يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الماوس لالتهاب البنكرياس المزمن عن طريق ضخ القناة الصفراوية TNBS

3.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

فبراير 28, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

التهاب البنكرياس المزمن (CP) هو مرض يتميز بالتهاب وتليف البنكرياس ، وغالبا ما يرتبط بألم البطن المستعصي. تركز هذه المقالة على صقل هذه التقنية لتوليد نموذج الماوس من CP عن طريق ضخ القناة الصفراوية مع 2,4,6 -حمض الكبريتونيك trinitrobenzene (TNBS).

الملخص

التهاب البنكرياس المزمن (CP) هو مرض معقد ينطوي على التهاب البنكرياس والتليف، وضمور غدي، وآلام في البطن وأعراض أخرى. وقد تم تطوير العديد من نماذج القوارض لدراسة CP، منها القناة الصفراوية 2،4،6 -ترينيتروبنزين حمض الكبريتيك (TNBS) نموذج التسريب يكرر ملامح الألم العصبي ينظر في CP. ومع ذلك ، فإن ضخ المخدرات القناة الصفراوية في الفئران يشكل تحديا من الناحية الفنية. يوضح هذا البروتوكول إجراء ضخ TNBS القناة الصفراوية لتوليد نموذج الماوس CP. تم غرس TNBS في البنكرياس من خلال أمبولة فاتر في الاثني عشر. هذا البروتوكول الأمثل حجم الدواء والتقنيات الجراحية، والتعامل مع المخدرات أثناء الإجراء. أظهرت الفئران المعالجة TNBS ملامح CP كما ينعكس من خلال انخفاض وزن الجسم والبنكرياس، والتغيرات في السلوكيات المرتبطة بالألم، ومورفولوجيا البنكرياس غير طبيعية. مع هذه التحسينات، كانت الوفيات المرتبطة بحقن TNBS ضئيلة. هذا الإجراء ليس فقط حاسمة في توليد نماذج أمراض البنكرياس ولكن أيضا مفيدة في تسليم المخدرات البنكرياس المحلية.

المقدمة

التهاب البنكرياس المزمن (CP) هو مرض التهابي مزمن يتميز بضمور البنكرياس والتليف وآلام البطن وفقدان وظائف الغدد الصماء والغدد الصماء في نهاية المطاف1. العلاجات الطبية والجراحية الحالية ليست علاجية ولكن يتم إجراؤها لتخفيف الأعراض التي هي نتيجة للمرض: آلام البطن الانكسارية، الغدد الصماء والخلل في الغدد الصماء. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى علاجات أكثر فعالية2. نماذج الحيوان توفر أداة أساسية لتطوير فهم أفضل للمرض والتحقيق في العلاجات المحتملة3. وقد وضعت نماذج الماوس متعددة لCP، والتي تستخدم عادة cerulein و / أو نماذج الكحول. Cerulein, أوليغوبتيد تحفيز إفراز البنكرياس, وقد ثبت أن استنساخ حث نموذج CP يضم ضمور البنكرياس, تليف, من بين أمور أخرى4. نموذج شائع آخر يستخدم الحقن التسلسلية من ارجينين, التي تنتج قصور الغدد الصماء مماثلة لتلك التي لوحظت في المرضى الإنسان5. CP يمكن أيضا أن يكون الناجم عن ربط قناة البنكرياس كاملة أو جزئية, وكذلك ارتفاع ضغط الدم قناة البنكرياس6,7. على الرغم من تنوع النماذج الحيوانية المتاحة ل CP، لا أحد من هذه النماذج يستنسخ بشكل فعال آلام البطن التي يعاني منها المرضى CP8.

