الخلايا 2D التقليدية حجر الزاوية في البحوث في المختبر وهي الخيار الرئيسي لفحوصات المخدرات على نطاق واسع^4,5. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يكون تحليل خط الخلية أسهل وأرخص وأكثر سهولة. بالإضافة إلى ذلك ، منذ المريض المستمدة من الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية (PBL) متوفرة ، كما يمكن دراسة علم المناعة الورم في المختبر^6. ومع ذلك، فإن غالبية الأدوية المطورة حديثا مع الأثرية قبل السريرية واعدة في الخلية القائمة في المختبر أو في التجارب الحية، أظهرت نتائج مخيبة للآمال في التجارب السريرية⁷. في المقابل، وقد عكست الدراسات قبل السريرية على أساس PDX في الدراسات الجسمية النشاط السريري للعوامل antineoplastic أكثر من ذلك بكثير^{بأمانة 8}. منذ أنسجة PDX يعكس عن كثب الخصائص النسيجية والجزيئية للورم المانح، نماذج PDX هي وسيلة جيدة لنشر كميات محدودة جدا في كثير من الأحيان من أنسجة الورم قابلة للحياة للحفاظ على سلامة البنك الحيوي والسماح لتبادل العينات بين مجموعات البحوث والمؤسسات. وعلاوة على ذلك، يمكن تأسيس خطوط الخلايا السرطانية المستمدة من أنسجة PDX أسهل بكثير من خطوط الخلايا السرطانية الأولية⁹. في السنوات الأخيرة، أنشأت مجموعة العمل لدينا متكاملة متكاملة القولون والمستقيم والبنكرياس السرطان البيولوجية عن طريق توحيد الخطوة وتعظيم تدفق العمل لجميع العينات البيولوجية في السؤال(الشكل 1).

الشكل 1: سير العمل وتنظيم البنك الحيوي الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمت الموافقة على الدراسة التالية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمركز الطبي الجامعي روستوك (II HV 43/2004، A 45/2007، A 2018-0054، A 2019-0187 و A 2019-0222). وعلاوة على ذلك، وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات البيطرية ذات الصلة من قبل Landesamt für Landwirtschaft، Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern تحت أرقام التسجيل LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 و 7221.3-1-007/19.

1- المتطلبات المسبقة التجريبية

1. تلبية العديد من الشروط الإطارية الهامة لإنشاء بنك حيوي والحفاظ عليه.
   1. استخدام عيادة مع قسم الجراحية وعدد كاف من استئصال الأورام جنبا إلى جنب مع مختبر مجهزة تجهيزا جيدا والموظفين الأكاديميين كافية. ومن الشروط الأساسية الأخرى وجود بنية تحتية جيدة وإقامة اتصال ثابت مع إدارة الأمراض المتعاونة.
   2. ل في أبحاث الجسم الحي، واستخدام منشأة حيوانية مع ظروف السكن المناسبة للفئران المناعية.
   3. الحصول على إذن بشأن أي بحث على المواد المشتقة من المريض من لجنة أخلاقيات الرعاية الصحية. الحصول على موافقة على أي بحث في الجسم الحي من السلطة المختصة وفقا للوائح القانونية المحلية.

