مقالة منهجية

التشريح المجهري بالليزر على الأنسجة الجراحية لتحديد التعبير الجيني الشاذ في ضعف التئام الجروح في مرض السكري من النوع 2

DOI:

10.3791/62091

⸱

يناير 13, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Skin Sciences, University of Bradford, 2The Charles Institute of Dermatology, School of Medicine, University College Dublin, 3University of Baghdad

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه التقنية دليلا لإلحاق الجروح خارج الجسم الحي ، وإجراء التشريح الدقيق لالتقاط الليزر وتحديد التغيرات في التعبير الجيني المتعلق بعمليات التئام الجروح السيئة في مرض السكري باستخدام الأنسجة البشرية ذات الصلة سريريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتصاعد الانتشار العالمي لمرض السكري من النوع 2 (T2DM) بمعدل سريع. يعاني المرضى الذين يعانون من T2DM من العديد من المضاعفات وأحدها هو ضعف التئام الجروح. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تطور تقرحات غير قابلة للشفاء أو تقرحات القدم وفي النهاية إلى البتر. في الأفراد الأصحاء ، يتبع التئام الجروح تسلسلا خاضعا للرقابة ومتداخلا من الأحداث التي تشمل الالتهاب والانتشار وإعادة التشكيل. في T2DM ، تصبح واحدة أو أكثر من هذه الخطوات مختلة. تتضمن النماذج الحالية لدراسة ضعف التئام الجروح في T2DM فحوصات الجروح الخدش في المختبر ، أو مكافئات الجلد ، أو النماذج الحيوانية لفحص الآليات الجزيئية التي تدعم التئام الجروح و / أو الخيارات العلاجية المحتملة. ومع ذلك ، فإن هذه لا تلخص بشكل كامل عملية التئام الجروح المعقدة في مرضى T2DM ، كما أن اختبارات الجلد البشري خارج الجسم الحي تمثل مشكلة بسبب أخلاقيات أخذ خزعات مثقبة من المرضى حيث من المعروف أنهم سيتعافون بشكل سيئ. هنا ، يتم وصف تقنية يمكن من خلالها فحص ملامح التعبير للخلايا المحددة المشاركة في استجابة التئام الجروح الوظيفية (dys) في مرضى T2DM باستخدام الأنسجة الفائضة التي يتم التخلص منها بعد البتر أو الجراحة التجميلية الاختيارية. في هذا البروتوكول ، يتم جمع عينات من الجلد المتبرع به ، والجرحى ، والمستنبتة خارج الجسم الحي في واجهة سائل الهواء ، وتثبيتها في نقاط زمنية مختلفة وتقسيمها. يتم عزل أنواع الخلايا المحددة المشاركة في التئام الجروح (على سبيل المثال ، الخلايا الكيراتينية للبشرة ، والخلايا الليفية الجلدية (الحليمية والشبكية) ، والأوعية الدموية) باستخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر والاختلافات في التعبير الجيني التي تم تحليلها عن طريق التسلسل أو المصفوفة الدقيقة ، مع التحقق من صحة الجينات ذات الأهمية بواسطة qPCR. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الاختلافات المتأصلة في التعبير الجيني بين كل من الجلد الضعيف والسليم ، في مرضى السكري أو بدونهم ، باستخدام الأنسجة التي يتم التخلص منها عادة بعد الجراحة. سينتج عنه فهم أكبر للآليات الجزيئية التي تساهم في الجروح المزمنة T2DM وفقدان الأطراف السفلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتزايد معدل الإصابة بمرض السكري من النوع 2 على مستوى العالم ، مدفوعا بوباء السمنة والخمول البدني. يعد ضعف التئام الجروح أمرا شائعا لدى هؤلاء المرضى ، وسيصاب ما يصل إلى 25٪ من المرضى بجرح مزمن غير ملتئم1. الآليات التي يقوم عليها ذلك معقدة وغير مفهومة تماما ، مما يحد من معدل اكتشاف العلاجات الجديدة. أحد العوامل المساهمة في ذلك هو عدم وجود نموذج مناسب لدراسة التئام الجروح لدى مرضى السكري من النوع 2. وبالتالي ، فإن الغرض من هذه الطريقة هو توفير نموذج خارج الجسم الحي ذي صلة من الناحية الفسيولوجية لفحص التئام الجروح لدى المعرضين لخطر الإصابة بالجروح المزمنة ، مما يسمح بتحليل النسخ لإحراز تقدم في تحديد الأهداف العلاجية الجديدة.