وأظهرت الدراسات السابقة أن حقن البنكرياس المحلية من 2,4,6 -ترينيتروبنزين حمض الكبريتونيك (TNBS) يكرر الألم المستمر التي يعاني منها المرضى CP9,10,11. أظهرت الفئران المعالجة TNBS فرط الحساسية في البطن وزيادة السلوكيات المتعلقة بالألم وكذلك "فرط الحساسية المعمم" للمحفزات المؤلمة ، وهي ظاهرة لوحظت في مرضى CP10. بالإضافة إلى محاكاة الألم CP بدقة ، فإن نموذج TNBS يكرر أيضا السمات المرضية الأخرى للحالة البشرية مثل التليف ، تسلل الخلايا أحادية النووية ، واستبدال الخلايا الأسينارية بالأنسجة الدهنية10،12. ومع ذلك ، فإن ضخ TNBS عبر القناة الصفراوية هو إجراء صعب تقنيا في الفئران التي قد تسبب الوفاة. على حد علمنا، لا يوجد بروتوكول بصري لإظهار كيفية إجراء ضخ القناة الصفراوية. في هذه المقالة، ونحن نظهر الإجراء من ضخ الصفراء duction من TNBS لتوليد نموذج الماوس CP. هذا الإجراء سوف يساعد على توليد نماذج حيوانية قيمة لدراسة CP وأمراض البنكرياس الأخرى ويمكن استخدامها لبث مواد أخرى (مثل الفيروس والخلايا) في البنكرياس13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع الإجراءات بموافقة اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في الجامعة الطبية في كارولينا الجنوبية ومركز رالف جونسون الطبي. تم استخدام الفئران الذكور C57BL/6J بين 8-10 أسابيع من العمر في هذه الدراسة. تم إيواء الفئران تحت دورة داكنة قياسية 12 ضوء / 12 مع libitumaccess الإعلانية إلى الطعام والماء.

1. إعداد حل TNBS للحقن

  1. إعداد الإيثانول 10٪ في 0.9٪ المالحة. حل TNBS الأسهم (انظر جدول المواد)في الإيثانول 10٪ إلى تركيز نهائي من 7.5 مليون متر عن طريق إضافة 7.5 ميكرولتر من TNBS إلى 1 مل من الإيثانول 10٪.
    تحذير: يمثل TNBS خطرا كيميائيا. قم بإعداد المحلول داخل غطاء الدخان واستخدم معدات الحماية الشخصية مثل القفازات والنظارات الواقية ومعطف المختبر لتجنب الاتصال المباشر مع TNBS.
  2. تحميل 50 ميكرولتر من محلول TNBS 0.75٪ في حقنة الأنسولين مع إبرة قياس 31. تحميل 50 ميكرولتر من الإيثانول 10٪ في المالحة في حقنة من نفس حجم السيطرة على السيارة. ضع المحاقن على الثلج واحمها من الضوء حتى الحاجة.