2. عينة جمع

1. اليوم السابق للجراحة
   1. تقييم جميع المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم القابل للاستئصال أو البنكرياس و / أو الانبثاث المقابلة لأهلية البنوك الحيوية. تجنب تضمين الحالات التي تحتوي على المعالجة المسبقة الجديدة ، أو أورام صغيرة جدًا ، أورام الكرامة غير المؤكدة أو الآفات التي تم استئصالها جزئيًا بالمنظار من قبل.
   2. الحصول على موافقة خطية على المشاركة من المريض خلال مناقشة الموافقة المستنيرة حول الإجراء الجراحي. إبلاغ جميع الجراحين المشاركين في الوقت المناسب، وفريق المختبر وكذلك أخصائي علم الأمراض.
2. 2 - حيازة العينات
   1. إبلاغ جميع المرافقين في غرفة العمليات (OR) عن جمع الأنسجة للبنك الحيوي مباشرة قبل بدء العملية الجراحية.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن الأنسجة يجب أن لا تكون ثابتة في formalin. إذا كانت الأنسجة مغمورة في الفورستين ، يصبح غير مناسب للبنوك الحيوية المتكاملة.
   2. رسم 40 مل من الدم heparinized (2 × 20 mL حقنة) وكذلك معيار 7.5 مل أنبوب المصل مباشرة بعد تحريض التخدير ونقلها بسرعة إلى المختبر لعزل PBL ومعالجة المصل (انظر الخطوة 3-4).
   3. الحصول على عينة مُجَذَّرَة مباشرة من جدول التشغيل، وضعه في حاوية مناسبة وأخذه إلى قسم المرضية. دوِّن نقطة الزمن من الانفصال عن الدورة الدموية، والفرز والوصول إلى علم الأمراض.
      ملاحظة: ينبغي تقييم مدى ملاءمة العينة للعمل المصرفي الحيوي من قبل أخصائي علم الأمراض المتعاون الذي يقوم بتشريح شريحة من الورم والأنسجة غير الخبيثة. لا تُجزِر أي أجزاء من العينة بنفسك مما قد يعرض التقرير المرضي اللاحق للخطر.
   4. ضع كلا القطع في 15 إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين مع 10 إلى 30 مل محلول تخزين الأنسجة (أو DPBS) على الجليد. دوّن وقت الاستلام ونقل العينات فوراً إلى المختبر.
      ملاحظة: يجب إجراء الخطوات البروتوكول التالية 3-6 في خزانة تدفق laminar تحت شروط معقمة صارمة. استخدام جميع السوائل في درجة حرارة الغرفة.

3. معالجة المصل

1. جهاز طرد مركزي أنبوب مصل 7.5 مل في 1128 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي قبل التبريد.
2. Aliquot 1 مل المصل لكل أنبوب في ما قبل المسمى والتبريد تجميد في النيتروجين السائل.

4. عزل PBL بواسطة الطاردة المركزية للتدرج الكثافة

ملاحظة: العمل بالتوازي مع كل من اثنين من الحقن 20 مل.

1. ملء 20 مل من الدم المهترئة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل وإضافة 15 مل من DPBS.
2. تأخذ 15 مل من بانكول مع ماصة المصلية، إدراج ماصة بعناية على طول الطريق إلى الجزء السفلي من أنبوب البولي بروبلين والإفراج عن Pancoll ببطء شديد لتشكيل طبقة تحت العمود الدم / DBPS.
3. جهاز طرد مركزي في 375 × ز لمدة 15 دقيقة بدون الفرامل.
4. التعرق ونقل طبقة مُبَتَدِدة بين العمود الأوسط والعلوى لكلا العينتين إلى أنبوب بولي بروبلين 50 مل جديد وملء مع DPBS إلى 50 مل.
5. جهاز طرد مركزي في 270 × ز لمدة 15 دقيقة مع الفرامل.
6. التعرق والتخلص من افرحة, resuspend بيليه الخلية في 4.5 مل من متوسطة الفريزر.
7. Aliquot 1.5 مل من التعليق لكل أنبوب cryotube، إغلاق الأنابيب بإحكام ووضعها في وعاء تجميد مناسبة لتجميد بطيئة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

5. معالجة الأنسجة

ملاحظة: ابدأ مع توليد عينات متجمدة من الأورام والأنسجة السليمة للحفاظ على سلامة الأحماض النووية.