هناك العديد من النماذج المتاحة حاليا لدراسة التئام الجروح ، ولكل منها نقاط قوتها وضعفها. في الجسم الحي ، مثل فأر db / db2 أو الفئران السكرية التي يسببها الستربتوزوتوسين3 تستخدم على نطاق واسع ؛ ومع ذلك ، فإن الجروح في نماذج القوارض تلتئم عن طريق الانقباض ، وهو أمر مختلف تماما عن الآلية المستخدمة في جسم الإنسان ، ولها نجاح محدود في الترجمة إلى التجارب السريرية4،5. فوائد استخدام الأنسجة البشرية معترف بهاجيدا 4 ، ولكنها معقدة بسبب أخلاقيات إلحاق الجروح التجريبية بالأفراد المعروفين بالفعل بأنهم يعانون من ضعف استجابة التئام الجروح. وبالتالي ، فإن الدراسات التي أجريت على البشر المصابين بداء السكري موجهة بشكل أكثر شيوعا نحو الاستجابة الالتهابية بدلا من تجربة الأنسجة المستقوصة6. تتوفر أيضا نماذج Organ-on-a-Chip7 والبشرة الاصطناعية8 . هذه لها فائدة في كونها قادرة على تحليل مساهمات الخلايا البشرية ولكنها تعطي القليل من المؤشرات على التباين بين المرضى. وبالتالي ، فإن النماذج ذات الصلة سريريا لدراسة تقدم التئام الجروح لدى المرضى المعرضين للخطر يمكن أن تسرع من الفهم الميكانيكي واكتشاف الأدوية في هذا المجال.

بروتوكول الجرح خارج الجسم الحي الموصوف أدناه مقتبس من Stojadinovic and Tomic-Canic ، 20139. إنه مناسب لفحص بيانات النسخ من الجرح الخاضع للرقابة لعينات الأنسجة البشرية خارج الجسم الحي ويمكن تطبيقه على العينات السريرية من المرضى الذين يعانون من ضعف التئام الجروح (على سبيل المثال ، مرض السكري من النوع 2 ، والأفراد المسنين) ، من أجل تعزيز المعرفة حول كيفية تأثر التئام الجروح في هذه الحالات وربما كيف يمكن استعادته.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد هذا البروتوكول على توفير الأنسجة الجراحية البشرية. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية وموافقة المريض المستنيرة قبل التجربة ، وتتوافق الدراسة مع المبادئ الموضحة في إعلان هلسنكي.