2. إعداد الفأر والجراحة

  1. حلق الشعر من منطقة جراحة البطن.
  2. حقن جرعة وقائية واحدة من مسكن (على سبيل المثال، البوبرينورفين 0.1 ملغم/كغ أي p.) قبل الجراحة.
  3. حث والحفاظ على الماوس تحت التخدير العام مع 1.5-2٪ isoflurane و 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين. تأكيد تخدير عن طريق قرص أصابع وملاحظة الحيوان لعدم وجود رد الفعل.
  4. ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة أثناء الجراحة. تطبيق مرهم البيطرية على كل عين عندما يكون الماوس تحت التخدير.
  5. تطهير موقع الجراحة عن طريق مسح المنطقة الجراحية 3x مع اليود 2٪، تليها 70٪ الكحول(جدول المواد).
  6. إجراء عملية استئصال البطن مع مقص صغير لتوليد شق 0.5-1 سم.
  7. بلطف فضح الاثني عشر وتحديد موقع القناة الصفراوية المشتركة باستخدام مسحات القطن (جدول المواد).
  8. ضع مقطع الهيمو الصغير المستقيم(جدول المواد)على القناة المشتركة القريبة لمنع تدفق TNBS أو حلول السيارة إلى الكبد والمرارة (الشكل 1A، B).
  9. فضح بلطف الاثني عشر وإدراج الإبرة في قناة البنكرياس من خلال الحليمة من فاتر.
  10. مرة واحدة الإبرة داخل القناة، ووضع مقطع الهيمو الصغيرة المنحنية (جدول المواد) على الاثني عشر المحيطة الإبرة(الشكل 1A)لتأمين الإبرة في مكان ومنع الحل عن طريق الحقن من دخول الاثني عشر.
  11. غرس تدريجيا الحل (TNBS أو السيارة) في قناة البنكرياس على مدى دقيقة واحدة.
    ملاحظة: يجب أن يتم غرس TNBS ببطء على مدى دقيقة واحدة من الوقت ، ومن السهل التحكم في سرعة التسريب عندما يتم حقن البنكرياس بحقنة الأنسولين بإبرة 5/16 بوصة و 31G. الحفاظ على اليد مستقرة قدر الإمكان لتجنب وخز القناة الصفراوية. إذا تم حقن TNBS بنجاح، قد يكون اللون الأصفر مرئيا داخل البنكرياس.
  12. بعد التسريب، وإزالة بعناية المشبك الدقيق بالقرب من الكبد، ومن ثم إزالة المشبك الصغير عقد الإبرة والثنائي.
  13. إعادة duodenum بعناية إلى موقفها الأصلي.
  14. اترك 0.5 مل من المحلول الملحي الدافئ المعقم (36-37 درجة مئوية) في تجويف البطن قبل الإغلاق ، لمساعدة الاثني عشر على العودة إلى وضعه الأصلي والمساعدة في تعافي التمعج.
  15. أغلق الشق في طبقة العضلات باستخدام خياطة مستمرة مع غرزة 5-0. أغلق الجلد باستخدام خياطة متقطعة مع غرزة 4-0.
  16. ضع القفص الذي يحتوي على الفئران على وسادة التدفئة للسماح بالشفاء من التخدير.
  17. تأكد من أن الفئران دافئة وقادرة على الحركة التلقائية قبل إعادتها إلى غرفة الاحتجاز.
  18. الاستمرار في توفير مسكن (على سبيل المثال، البوبرينورفين 0.1 ملغم/كغ i.p.) كل 12 ساعة والحرارة التكميلية لمدة 48 ساعة بعد الجراحة.

3. مراقبة سلوك الماوس

  1. إزالة الغرز في اليوم 7 بعد الجراحة.
  2. مراقبة صحة الفأر وسلوكه يوميا خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. احترس من علامات الضيق مثل النطق أو وضعية الظهر المنحنية أو انخفاض الحركة. قياس وزن الجسم كل يومين.
  3. استخدام فون فراي monofilaments (VFFs) لقياس فرط الحساسية الميكانيكية في البطن قبل, و 2, 3 أسابيع بعد الجراحة كما هو موضح9,14.
    1. تطبيق VFFs من مختلف القوى المطبقة في ترتيب تصاعدي لمنطقة البطن العليا 10x كل 1-2 ق. النظر في رفع، تراجع، أو لعق البطن (استجابة الانسحاب) كاستجابة إيجابية.
    2. تطبيق حافز أقوى إذا لم يتم ملاحظة استجابة إيجابية، وتحفيز أضعف إذا لوحظت استجابة إيجابية. عتبة الانسحاب هي القوة التي يستجيب الماوس 50٪ من الوقت.