1. عينة أنسجة الورم
   1. نقل عينة الورم مع عدة مل من محلول تخزين الأنسجة من أنبوب البولي بروبلين إلى طبق بيتري. شطف مع DPBS إذا لزم الأمر. تجنب لمس العينة واستخدام مشرطين معقمة للتعامل مع الأنسجة. تجنب الجفاف في أي وقت.
   2. وزن عينة الورم على مقياس مناسب في طبق منفصل وملاحظة وزن الأنسجة.
   3. تقييم حجم وشكل ونوعية الأنسجة الورم قبل القطع. تهدف إلى الحصول على قطعة واحدة على الأقل حول حجم رأس الدبوس لتجميد المفاجئة وأربعة مكعبات من حوالي 30 ملم³ (طول الحافة 3 × 3 × 3 ملم) لكل من للتبريد الحيوية. توليد أكبر عدد ممكن 30 مم³ مكعبات في أربع مرات ممكن وتوليد قطعة واحدة لالتجميد المفاجئة لكل 5 رباعيات. أيضا أن تأخذ في الاعتبار أن الأجزاء النخرية يجب أن تقطع بحيث تتكون مكعبات من الأنسجة الحيوية فقط.
   4. توليد شرائح من 3 مم سمك. قطع أجزاء نخرية، يمكن تمييزها مثل هلام أو كتلة السائل، وقطع شرائح إلى مكعبات من الأحجام المطلوبة اثنين.
      ملاحظة: لا تتجاهل أي نسيج في هذه المرحلة.
   5. المفاجئة تجميد
      1. التسمية والتبريد وفقا لذلك (انظر الخطوة 7.7).
      2. ضع قطعة نسيج صغيرة واحدة لكل أنبوب التبريد المسمى مسبقًا. غمر العينات على الفور في النيتروجين السائل لعدة دقائق وتخزينها في -80 درجة مئوية في وقت لاحق.
   6. الحفظ بالتبريد للأنسجة الحيوية
      1. تسمية الأنابيب المبردة وفقا لذلك (انظر الخطوة 7.7) وملء كل مع 1.5 مل من متوسطة التجميد. ضع حاوية التجميد بجانب مقاعد البدلاء.
         ملاحظة: اتبع الخطوات التالية بأسرع وقت ممكن. منذ DMSO في المتوسط الفريزر له خصائص السامة للخلايا، وينبغي أن الوقت من الأنسجة التي يجري غمرها في المتوسط الفريزر دون التبريد السليم لا تتجاوز 2 دقيقة.
      2. ترتيب 30 ملم^{مكعبات 3} في رباعية. يشق الأنسجة النخرية ويبقى أخرى على حافة الطبق، ولكن لا تجاهلها.
      3. استخرج المكعبات من شفرة المشرط ونقل 4 مكعبات لكل أنبوب cryotube. تأكد من أن قطع الورم مغمورة بالكامل في متوسط الفريزر. أغلق الأنابيب بإحكام ووضعها في حاوية متجمدة مناسبة للتجميد البطيء وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية.
      4. نقل الأنابيب المبردة إلى نظام تخزين مناسب للتخزين على المدى الطويل عند -140 درجة مئوية أو أقل. الوثائق في نظام إدارة المخزونات المختبرية إلزامية.
2. عينة الأنسجة السليمة: كرر الخطوات 5.1.1. إلى 5.1.6.4 لعينة الأنسجة السليمة.

6. ثقافة الخلية الأساسية

1. تفكيك بقايا نسيج الورم، بما في ذلك الخردة النخرية، في طبق بيتري مع المشرط إلى قطع صغيرة قدر الإمكان.
2. ضع مصفاة الخلايا المعقمة (حجم المسام 100 ميكرومتر) فوق أنبوب بولي بروبلين سعة 50 مل.
3. استخدام ماصة المصلية لإضافة 5-10 مل من DPBS إلى طبق بيتري، تعويم بقايا الأنسجة والماصات صعودا وهبوطا لتوليد تعليق.
4. نقل تعليق مع ماصة إلى مصفاة الخلية.
5. كرر الخطوات 6.3-6.4 حتى يتم حل جميع الأنسجة المتبقية من طبق بيتري.
6. استخدام المكبس من حقنة 20 مل في اتجاه واحد للضغط على تعليق الخلية والأنسجة من خلال مصفاة الخلية.
7. شطف مع 5-10 مل من DPBS الطازجة، والتخلص من مصفاة الخلية وإغلاق الأنبوب بشكل صحيح.
8. الطرد المركزي تعليق في 180 × ز لمدة 5-10 دقيقة.
9. إعداد الكولاجين-I precoated 6 لوحة جيدا مع 1.5 مل من المتوسط في البئر.
10. التعرق وتجاهل المابير. Resuspend بيليه في 3 مل من DPBS أو المتوسطة وإضافة 500 μL من التعليق إلى كل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة (رطوبة 100٪، 5٪ CO₂، 37 درجة مئوية)
11. مراقبة لوحة يوميا لنمو الخلايا والتلوث.
    ملاحظة: لا يتم وصف المزيد من الخلايا زراعة حتى نقطة إنشاء خط خلية دائمة هنا.