1. جمع الأنسجة وجرح خارج الجسم الحي

  1. اجمع الأنسجة الجراحية بعد بتر / جراحة الأطراف في وعاء معقم يحتوي على وسط النسر المعدل من دولبكو (DMEM) مع 5٪ بنسلين - ستربتومايسين - فطريات ، 2 ملي مولار لجلوتامين و 10٪ مصل بقري جنين (FBS ؛ وسط النمو الكامل).
    ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة التي تم جمعها بهذه الطريقة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل التجريب. لضمان بقاء الأنسجة للتجارب خارج الجسم الحي ، يوصى بمعالجة الأنسجة في أسرع وقت ممكن أو الحفاظ على فجوة زمنية ثابتة بين الجمع والجرح لتوحيد التجارب عبر التبرعات المتعددة بالأنسجة. إذا كان سيتم تخزين الأنسجة لأي فترة زمنية ، فيجب إضافة محلول تثبيت الحمض النووي الريبي إلى العينة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
  2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري 60 مم مملوء بمحلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) مكمل بنسبة 5٪ بنسلين - ستربتومايسين - فطرياتزون. قم بقص الدهون من الأدمة باستخدام مشرط معقم و / أو مقص جراحي وتخلص منه. انقل الأنسجة إلى طبق بتري طازج مليء ب PBS المعقم.
  3. قم بتوصيل شفرتين معقمتين معا بحيث تكون هناك فجوة 1 مم بين الشفرتين. سجل خطين خطيين متوازيين ، ~ 1 مم ، عبر طول البشرة والجزء العلوي من الأدمة الحليمية10،11.
  4. قم بإزالة البشرة بين خطوط النتيجة باستخدام ملقط معقم ومقص جراحي لإنشاء جرح خطي.
  5. استخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة إلى مستطيلات صغيرة (بحد أقصى 1 سم2) تشمل الجرح مع بشرة سليمة على كلا الجانبين.
    ملاحظة: للحفاظ على سلامة الأنسجة والحمض النووي الريبي اللاحق ، يجب إجراء الخطوات 1.2-1.5 في أسرع وقت ممكن.
  6. التقط صورة للأنسجة المصابة باستخدام مجهر التشريح المجهري بتكبير 4 أضعاف ، مما يضمن أن مجال الرؤية يلتقط الجرح بأكمله وأنسجة البشرة السليمة المحيطة.
  7. باستخدام ملقط معقم ، ضع مستطيلات الأنسجة على ملحق مزرعة الأنسجة في صفيحة من 6 آبار وقم بماصة 2 مل من وسط النمو الكامل برفق في البئر. سيضمن ذلك استزراع العينة في واجهة الهواء السائل.
  8. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء لمدة تصل إلى 120 ساعة.
    ملاحظة: يجب تصوير الأنسجة على مجهر التشريح المجهري بنفس التكبير كما في الخطوة 1.6 في نهاية الحضانة. يمكن أيضا التقاط الصور كل 24 ساعة إذا لزم الأمر.

2. تثبيت الأنسجة والاستئصال بالتبريد

  1. قم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. ضع كمية صغيرة من وسط القطع المتوافق مع ناجمد التبريد على ظرف ناظم البرد وقم بتضمين الأنسجة بداخله. قم بتوجيه الأنسجة بشكل عمودي على الظرف بحيث يقطع وجه القطع جميع طبقات الجلد بما في ذلك المنطقة المصابة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. نظف ناظم البرد في درجة حرارة الغرفة باستخدام 70٪ من الإيثانول ورذاذ إزالة التلوث RNase. اضبط درجة حرارة ناظم البرد على -28 درجة مئوية.
  3. تأكد من أن اتجاه الظرف وشفرة التبريد يمكن أن ينتج أقساما تشمل السماكة الكاملة للأنسجة بما في ذلك الأنسجة المصابة والأدمة الأساسية.
  4. باستخدام ناظم البرد ، قم بقص ما يصل إلى عشرة أقسام بحجم 7 ميكرومتر من كل جرح وضعها على شرائح التشريح المجهري الخالية من الحمض النووي الريبي.
  5. قم بتخزين الشرائح في الصندوق الأصلي الذي تم توفير شرائح التشريح الدقيق فيه عند -80 درجة مئوية لضمان بيئة خالية من RNase.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ولكن كن على دراية بأن تدهور الحمض النووي الريبي سيزداد كلما طالت مدة التخزين.

3. التشريح الدقيق لالتقاط الليزر

  1. ضع شرائح التشريح المجهري مع قسم الأنسجة في الثلج الجاف وانتقل إلى غرفة مجهر التشريح المجهري بالليزر.
  2. جففالشريحة 1 بالهواء وانتقل بسرعة إلى تلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين باستخدام مجموعة تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين الخالية من RNase مباشرة قبل إجراء التشريح الدقيق لالتقاط الليزر.
  3. تصور الأنسجة المصابة باستخدام مجهر التشريح المجهري بالليزر بتكبير 10x والتقط صورة لمنطقة الاهتمام التي سيتم التقاطها بالليزر.
  4. تتبع حول تلك المنطقة (على سبيل المثال ، اللسان الظهاري ، والأنسجة الحبيبية ، والأوعية الدقيقة) واجمع في التشريح المجهري 0.5 مل أغطية عزل الناشر باستخدام تعليمات البرنامج للمجهر المعين الذي يتم استخدامه.
  5. أعد تصور وتصوير منطقة الاهتمام التي تم التقاطها بالليزر باستخدام مجهر التشريح المجهري بالليزر بتكبير 10x لتوضيح الموقع والاستئصال الكامل للأنسجة التي تم تشريحها.
    ملاحظة: قم بإجراء التقاط الليزر لكل عينة (حتى 10 أقسام) لمدة أقصاها 1 ساعة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي.
  6. أضف مخزن تخزين الحمض النووي الريبي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة المجهرية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واحفظه في الثلج الجاف حتى يمكن نقله إلى فريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

