Method Article

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

DOI:

10.3791/62068

⸱

July 1st, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هنا بروتوكول الحقن المجهري للأجنة Helicoverpa armigera (Hübner) وتحديد الطفرات بالضربة القاضية التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. تتيح الحشرات الطافرة إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دودة القطن ، Helicoverpa armigera ، هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في العالم. مزيج من علم الوراثة الجزيئية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وعلم الجينوم الوظيفي ، والدراسات السلوكية جعلت H. armigera نوعا نموذجيا في Lepidoptera Noctuidae. لدراسة وظائف الجينات المختلفة والتفاعلات بين الجينات المختلفة في الجسم الحي ، تعد تقنية تحرير الجينوم المجمعة بانتظام (CRISPR) / البروتين المرتبط بها 9 (Cas9) طريقة مريحة وفعالة تستخدم لإجراء دراسات جينومية وظيفية. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة منهجية خطوة بخطوة لإكمال الضربة القاضية للجين في H. armigera باستخدام نظام CRISPR / Cas9. يتم وصف تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) بالتفصيل. بعد ذلك ، يتم تلخيص الخطوات اللاحقة التي تتكون من تصميم تمهيدي خاص بالجينات لإنشاء الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA) ، وجمع الأجنة ، والحقن المجهري ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات. وأخيرا، يتم تقديم المشورة والملاحظات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين كفاءة تحرير الجينات. ستكون طريقتنا بمثابة مرجع لتطبيق تحرير جينوم CRISPR / Cas9 في H. armigera بالإضافة إلى عث Lepidopteran الآخر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر تطبيق تكنولوجيا تحرير الجينوم أداة فعالة لتحقيق طفرات الجينات المستهدفة في الأنواع المتنوعة. يوفر ظهور نظام التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام (CRISPR)/البروتين المرتبط به 9 (Cas9) طريقة جديدة للتعامل مع الجينوم1. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) و Cas9 endonuclease2,3، في حين يمكن تقسيم الحمض النووي الريبي للحمض النووي الريبي (gRNA) إلى قسمين، الحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA) والحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA). يتكامل الحمض النووي الريبي مع إندونوكلياز كاس9 ويشكل البروتين الريبي النووي (RNP). مع الحمض النووي الريبو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم الاشعال الخاصة بالجينات وإعداد sgRNA

  1. التحقق من المنطقة الجينومية المحفوظة في الجين محل الاهتمام من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليلات التسلسل. تضخيم الجين المستهدف من الحمض النووي الجينوم ل H. armigera وتمييز الإكسونات والإنترونات.
    ملاحظة: خصوصية تسلسل موقع الدليل ضرورية لتجنب تحرير الجينات خارج الهدف. البحث في مواقع الدليل المحتملة في exons قريبة من 5' UTR من الجين. بعد ذلك ، من المهم التأكد من أن الجين غير فعال تماما. يوضح الشكل 1 ملخصا لمسار التدفق لإعداد sgRNA.
  2. اختر أهداف sgRNA. استخدم موقع كريسبر على الإنترنت CRISPOR (الإصدار 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) للبحث....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة للحصول على خطوط الضربة القاضية الجينية ل H. armigera باستخدام تقنية CRISPR / Cas9. يتم تلخيص النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول لاختيار الحمض النووي ، وجمع الأجنة وحقنها ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات.

في هذه الدراسة ، كان الموقع المستهدف لجيننا محل اهتمامنا موجودا في إكسون الثاني (الشكل 2A). تم الحفاظ على هذا الموقع بشكل كبير .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفر تطبيق نظام كريسبر/كاس9 دعما تقنيا قويا لتحليل وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة. يوضح البروتوكول المفصل الذي نقدمه هنا توليد متحور متماثل الزيجوت في H. armigera عبر تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. يوفر هذا الإجراء الموثوق به طريقة مباشرة لتكوين الطفرات الجينية الموجهة في H. armigera.

ويمكن أن يؤثر اختيار المواقع المستهدفة من كريسبر على كفاءة الطفرة37. في هذا البروتوكول ، قمنا بمقارنة وتحليل نتائج متعددة من موقع CRISPOR على الإنترنت للحصو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31725023 ، 31861133019 إلى GW ، و 31171912 إلى CY).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 كيلو بايت سلم الحمض النوويTransGen BiotechBM101
504949تعليمات الدقيقة العالميةللزجاج الشعريباسم "الزجاج الشعري" في البروتوكول
الشريط على الوجهينشركة مينيسوتا للتعدين والتصنيع665
Eppendorf FemtoJet 4i MicroinjectorEppendorf CorporateE5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulatorEppendorf Corporate5192000051
Eppendorf Microloader نصائح الماصةEppendorf CorporateG2835241
GeneArt Precision gRNA SynthesisKit Thermo Fisher ScientificA29377
مجهر شريحةشراع العلامة التجارية7105
أوليمبوس مجهرأوليمبوس كوربوريشنSZX16
PrimeSTAR HS (بريمكس)Takara Biomedical TechnologyR040المستخدمة للكشف عن الطفرات
Sutter Micropipette PullerSutter Instrument CompanyP-1000
TIANamp Genomic DNA KitTIANGEN CorporateDP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36499
يشار إلى ال

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9 EditingEmbryo MicroinjectionHelicoverpa ArmigeraKnockout Mutant IdentificationGuide RNA DesignGenome EditingMutant DetectionGene Function AnalysisAgarose Gel ElectrophoresisGenomic DNA Extraction

Related Articles