7. PDX جيل

1. إجراء تجاربi n vivo فقط من قبل أشخاص مؤهلين بشكل مناسب تلبية متطلبات السلطة المختصة في نطاق اختصاصك.
2. الفئران المناعية المنزلية تحت ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) تلبية متطلبات سلالة الماوس المستخدمة. وتشمل التدابير الصحية أقفاص التهوية بشكل فردي، والطعام المُحمَّل بالمواد، والماء، ومواد التعشيش، فضلاً عن قفل الهواء الآمن وارتداء المعدات الشخصية والواقية.
3. أوتوكلاف جميع الصكوك مسبقا واستخدام مجموعة واحدة فقط من الأدوات لكل حالة الورم لتجنب التلوث المتبادل. التعامل مع أنسجة الورم كما تعفن ممكن. يجب أن تكون جميع العناصر البلاستيكية المذكورة أدناه معقمة، واحدة الاستخدام والتخلص منها بعد كل عملية جراحية.
   ملاحظة: يحددها أسلوب تجميد أربع قطع من نسيج الورم لكل أنبوب تبريد، يتطلب جيل PDX دائماً فئران لكل عينة، مما يؤدي بشكل مثالي إلى أربعة أورام PDX.
4. اختيار الورم الرئيسي المطلوب لengraftment عن طريق نظام إدارة المخزون المختبر ونقل العينة (حيوي الحفاظ على أنسجة الورم) من خزان التخزين الرئيسي لحاوية النيتروجين السائل المحمولة (التخزين الوسيط في -80 درجة مئوية على الجليد الجاف هو أيضا مريحة).
5. وضع على معدات الحماية الشخصية قبل الدخول إلى SPF-القسم (الدعك، القباقيب، المئزر، غطاء الشعر، قناع الجراحية وإفراط الأحذية)، وتطهير يديك وجميع المعدات.
6. ماتريجل تمرغ
   1. إزالة شكل شكل التبريد حاوية النيتروجين السائل، وتنتظر ذوبان العينة.
   2. تسمية أنبوب البولي بروبلين 50 مل وملء مع 35 مل من DPBS.
   3. إمالة التبريد صعودا وهبوطا ونقل المحتوى على الفور إلى أنبوب البولي بروبلين بمجرد أن يمكن تحويلها إلى الأنسجة المتوسطة الخدود. شطف بلطف قطع أنسجة الورم، والتخلص من حجم الرئيسي من أنبوب في وعاء منفصل، وإغلاق الغطاء ووضع أنبوب من الجانب إلى الأسفل، بحيث قطع الأنسجة الأربعة جمع في الغطاء.
   4. ضع طبق بيتري على مركم التبريد ووضع 100 ميكرولتر من ماتريجل كقطيرة واحدة في الوسط. استخدم ملقطًا تشريحية لنقل قطع الورم إلى ماتريجل. تأكد من أن كل قطعة مغطاة تماما مع Matrigel. احتضان لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية.
7. ماوس التخدير (2 الفئران لكل عينة، والعمل في موازاة)
   1. إعداد 3:1- مخزون من الكيتامين (100 ملغ / مل) و xylazine (20 ملغ / مل) محلول مخدر. الجرعة الموصى بها هي 90/6 ملغم / كجم من وزن الجسم.
   2. وزن الماوس ورسم محلول التخدير اللازمة في حقنة الأنسولين استخدام واحد.