4. القياس الكمي للتعبير الجيني التفاضلي

  1. الطرد المركزي أنابيب العينة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
  2. عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المجهرية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. قم بتخطيب الحمض النووي الريبي في حجم نهائي يبلغ 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وتضخيم الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تضخيم الحمض النووي الريبي وجهاز التدوير الحراري ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يوصى بجولتين من التضخيم لضمان الحمض النووي الريبي الكافي لمزيد من التحليل. استخدم شروط التضخيم في الجدول 1.
جولة التضخيم الأولىجولة التضخيم الثانية
تخليق الخيط الأولتخليق الخيط الأول
درجدرجة الحرارةالوقتدرجدرجة الحرارةالوقت
165 درجة مئوية5 دقائق165 درجة مئوية5 دقائق
24 درجة مئويةمسك24 درجة مئويةمسك
342 درجة مئوية45 دقيقة325 درجة مئوية10 دقائق
44 درجة مئويةمسك437 درجة مئوية45 دقيقة
537 درجة مئوية20 دقيقة54 درجة مئويةمسك
695 درجة مئوية5 دقائق
74 درجة مئويةمسكتخليق الخيط الثاني
درجدرجة الحرارةالوقت
تخليق الخيط الثاني195 درجة مئوية2 دقيقة
درجدرجة الحرارةالوقت24 درجة مئويةمسك
195 درجة مئوية2 دقيقة337 درجة مئوية15
24 درجة مئويةمسك470 درجة مئوية5 دقائق
325 درجة مئوية5 دقائق54 درجة مئويةمسك
437 درجة مئوية10 دقائق
570 درجة مئوية5 دقائقالنسخ في المختبر
64 درجة مئويةمسكدرجدرجة الحرارةالوقت
142 درجة مئوية6 ساعات
النسخ في المختبر24 درجة مئويةمسك
درجدرجة الحرارةالوقت337 درجة مئوية15 دقيقة
142 درجة مئوية3 ساعات44 درجة مئويةمسك
24 درجة مئويةمسك
337 درجة مئوية15 دقيقة
44 درجة مئويةمسك

الجدول 1: شروط التضخيم.

  1. تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي المضخم. نسب الامتصاص A260 / 230 (النقاء) و A260 / 280 (الملوثات) > 1.8 مناسبة لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المضخم المنقى لدراسات التعبير الجيني المركز (الخطوات 4.5-4.6) أو يمكن إرساله بعيدا لتحليل المصفوفات الدقيقة.
  2. قم بتصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي (كدنا) عالية السعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الشروط التمثيلية هي كما يلي:
    • 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
    • 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة
    • 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    • 4 درجة مئوية عقد
  3. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام 0.5 ميكرولتر من (كدنا) و 1 ميكرومتر بادئات (من الجين المعني) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الشروط التمثيلية والتسلسلات التمهيدية هي كما يلي.
    1. استخدم الشروط التالية لظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 62 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ و 4 درجات مئوية.
    2. استخدم التسلسلات التمهيدية التالية:
      جابد دي إتش
      إلى الأمام 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      عكس 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'

      كيه آر تي 17
      إلى الأمام 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      عكس 5 '-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. تفسير البيانات