4. جمع وتحليل النسيجية من أنسجة البنكرياس

  1. التضحية الفئران تحت التخدير عن طريق خلع عنق الرحم، وتشريح البنكرياس بعناية من الأمعاء والأعضاء الأخرى.
  2. إصلاح البنكرياس في 10٪ paraformaldehyde لمدة 24 ساعة، تضمين في البارافين، وقطع أقسام الأنسجة من سمك 5 ميكرومتر، ووضعها على الشرائح الزجاجية لتلطيخ.
  3. أداء hematoxylin-eosin، وتلطيخ ثلاثي الألوان ماسون باستخدام الأساليب القياسية كما ذكرت سابقا4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تحسين إجراءات ضخ القناة الصفراوية للحد من وفيات الفئران المرتبطة بهذا الإجراء10. تم إعطاء TNBS لأول مرة في حجم إجمالي قدره 35 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر. حقن TNBS في حجم 50 ميكرولتر يمكن أن تصل إلى البنكرياس كله والحث على النمط الظاهري مرض أكثر تجانسا (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لحقن TNBS باستخدام حقنة الأنسولين مع إبرة 31G التحكم بشكل أفضل في سرعة التسريب بالنسبة للمحاقن العادية وأحجام الإبر. كما أسفرت TNBS المعدة حديثا المخزنة على الجليد والمستعملة في غضون س...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ضخ القناة الصفراوية من TNBS للحث على التهاب البنكرياس المزمن يشكل تحديا من الناحية الفنية في الفئران، كما يمكن أن يموت ما يصل إلى 22.5٪ من الفئران في غضون 3-4 أيام من ضخ المخدرات10. هنا، قام هذا التقرير بتنقيح الإجراء استنادا إلى دراسات سابقة وخفض معدل وفيات الفئران المبكرة إلى 10٪ <. على سبيل المثال، يمكن أن يضمن حجم الدواء المتزايد (من 35 ميكرولتر إلى 50μL) وصول الأدوية إلى البنكرياس بأكمله. استخدام حقنة الأنسولين وحجم إبرة أصغر (31G) يقلل من الأضرار المحتملة في قناة البنكرياس وتسرب الصفراء في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن جميع المؤلفين أنهم لا يواجهون تضاربا في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى (VA-ORD BLR&.D Merit I01BX004536)، والمعهد الوطني للصحة منح # 1R01DK105183، DK120394، وDK118529 إلى HW. نشكر الدكتور هونغجو وو على مشاركة الخبرة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ فورمالين محايد مخزن v / vFisher Scientific23426796
وسادات إعداد الكحول ، معقمفيشر Scientific22-363-750
نظام التخدير الحيوانيVetEquip، Inc.901806
بوبرينورفين هيدروكلوريد ، حقنPar Sterile Products ، LLCNDC 42023-179-05
أنابيب الطرد المركزي ، 15 ملفيشر سيانتيفيك0553859A
إيثانول ، مطلق (200 دليل) ، درجة البيولوجياالجزيئية فيشر ScientificBP2818500
مقص تشريح دقيق ناعم للغاية 4 "مستقيم حادRoboz Surgical شركة الصكوكRS-5882
ملقط Graefe 4 "طرف حساس للغايةRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
وسادة ساخنةمن أمازونB07HMKMBKM
حامل إبرة هيجار-بومغارتنر 5.25 بوصةشركة روبوز للأدوات الجراحيةRS-7850
حقنة الأنسولين بإبرةقياس 31 BD324909
وسادات إعداد اليودفيشر Scientific19-027048
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
مشبك صغير يطبق ملقط 5.5 "شركة روبوز للأدوات الجراحيةRS-5410
مشبك مايكرو ، مستقيم قوي منحني 1x6mmRoboz Surgical Instrument Co.RS-5433
مشبك صغير ، مستقيم ، عرض مشبك 0.75 ممRoboz Surgical Instrument Co.RS-5420
محلول حمض بيكريل سلفونيك ، TNBS ، 1M في H2< / sub>OMillipore Sigma92822-1ML
خياطة البولي بروبلين 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
خياطة البولي بروبلين 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
كلوريد الصوديوم ، محلول وريدي 0.9٪VWR2B1322Q
الستارة الجراحية ، كاسيتالأنسجة المعقمة Med-Vet InternationalDR1826
فيشر Scientific22-272416
خيوط فون فرايBiosebEB2-VFF

المراجع

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تسريب القناة الصفراويةتليف البنكرياسالتهاب البنكرياسالألم العصبيضمور البنكرياستقنية جراحيةإيصال الأدوية للبنكرياس
نموذج الماوس لالتهاب البنكرياس المزمن عن طريق ضخ القناة الصفراوية TNBS
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.