   3. وضع الماوس على شبكة القفص، وسحب ذيله بلطف بيد واحدة للحث على حركة إلى الأمام وسرطان البحر في وقت واحد الرقبة مع قبضة قرصة من ناحية أخرى. ارفع فأر الشبكة ودر اليد القابضة، بحيث يعود الحيوان إلى راحة يدك. قم بشل واحدة من الساقين الخلفيتين مع الخنصر الخاص بك وحقن المخدرات intraperitoneally. وضع الماوس مرة أخرى إلى قفصه، وينتظر الحث المخدرات.
   4. ضع الماوس المُغَدَّد على لوحة التسخين واغطي العينين بالمرهم لتجنب ضرر القرنية. يُقس عمق التخدير عن طريق قرص القدم الخلفية للماوس بلطف باستخدام ملقط جراحية.
      ملاحظة: غياب الحركة يشير إلى المخدرات العميقة. أي نوع من الحركة إما يتطلب المزيد من الوقت للوصول إلى عمق المخدرات المطلوب أو جرعة إضافية من التخدير.
8. إجراء جراحي
   1. شكل أضعاف الجلد عن طريق معسر عنق الماوس وحقن رقاقة تحت الجلد مع قضيب (انظر الخطوة 9 لتفاصيل البرمجة)
   2. حلق أجنحة الماوس إذا لزم الأمر (NMRI^{nu / nu} الفئران لا تتطلب الحلاقة)، وتطبيق povidone اليود مع مسحة القطن واستخدام الستائر الجراحية لإنشاء حقل معقمة.
   3. رفع الجلد من الجناح مع ملقط الجراحية، وجعل شق صغير من حوالي 4 ملم وتشكيل جيب تحت الجلد الصغيرة عن طريق إعداد صريح مع مقص.
   4. ضع قطعة ورم واحدة في كل جيب وضعه في النهاية الخلفية.
   5. قص نهاية 100 ميكرولتر ماصة تلميح وpirate Matrigel المتبقية من طبق بيتري وتطبيقه على قدم المساواة في كل جيب الجلد.
   6. أغلق الجروح بخيوط بسيطة متقطعة وطبق صلصة الرش.
9. مسح رقاقة والتحقق من صحة الماوس والورم معرف.
10. إعداد قفص جديد مع الفراش الطازج والمواد التعشيش، فضلا عن عصا القضم. أضعاف "وسادة" من المناشف الورقية ووضع أسفل الماوس مع رأس مرتفعة تحت مصباح الحرارة الأشعة تحت الحمراء.
11. مزيج 0.25 مل من تريميتهوبريم/سلفاميثوكسيزول (400 ملغ/80 ملغ) مع 100 مل من مياه الشرب، وتدار عن طريق زجاجة الشرب. ضع في اعتبارك أن فأرًا واحدًا يستهلك حوالي 150 مل لكل كيلوغرام من وزن الجسم يوميًا.
    ملاحظة: منذ لا يرتبط نموذج PDX تحت الجلد مع الألم بعد الجراحة، لا أثناء عملية التئام الجروح، ولا أثناء نمو الورم، لا يلزم المسكنات بعد الجراحة. يرجى ملاحظة أن المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان من مؤسستك / السلطة قد تختلف.
12. رصد الحيوانات التجريبية
    1. مراقبة الفئران يوميا لعلامات الضيق. ويمكن تفويض هذا إلى مقدمي الرعاية الحيوانية المؤهلين.
    2. الحفاظ على العلاج بالمضادات الحيوية بعد الجراحة مع الجرعة المذكورة أعلاه لمدة 4 أسابيع. يُستعاض عن خليط المضادات الحيوية مرتين في الأسبوع.
    3. قياس حجم الورم مرة واحدة على الأقل في الأسبوع، من الناحية المثالية يوميا، مع الفرجر (حجم الورم = 0.52 × الطول × العرض × ارتفاع x [مم^3])وسجل في قاعدة البيانات.