  1. احسب معدل التئام الجروح باستخدام صور الأنسجة خارج الجسم الحي التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.6-1.8 باستخدام ImageJ. هناك العديد من المنشورات الحديثة التي تسلط الضوء على الاختلافات المختلفة حول كيفية تحليل مناطق الجرح تلقائيا في ImageJ12،13،14.
  2. حدد التعبير الجيني باستخدام طريقة ΔCT ، ومقارنة دورات العتبة للجين محل الاهتمام مقارنة بتلك الخاصة بمدبرة المنزل (على سبيل المثال ، الجلسرالديهايد -3-فوسفات ؛ GAPDH). للقيام بذلك ، لاحظ قيمة CT لمدبرة المنزل والجين محل الاهتمام.
    1. احسب الفرقبين قيمتي CT لتطبيع كمية mRNA الموجودة والتحكم في الاختلافات في تركيزات استخراج الحمض النووي الريبي بين العزلات المختلفة:
      ΔCT = CT (الجين محل الاهتمام) - CT (مدبرة منزل)
    2. احسب حجم الفرق بين قيم CT لإعطاء القياس الكمي النسبي للجين محل الاهتمام ، معبرا عنه كنسبة مئوية من مدبرة المنزل:
      القياس الكمي النسبي = (2-ΔCT) × 100
    3. افحص الاختلافات بين مختلف المتبرعين / حالات المرض من خلال مقارنة التقديرات الكمية النسبية للجينات ذات الأهمية لكل عينة.
      ملاحظة: يمكن العثور على مخطط للتقنية بأكملها في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا للبروتوكول ، تم اختيار نقطة زمنية مدتها 48 ساعة لتوليد نتائج تمثيلية. يمكن رؤية تكوين الجرح الأولي في الأنسجة الفائضة من الجراحة التجميلية الاختيارية في الشكل 2 أ حيث يكون الجرح المستأصل مرئيا بوضوح. يؤكد تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين أن هذا قد ولد جرحا بسماكة كاملة (الشكل 2 ب). بعد 48 ساعة ، يظهر الإغلاق الجزئي للجرح تحت المجهر الضوئي (الشكل 2 ج). يكشف التلوين النسيجي عن اللسان الظهاري الذي يتقدم لشفاء الجرح (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع زيادة حدوث الاضطرابات المزمنة مثل مرض السكري من النوع 2 على مستوى العالم ، تصبح الحاجة إلى تقنيات يمكن أن تسهل الدراسات ذات الصلة من الناحية الفيزيولوجية المرضية أكثر إلحاحا. يوفر البروتوكول الموصوف أعلاه طريقة موحدة لفحص البيانات النسخية من الجروح خارج الجسم الحي التي تلتئم باستخدام الأنسجة البشرية.