8. PDX الحصاد والتجهيز

1. حصاد ومعالجة الورم PDX، عندما:
   يصل حجم الورم إلى الحجم المستهدف من 1.500 مم^3.
   الورم الذي يحمل الحيوان يظهر علامات الضيق و / أو المرض والعلاج غير مجدية.
   الورم يصبح تقرح أو تخترق الجلد من الفأر.
2. قراءة رقاقة لتحديد PDX الصحيح.
3. القتل الرحيم الماوس عن طريق طريقة قانونية (اعتمادا على المبادئ التوجيهية الوطنية) على سبيل المثال CO₂-الاختناق أو حقن الكيتامين / xylazine تليها خلع عنق الرحم.
4. ارفع الجلد باستخدام ملقط جراحي على الجناحين و اِنزع مقص Metzenbaum على بعد بضعة ملليمترات من الورم.
5. فصل الجلد فوق الورم عن طريق إعداد حادة، ثم فهم بعناية الورم مع ملقط التشريحية وفصل الورم من اللفافة السطحية للجسم.
6. شطف الورم مع DPBS، ووضعها في طبق بيتري وإزالة النسيج الضام المجاورة.
7. عند هذه النقطة، تنفيذ أحد ما يلي:
   1. قطع 30 مم³ مكعبات وإنشاء PDX جديدة (تابع مع بروتوكول في نقطة 7.7.4).
   2. قطع الورم إلى شرائح، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى كاسيتات علم الأنسجة والحفاظ عليها في الفورمالديهايد 4٪ لتضمين البارافين في وقت لاحق.
   3. الحفاظ على الورم في أنبوب مع محلول تخزين الأنسجة لإضافته إلى البنك الحيوي (المضي قدما مع بروتوكول في الخطوة 3.) و / أو إنشاء خطوط الخلايا المشتقة من PDX (المضي قدما مع بروتوكول في الخطوة 4.)

9- البنك الحيوي وإدارة البيانات

1. تعيين معرف داخلي لكل حالة ورم وفقا للجدول 1.

الجدول 1: تعريف معرف العينة.

2. تخزين موافقة المريض في شكل إلكتروني وورقي مع الورم-ID.
3. جمع أكبر قدر ممكن من البيانات السريرية وتخزينها مجهولة المصدر وبشكل منفصل.
4. استخدام برنامج إدارة البيانات (على سبيل المثال، Freezerworks) أو غيرها، وإنشاء واجهة مع برنامج طباعة التسمية لتوليد مقاومة للحرارة، وتسميات رمز شريطية ذاتية التمسك.
5. إضافة عينة جديدة عن طريق فتح برنامج إدارة البيانات، وتحديد نوع العينة وتسجيل المعلومات التالية: معرف الورم، ونوع الأنسجة، طريقة التجميد، والتاريخ، موظف مسؤول، رقم مرور، معرف الماوس وسلالة الماوس.
6. تعيين العينات إلى مواقع محددة في خزان التخزين.
7. تتبع ورصد PDX (ينطبق على الخطوة 7-8)
   1. استخدم قاعدة بيانات MS Access (أو نظام مماثل) على جهاز محمول مزود بتقنية البلوتوث (كمبيوتر محمول أو قرص) لتسجيل معرف الورم وتاريخ الزرع وتاريخ القتل الرحيم وعصر الماوس والإجهاد بالإضافة إلى نمو الورم بمرور الوقت.
   2. قم بتوصيل قارئ الرقائق الدقيقة بالجهاز وقراءة الرقاقة قبل الزرع.
   3. تعيين معرف معين لكل ماوس؛ نستخدم النظام التالي:(انظر الجدول 2 أدناه)
   4. بعد الزرع، سجل المعرف مع خصائص الماوس في قاعدة البيانات.
   5. إعادة قراءة رقاقة والتحقق، إذا كانت مواصفات رقاقة، قاعدة البيانات وتسمية والتبريد متسقة.
   6. إنشاء تسمية لكل قفص الماوس وفقا لذلك.
      ملاحظة: لإنشاء نسخة احتياطية فعلية، قم بلصق تسميات الـ cryotube مع تسميات الرقائق الدقيقة المقابلة في كتيب وتاريخ الملاحظات وسلالة الماوس.
   7. لرصد نمو الورم من PDX الفردية، مسح رقاقة من الماوس مع القارئ متصلا جهاز قاعدة البيانات لتحديد وتسجيل حجم الورم تقاس الفرجار كل أسبوع.
   8. تخطيط نقطة زمنية مثالية من حصاد PDX من خلال تحليل منحنى نمو الورم.

الجدول 2: تعريف معرف PDX.

في أيدينا ، كان معدل إنشاء الثقافات الخلية الأولية (الشكل 2A و B) 12.9 ٪ في سلسلة كبيرة9. فشلت غالبية المحاولات لعزل الخلايا السرطانية القابلة للتوسع من العينات الجراحية الطازجة التي تم استئصالها بسبب عدم وجود نمو أو تلوث مبكر. واعتبر إنشاء خط الخلية ناجحة بعد 3 ممرات مع نمو مطرد في ظل ظروف الثقافة القياسية (DMEM، 10٪ FCS، وعاء الثقافة القياسية) والتحقق من التمايز الظهارية عن طريق FACS-التحليل10. وأظهرت خطوط الخلية المستمدة من أورام PDX (الشكل 2C و D) ارتفاع معدل إنشاء 23.6 ٪ والذي يرجع أيضا إلى إمكانية تكرار محاولات على النقيض من الأورام الأولية9. ومع ذلك، لا يمكن تحرير بعض الثقافات المختلطة(الشكل 2E)من النمو الليفي أو حتى فقدت بسبب فرط النمو الليفي(الشكل 2F).

الشكل 2: ثقافة الخلية. خطوط الخلايا السرطانية الأولية، المستمدة من الانبثاث من حالة سرطان القولون HROC313، مرور 21 (A) وسرطان البنكرياس HROP88، مرور 5 (ب). خطوط الخلايا السرطانية المشتقة من PDX من القولون PDX HROC285 T0 M2 (D) والبنكرياس PDX HROP10 T5 M2، مرور 4 (E). ثقافة مختلطة من الخلايا الليفية والخلايا السرطانية من سرطان البنكرياس HROP75، مرور 8 (C) والإفراط في النمو الليفي (F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النظر في التغييرات في بروتوكول توليد PDX ، سلالات الماوس المستخدمة وكذلك المجربين على مدى عدة سنوات ، فضلا عن اختلافات كبيرة في كمية أنسجة الورم المتاحة لengraftment ، فإنه ليس من تافهة لإعطاء معدل النجاح الشامل من توليد PDX. في سلسلة حديثة جدا من تجارب توليد PDX التي يقوم بها اثنين من الباحثين (S.M. و F.B. ) ، لوحظت معدلات نمو أولية بنسبة 63٪ لـ PDX القولون والمستقيم (يمكن تصوير الأنسجة المثالية من الشكل 3A)و 48٪ لـ PDX البنكرياس(الشكل 3B). إن نمو الورم اللمفاوي أو الأورام اللمفاوية البشرية في موقع الزرع نادر نسبيًا ، ولكن يمكن أن يحاكي نمو PDX الناجح(الشكل 3C). وبصرف النظر عن الفحص الهدولوجي، تم تأكيد التوافق بين نماذج PDX ومرضى المتبرعين بها بانتظام من خلال تحليل التكرار القصير (STR)(الشكل 3D). حتى يومنا هذا يضم البنك الحيوي >50 الابتدائي >50 مستقيم الثانوية, 3 الابتدائي و 6 الثانوية خطوط خلايا سرطان البنكرياس وكذلك >150 القولون والمستقيم و 19 نماذج PDX البنكرياس.

الشكل 3: المقارنة النسيجية التمثيلية لمستقيم (A) والبنكرياس PDX (B). سرطان الغدد الليمفاوية البشرية في موقع زرع تقليد خارج PDX (C). اختبار الهوية الوراثية لنموذج PDX (HROC430 T1 M2) إلى أنسجة الورم الأصلي المريض (HROC430Tu) عن طريق تحليل تكرار الترادف القصير (STR). مقارنة بين تسع عمليات Loci STR، vWA، THO1، TPOX، CSF1 PO (صبغة FAM) وD5S818، D13S317، D7S820، D16S539 (صبغة HEX) باستخدام متعدد PCR مع الأضواء الأولية ذات التسمية الفلورية بعد تأكيد التطابق الجيني للـ PDX والورم المانح (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اي.