يعتمد هذا البروتوكول على توفير الأنسجة السريرية الفائضة التي تم منح الإذن الأخلاقي لها من السلطة المختصة ، ومن المرضى الذين أعطوا موافقة مستنيرة. عادة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم برنامج المقارنات الدولية من قبل البرنامج الإطاري السابع للبحث والتطوير التقني التابع للمفوضية الأوروبية - شبكات التدريب المبتكرة ماري كوري (ITN) ، اتفاقية المنحة رقم: 607886. تم دعم RW من قبل Aveda ، Hair Innovation & Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية. تم دعم RB و SS من قبل مركز علوم الجلد بجامعة برادفورد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة Arcturus RiboAmp PLUSتضخيم الحمض النووي الريبيKIT0521 ThermoFisher
Scientific أغطية الناشر 0.5 ملMMIK10028161أغطية التشريح الدقيق لالتقاط الليزر ؛ 50 عبوة
Dulbecco s النسر المعدل المتوسط (DMEM)Sigma-AldrichD6046مع 1000 مجم / لتر من الجلوكوز ، L-الجلوتامين ، وبيكربونات الصوديوم ، السائل ، المصفى المعقم ، مناسب لزراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنينيThermo Fisher Scientific10270106مكمل زراعة الخلايا
H& E Staining Kit PlusMMIK10028305طقم تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين الخالي من الرنسيز
طقم النسخ العكسي (cDNA) عالي السعة مجموعة النسخ العكسيللأنظمة الحيويةالتطبيقية 4368814طقم النسخ العكسي
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030149مكمل ثقافة الخلايا
MembraneSlidesMMIK10028153Laer التقاط شرائح التشريح المجهري ؛ 5 لكل صندوق
Netwell Mesh InsertCorning3479إدراج ثقافة الخلايا
Penicillin-Streptomycin-FungizoneThermo Fisher Scientific15070-063مكمل ثقافة الخلايا
15290-026
OCTTissue-Tek Sakura4583متوسط القطع المتوافق مع Cryostat
PBSThermo Fisher Scientific10209252خمسة أقراص لكل 100 مل من الماء المعقم ثم تعقيمها لزراعة الخلايا تستخدم
RNeasy Micro KitQiagen74004طقم استخراج الحمض النووي الريبي
RNase AwaySigma-Aldrich83931RNase رذاذ
شفرات معقمةمستلزمات المختبرات العلميةINS4974أدوات تشريح الأنسجة
دعم الشريحةMMIK10028159الالتقاط بالليزر شريحة الدعم ، مقص جراحي خال من RNase
مستلزمات المختبرات العلميةINS4860تنفيذ تشريح الأنسجة
ملقط جراحيمستلزمات المختبرات العلميةINS2026تنفيذ تشريح
الأنسجة SYBR Green Supermixالأنظمة الحيوية التطبيقية4344463Quantitative PCR mastermix
مجموعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gianino, E., Miller, C., Gilmore, J. Smart Wound Dressings for Diabetic Chronic Wounds. Bioengineering. 5 (3), Basel. (2018).
  2. Song, M., et al. Cryptotanshinone enhances wound healing in type 2 diabetes with modulatory effects on inflammation, angiogenesis and extracellular matrix remodelling. Pharmaceutical Biology. 58 (1), 845-853 (2020).
  3. Liu, J., et al. Involvement of miRNA203 in the proliferation of epidermal stem cells during the process of DM chronic wound healing through Wnt signal pathways. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 348(2020).
  4. Pastar, I., Wong, L. L., Egger, A. N., Tomic-Canic, M. Descriptive vs mechanistic scientific approach to study wound healing and its inhibition: Is there a value of translational research involving human subjects. Experimental Dermatology. 27 (5), 551-562 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Mirza, R. E., Fang, M. M., Weinheimer-Haus, E. M., Ennis, W. J., Koh, T. J. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice. Diabetes. 63 (3), 1103-1114 (2014).
  7. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  8. Yun, Y., Jung, Y. J., Choi, Y. J., Choi, J. S., Cho, Y. W. Artificial skin models for animal-free testing. Journal of Pharmaceutical Investigation. 48, 215-223 (2018).
  9. Stojadinovic, O., Tomic-Canic, M. Human ex vivo wound healing model. Methods in Molecular Biology. 1037, 255-264 (2013).
  10. Castellano-Pellicena, I., et al. Does blue light restore human epidermal barrier function via activation of Opsin during cutaneous wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 51 (4), 370-382 (2019).
  11. Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
  12. Castellano-Pellicena, I., Thornton, M. J. Isolation of epidermal keratinocytes from human skin: The scratch-wound assay for assessment of epidermal keratinocyte migration. Methods in Molecular Biology. 2154, 1-12 (2020).
  13. Suarez-Arnedo, A., et al. An imaje J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS ONE. 15 (7), 0232565(2020).
  14. Venter, C., Niesler, C. U. Rapid quantification of cellular proliferation and migration using ImageJ. Biotechniques. 66 (2), (2019).
  15. Al-Rikabi, A. H. A., Riches-Suman, K., Tobin, D. J., Thornton, M. J. A proinflammatory environment induces changes in the diabetic phenotype of human dermal fibroblasts derived from diabetic and nondiabetic donors: Implications for wound healing. Scientific Reports. , (2020).
  16. Chen, A., et al. Towards single-cell ionomics: a novel micro-scaled method for multi-element analysis of nanogram-sized biological samples. Plant Methods. 16, 31(2020).
  17. Lutz, B. M., Peng, J. Deep profiling of the aggregated proteome in Alzheimer's Disease: from pathology to disease mechanisms. Proteomes. 6 (4), 46(2018).
  18. Rinschen, M. M. Single glomerular proteomics: A novel tool for translational glomerular cell biology. Methods in Cell Biology. 154, 1-14 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة