مقالة منهجية

هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق

DOI:

10.3791/62109

⸱

يوليو 6, 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب التحكم الموثوق في خلايا الثدييات المستجيبة للضوء توحيد الطرق البصرية الوراثية. ولتحقيق هذا الهدف، تحدد هذه الدراسة خط أنابيب لبناء الدوائر الجينية، وهندسة الخلايا، وتشغيل المعدات البصرية الوراثية، واختبارات التحقق لتوحيد دراسة التعبير الجيني الناجم عن الضوء باستخدام دائرة جينية بصرية وراثية سلبية كدراسة حالة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب التحكم الموثوق في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أدوات ذات تغيير عالي في الطية ، وضوضاء منخفضة ، ووظائف نقل محددة من المدخلات إلى المخرجات ، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة. ولتحقيق هذا الهدف، اكتسبت أنظمة التعبير الجيني البصري الوراثي الكثير من الاهتمام على مدى العقد الماضي للتحكم الزماني المكاني في مستويات البروتين في خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن معظم الدوائر الحالية التي تتحكم في التعبير الجيني الناجم عن الضوء تختلف في العمارة، ويتم التعبير عنها من البلازميدات، وتستخدم معدات بصرية وراثية متغيرة، مما يخلق حاجة لاستكشاف توصيف وتوحيد المكونات البصرية الجينية في خطوط الخلايا المستقرة. هنا ، توفر الدراسة خط أنابيب تجريبي لبناء دائرة جينية موثوقة ، والتكامل ، والتوصيف للتحكم في التعبير الجيني المستحث للضوء في خلايا الثدييات ، باستخدام دائرة بصرية وراثية سلبية كمثال على ذلك. توضح البروتوكولات أيضا كيف يمكن لتوحيد المعدات البصرية الوراثية وأنظمة الضوء أن يكشف بشكل موثوق عن ميزات الدائرة الجينية مثل ضوضاء التعبير الجيني وحجم التعبير البروتيني. وأخيرا، قد تكون هذه الورقة مفيدة للمختبرات غير المألوفة في علم البصريات الوراثي الذين يرغبون في اعتماد مثل هذه التكنولوجيا. يجب أن ينطبق خط الأنابيب الموصوف هنا على الدوائر البصرية الجينية الأخرى في خلايا الثدييات ، مما يسمح بتوصيف أكثر موثوقية وتفصيلا والتحكم في التعبير الجيني على مستوى النسخ والبروتيوم والنمط الظاهري في نهاية المطاف في خلايا الثدييات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى غرار التخصصات الهندسية الأخرى، تهدف البيولوجيا التركيبية إلى توحيد البروتوكولات، مما يسمح باستخدام الأدوات ذات الوظائف القابلة للتكرار للغاية لاستكشاف الأسئلة ذات الصلة بالنظم البيولوجية1،2. أحد المجالات في البيولوجيا التركيبية حيث تم بناء العديد من أنظمة التحكم هو مجال تنظيم التعبير الجيني3,4. يمكن أن يستهدف التحكم في التعبير الجيني كلا من مستويات البروتين والتباين (الضوضاء أو معامل التباين ، CV = σ / μ ، مقاسا على أنه الانحراف المعياري عن المتوسط) ، وهي خصائص خلوية حاسمة بسبب أدوارها في الحالات الخلوية الفسيولوجية والمرضية5،6،7،8. تم تصميم العديد من الأنظمة الاصطناعية التي يمكنها التحكم في مستويات البروتين والضوضاء4،9،10،11،12 ، مما يخلق فرصا لتوحيد البروتوكولات عبر الأدوات.

إحدى الأدوات الجديدة التي يمكنها التحكم في شبكات الجينات التي ظهرت مؤخرا هي علم البصريات الوراثي ، مما يتيح استخدام الضوء للتحكم في التعبير الجيني13،14،15،16،17. على غرار سابقاتها الكيميائية، يمكن إدخال دوائر الجينات البصرية الجينية في أي نوع من الخلايا، بدءا من البكتيريا إلى الثدييات، مما يسمح بالتعبير عن أي جين في اتجاه مجرى النهر محل اهتمام18،19. ومع ذلك ، بسبب التوليد السريع للأدوات البصرية الجينية الجديدة ، ظهرت العديد من الأنظمة التي تختلف في بنية الدوائر الجينية ، وآلية التعبير (على سبيل المثال ، التكامل القائم على البلازميد مقابل التكامل الفيروسي) ، ومعدات التحكم في إمدادات الضوء 11،16،20،21،22،23،24،25 . لذلك ، فإن هذا يترك مجالا لتوحيد السمات البصرية الجينية مثل بناء الدوائر الجينية وتحسينها ، وطريقة استخدام النظام (على سبيل المثال ، التكامل مقابل التعبير العابر) ، والأدوات التجريبية المستخدمة في الحث ، وتحليل النتائج.

لإحراز تقدم في توحيد البروتوكولات البصرية الجينية في خلايا الثدييات، يصف هذا البروتوكول خط أنابيب تجريبي لهندسة الأنظمة البصرية الجينية في خلايا الثدييات باستخدام دائرة جينية ذات ردود فعل سلبية (NF) مدمجة في خلايا HEK293 (خط خلايا الكلى الجنينية البشرية) كمثال. NF هو نظام مثالي لإثبات التوحيد القياسي لأنه وفير للغاية26،27،28 في الطبيعة ، مما يسمح بضبط مستويات البروتين وتقليل الضوضاء. باختصار ، يسمح NF بالتحكم الدقيق في التعبير الجيني بواسطة المثبط الذي يقلل من تعبيره بسرعة كافية ، وبالتالي يحد من أي تغيير بعيدا عن الحالة الثابتة. يمكن تغيير الحالة الثابتة بواسطة محفز يعطل أو يزيل المثبط للسماح بمزيد من إنتاج البروتين حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة جديدة لكل تركيز محفز. في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نظام بصري وراثي NF مصمم هندسيا يمكنه إنتاج استجابة ديناميكية واسعة للتعبير الجيني، والحفاظ على ضوضاء منخفضة، والاستجابة للمحفزات الضوئية مما يسمح بإمكانية التحكم في التعبير الجيني المكاني11. هذه الأدوات ، المعروفة باسم الموالفات المستحثة للضوء (LITers) ، مستوحاة من الأنظمة السابقة التي سمحت بالتحكم في التعبير الجيني في الخلايا الحية4،10،29،30 وتم دمجها بشكل ثابت في خطوط الخلايا البشرية لضمان التحكم في التعبير الجيني على المدى الطويل.

هنا، باستخدام LITer كمثال، يتم تحديد بروتوكول لإنشاء دوائر جينية مستجيبة للضوء، وتحفيز التعبير الجيني باستخدام جهاز لوحة الضوء (LPA، وهو جهاز تحريض بصري وراثي)31، وتحليل استجابات خطوط الخلايا المهندسة التي يمكن التحكم فيها بصريا لمحفزات الضوء المخصصة. يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين باستخدام أدوات LITer لأي جين وظيفي يرغبون في استكشافه. ويمكن أيضا تكييفها مع الأنظمة البصرية الجينية الأخرى ذات معماريات الدوائر المتنوعة (على سبيل المثال، ردود الفعل الإيجابية، والتنظيم السلبي، وما إلى ذلك) من خلال دمج الأساليب والمعدات البصرية الوراثية الموضحة أدناه. على غرار بروتوكولات البيولوجيا التركيبية الأخرى ، يمكن تطبيق تسجيلات الفيديو والبروتوكولات البصرية الجينية الموضحة هنا في دراسات الخلية الواحدة في مجالات متنوعة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر بيولوجيا السرطان والتطور الجنيني وتمايز الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم الدوائر الجينية

  1. حدد المكونات الجينية لتتحد في دائرة جينية واحدة / بلازميد واحد (على سبيل المثال ، زخارف تسلسل تكامل الحمض النووي للثدييات 32 ، العناصر المستجيبة للضوء33 ، أو الجينات الوظيفية 34).
  2. باستخدام أي هندسة وراثية و/أو برنامج استنساخ جزيئي، قم بتخزين تسلسلات الحمض النووي لاستخدامها والرجوع إليها لاحقا، والتعليق على كل تسلسل، وفحص جميع الميزات الضرورية (على سبيل المثال، كودونات START، أو التسلسلات التنظيمية، أو المترجمة)35.
  3. تطوير أو اعتماد أجزاء وفقا للتصميم العام للدائرة الجينية36. على سبيل المثال، بالنسبة للمثبطات البصرية الجينية كما هو الحال في LITers11، قم بدمج ترميز تسلسل جيني لمجال قادر على التدهور الناجم عن الضوء37,38 أو تعطيل قدرة ربط الحمض النووي للمثبط39، بجوار الجين المثبط وفي إطاره (على سبيل المثال، TetR)4.
    1. بالنسبة للمنشطات البصرية الوراثية، تأكد من وجود مجال منشط40 يعزز التعبير الجيني عند ربط الحمض النووي الناجم عن الضوء41. بالنسبة للتنظيم التلقائي السلبي أو الإيجابي ، تأكد من وجود موقع ملزم تنظيمي في أو في المنبع لمروج الجين المنظم (على سبيل المثال ، مواقع tetO في أو في المنبع من TetR الذي يعبر عن المروج)42.
  4. تصميم الاشعال لتضخيم تسلسل الحمض النووي أو تسلسل البلازميد باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي لكل دائرة جينية.
  5. التحقق من صحة الاشعال حسابيا لبناء البلازميد من خلال الولائم المدمجة في برامج الاستنساخ الجزيئي (على سبيل المثال ، محاذاة التسلسل).
  6. اطلب أوليغونوكليوتيد الاشعال من الشركة المصنعة. يمكن العثور على البلازميدات التي تم بناؤها واستخدامها في هذا العمل في المواد الداعمة الأصلية11 إلى جانب الاشعال المصممة والمستخدمة.
  7. قم بتخفيف الاشعال إلى تركيز مخزون 100 mM في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  8. قم بتخفيف مخزون الاشعال من 100 mM إلى تركيز 10 mM ل PCR.
  9. قم بإعداد مزيج PCR مع 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب إلى كتلة إجمالية تبلغ 0.5-500 نانوغرام للجينومي أو 0.5 pg-5 ng للبلازميد أو الحمض النووي الفيروسي ، و 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لبوليميراز الحمض النووي 2x (أو الحجم الذي يلبي عامل التخفيف الخاص بالشركة المصنعة) ، و 9.5 ميكرولتر من ddH2O لحجم تفاعل إجمالي قدره 25 ميكرولتر.
  10. احتضان مزيج PCR في جهاز تدوير حراري في الإعدادات المناسبة اعتمادا على الإنزيم المختار43. تتضمن دورات التفاعل المقترحة ما يلي:
    الخطوة 1: دورة واحدة من 30 ثانية خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية.
    الخطوة 2: 40 دورة من 5 ثانية من خطوة تمسخ عند 98 درجة مئوية.
    الخطوة 3: دورة واحدة من 30 ثانية من خطوة التلدين عند 65 درجة مئوية (تحددها الاشعال المصممة مسبقا).
    الخطوة 4: دورة واحدة مدتها دقيقة واحدة من التمديد عند 72 درجة مئوية (~ 1 كيلو قاعدة (kb) طول جزء القالب).
    الخطوة 5: دورة واحدة من تمديد 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    استمر في التفاعل عند 4 درجات مئوية حتى يمكن اختباره عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي. سيختلف هذا البروتوكول اعتمادا على الكواشف المستخدمة (على سبيل المثال ، البوليميراز والمخازن المؤقتة).
  11. كرر الخطوة 1.9 لتضخيم جميع الأجزاء التي سيتم استخدامها في تفاعل تجميع الحمض النووي المطلوب لربط منتجات PCR الخطية بمتجه حمض نووي دائري واحد.
  12. قم بتشغيل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ متبوعا بتنقية الأشرطة ذات الطول المطلوب.
  13. تحضير المزيج الرئيسي لتفاعل تجميع الحمض النووي (الجدول 1).
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم تقسيم المتجه الأم إلى جزأين لزيادة كفاءة خطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل دون التسبب في تغييرات كبيرة في نتيجة التجميع الإجمالية.
  14. احتضان المزيج الرئيسي لتفاعل تجميع الحمض النووي في جهاز تدوير حراري عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (ما لم ينص على خلاف ذلك في بروتوكول كاشف تجميع الحمض النووي) وتخزين التفاعل عند 4 درجات مئوية لاستخدام منتج التفاعل للتحول البكتيري.
  15. إعداد التحول البكتيري (الكيميائي أو الكهربي) باستخدام خلايا الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) المختصة وبروتوكول التحول البكتيري المقابل. بعد التحول، استخدم ألواح أجار لوريا بيرتاني البكتيرية (LB) التي تحتوي على علامة الاختيار البكتيرية المختارة (على سبيل المثال، الأمبيسيلين) لطلاء مزيج التحول. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها44.
  16. تحقق من اللوحات في اليوم التالي. لتلقيح المستعمرات ، اختر مستعمرات فردية من الألواح وأعد تعليقها في مرق LB سائل مع علامة الانتقاء البكتيرية المقابلة في أنابيب الزرع. احتضن في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  17. إجراء بروتوكول تحضير البلازميد لاستخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة البكتيرية.
  18. تحقق من صحة الدائرة في خطوتين. أولا ، قم بإجراء عملية هضم تجريبية باستخدام إنزيمات التقييد كتحقق خام لمعرفة ما إذا كان قد تم الحصول على منتج البلازميد التقريبي. ثانيا ، إذا تم اجتياز / تأكيد اختبار الهضم ، فقم بإرسال البلازميد إلى منشأة تسلسل Sanger (أو العملية باستخدام المعدات المتاحة) للحصول على تسلسل الحمض النووي الدقيق لمقارنته لاحقا بالتسلسل المتوقع في برنامج التصميم.
    1. لإجراء عملية هضم الاختبار، حدد اثنين على الأقل من إنزيمات التقييد التي تنتج جزأين على الأقل، استنادا إلى برنامج الاستنساخ الجزيئي المستخدم. بمجرد اختيار الإنزيمات ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من كل إنزيم ، و 5 ميكرولتر من الحمض النووي المتولد ، و 13 ميكرولتر من الماء مع الأملاح والمخازن المؤقتة المناسبة اعتمادا على الإنزيمات المستخدمة. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، أو كما تقترح الشركة المصنعة للإنزيم. قم بتشغيل منتجات هضم الاختبار على هلام أغاروز بنسبة 1٪ وحدد ما إذا كانت الأشرطة صحيحة.
      ملاحظة: إذا كانت النطاقات صحيحة، فانتقل إلى التسلسل.
    2. لإجراء التسلسل ، قم بإنشاء الاشعال استنادا إلى الحمض النووي المخزن في البرنامج بحيث تكون مناطق التلدين في الاشعال على بعد حوالي 500 نقطة أساس (أزواج قاعدة) وتغطي الجزء محل الاهتمام (مكون الدائرة الجينية) أو البلازميد الكامل. قم بتخفيف الاشعال بالماء النقي الخالي من النوكليز (NF-H2O) إلى تركيز 10 ملليمتر. قم بإعداد عينات التسلسل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي 10 نانوغرام / ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي ، و 8 ميكرولتر من NF-H2O إلى أنبوب 0.2 مل. كرر هذا لكل تمهيدي.
      ملاحظة: عند إعداد العينات، قم بإسقاطها في مرفق التسلسل وقارن النتائج مع تسلسل البلازميد باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي.
  19. في هذه الخطوة ، قم بإنشاء ما يقرب من 100-1000 نانوغرام / ميكرولتر من عينة الحمض النووي لدمج البلازميدات التي تحتوي على دوائر جينية في خط الخلية المناسب.

2. هندسة خط الخلية المستقرة

  1. اطلب خط خلية ثدييات مصمم للتوليد السريع للخطوط الفرعية المستقرة التي تضمن تعبيرا عالي المستوى عن البروتين الذي يثير الاهتمام من متجه تعبير الثدييات. يمكن أن يكون نوع الخلية وسهولة هندسة خط الخلية متغيرين اعتمادا على ما يفضله المستخدمون أو يهدفون إلى تحقيقه.
    1. على سبيل المثال، إذا كان المستخدمون يفضلون هندسة خط الخلايا مع الحد الأدنى من الخطوات الوسيطة، فقم بترتيب الخلايا التي تحتوي على موقع تكامل مستقر واحد (على سبيل المثال، FRT) في موضع جينومي نشط نسخيا. إذا كانت هندسة الخلايا أكثر دقة، فقم بإنشاء مواقع تكامل في المواقع المفضلة باستخدام أدوات الهندسة الوراثية مثل CRISPR/Cas9.
  2. تنمو الخلايا في 5٪ CO2 في الهواء الرطب عند 37 درجة مئوية. اضبط ظروف النمو حسب الحاجة لنوع الخلية.
  3. نقل الدوائر الجينية المصممة أعلاه في الخلايا المطلوبة التي تم الحصول عليها من الخطوات السابقة لبدء عملية توليد خط خلية مستقرة. لتحقيق ذلك ، استخدم خليط الجسيمات الشحمية45 من الحمض النووي للدائرة الجينية مع recombinase المناسب (على سبيل المثال ، Flp-recombinase لإعادة تركيب Flp-FRT) أو من خلال طرق أخرى مثل الكهربية.
  4. بعد يومين من النقل ، قم بتقسيم الخلايا إلى التقاء بنسبة 25٪.
  5. بعد ست ساعات من تقسيم الخلايا ، ابدأ في اختيار المضادات الحيوية عن طريق تبادل الوسائط إلى وسائط جديدة تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من المضاد الحيوي Hygromycin (أو عامل مضاد حيوي آخر يتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية للثدييات الذي تم اختياره أثناء بناء البلازميد).
    ملاحظة: هناك مجموعة متنوعة من جينات مقاومة المضادات الحيوية للثدييات المستخدمة في بناء الدوائر الجينية ، ولكل منها منحنى قتل مختلف. لذلك ، أيا كان جين مقاومة المضادات الحيوية للثدييات الذي يتم اختياره لبناء الدائرة ، يجب دراسة منحنى القتل المناسب في الخلايا ذات الاهتمام. تضمن هذه الخطوة إثراء الخلايا التي تحتوي على حمولة الدائرة الجينية بينما يتم قتل الخلايا التي لا تحتوي على النظام.
  6. اسمح للخلايا بالنمو في وسائط اختيار المضادات الحيوية ، وقم بالتغيير إلى وسائط جديدة كل 2-3 أيام حتى تحتوي اللوحة أو القارورة على بضع عشرات من البؤر. تمر الثقافات الملتصقة عندما تكون في مرحلة السجل قبل أن تصل إلى الالتقاء.
  7. بمجرد وجود العديد من البؤر بما فيه الكفاية ، قم بالتريبسين على الخلايا مع 1 مل من 0.25٪ من التربسين ، و 0.1٪ EDTA في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم لعدة دقائق. تحييد التربسين مع وسائل الإعلام الطازجة وتمرير جميع الخلايا في حاوية جديدة.
  8. بمجرد أن تكون الخلايا الموجودة في الحاوية الطازجة متقاربة بنسبة 80٪ -100٪ ، قم بتجميدها في مزيج من 45٪ من الوسائط القديمة ، و 45٪ من الوسائط الجديدة ، و 10٪ DMSO. انقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب معقم وقم بإجراء فرز أحادي الخلية لعزل الخلايا وحيدة النسيلة في صفيحة من 96 بئرا.
  9. بعد حوالي 2-3 أسابيع من الفرز أحادي النسيلة ، يجب أن تحتوي الآبار داخل لوحة البئر المكونة من 96 بئرا على بؤر. عندما يلتقي حوالي 50٪ -60٪ ، قم بتقسيم الخلايا إلى صفيحة من 12 بئرا.
  10. بمجرد أن تكون اللوحة المكونة من 12 بئرا ملتقية بنسبة 80٪ -100٪ ، تنقسم إلى قارورة T-25 المعالجة بزراعة الأنسجة. بمجرد أن تلتقي الخلايا الموجودة في قارورة T-25 بنسبة 80٪ -100٪ ، قم بتجميد الخلايا والحفاظ على ممر لتوصيف واختبار خطوط الخلايا وحيدة النسيلة.
    1. توصيف خطوط الخلايا وحيدة النسيلة عن طريق الفحص المجهري ومقايسات قياس التدفق الخلوي للإبلاغ عن ملامح التعبير الجيني بناء على إنتاج مراسل الفلورسنت المستحث. تحقق من إنتاج البروتين الوظيفي عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية وفحص التألق المناعي. اختبر تحريض التعبير الجيني على مستوى النسخ عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR). التحقق من صحة التسلسل الجيني ودقة التكامل من خلال تسلسل الجينوم المحلي والكامل للمستنسخات.

3. مقايسات تحريض جهاز لوحة الضوء

  1. بناء جهاز LPA31,46 لاستخدامه في الحث الضوئي للخلايا الهندسية. باختصار ، هناك العديد من الخطوات الواسعة الحاسمة لإنشاء LPA لاستخدامها في التحكم في التعبير الجيني. وتشمل هذه مكونات إطار LPA الطباعة 3D ، وبناء لوحة الدوائر ، وبرمجة الدائرة عبر مبرمج microcontroller ، وتجميع المكونات في LPA النهائي ، وبرمجة بطاقة الذاكرة عبر برنامج IRIS ، ومعايرة الجهاز النهائي. للحصول على شرح أكثر شمولا ، راجع المراجع المذكورة أعلاه.
    1. اطبع الأجزاء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    2. قم بتجميع لوحة الدوائر كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    3. أضف البرنامج الثابت إلى دائرة LPA المجمعة باستخدام مبرمج المتحكم الدقيق كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46.
    4. الجمع بين الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ولوحة الدوائر المجمعة كما هو موضح في Gerhardt et al. (2016 و 2019)31,46. ويشمل ذلك أخذ لوحة التركيب ، ولوحة الدوائر ، وفاصل LED (الثنائيات الباعثة للضوء) ، ومحول اللوحة ، ولوحة 24 بئرا ، وغطاء لوحة ، ومسامير التثبيت ، وصواميل الجناح ومكونات التراص كما هو موضح في الفيديو المصور والشكل 2.
    5. لبرمجة بطاقة الذاكرة ومعايرتها للجهاز، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
  2. استخدم برنامج IRIS المتوفر على موقع مختبر تابور47 لبرمجة بطاقة SD لجهاز لوحة الضوء (LPA)31 واستكشاف ظروف الإضاءة المناسبة اللازمة لبدء تجربة بصرية وراثية.
    ملاحظة: برنامج IRIS هو تطبيق قائم على الويب لبرمجة الأجهزة الإلكترونية البصرية الجينية ، والمعروفة باسم LPA ، التي طورها مختبر تابور. يسمح البرنامج ببرمجة قيم IRIS النسبية التي تتحكم في الثنائيات الفردية الباعثة للضوء (LEDs) في كل بئر من أجهزة LPA.
  3. اختر خيار القائمة المنسدلة LPA (4 × 6)، متبوعا بالنقر فوق نهج الإضاءة المناسب (الحالة الثابتة، الديناميكية، المتقدمة).
    ملاحظة: بالنسبة لهذه المخطوطة، ستركز جميع الفحوصات على أمثلة الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن استخدام أمثلة الإعداد المتقدمة لفترات النبض وأنظمة دورة العمل.
  4. اختر ما إذا كانت مصابيح LED العلوية أو السفلية ستضيء عن طريق إدخال قيم في الخلايا المقابلة لآبار اللوحة. بالنسبة ل LPAs المستخدمة في هذا العمل ، تم استخدام مصابيح LED الزرقاء الموضوعة في الموضع العلوي في جميع التجارب. يمكن لكل مصباح LED ، بمجرد برمجته ، توفير التعرض المستمر للضوء مع شدة ضوء ثابتة. يسمح برنامج IRIS بمستويات كثافة 4096 التي يمكن برمجتها.
  5. بمجرد اختيار مواقع LED ، أدخل قيم الكثافة للمخطط التفصيلي التجريبي المطلوب. على سبيل المثال، أدخل 8 كثافات ضوء مختلفة (أو فترات نبض أو دورات عمل) مع ثلاثة تكرارات تقنية لكل لوحة (الجدول 2). يشير G.s. إلى وحدات التدرج الرمادي - قيم قياس مستوى شدة الضوء المستخدمة في برمجة LPA في برنامج IRIS.
    1. عند تصميم ملفات IRIS التجريبية ، ضع في اعتبارك تأثيرات الحافة من الآبار المجاورة على جهاز LPA ، وسمية الضوء الناتجة عن زيادة شدة التعرض للضوء الأزرق ، وتحديد نوع استجابة الجرعة المطلوبة (على سبيل المثال ، رتيبة مقابل غير أحادية التوتر).
    2. إذا قام المستخدمون ببرمجة الخلايا في LPA بترتيب تصاعدي / تنازلي لمعلمة ضوء معينة (على سبيل المثال ، الكثافة) ، فقد تنتج الآبار تأثيرات حافة من الحديث المتبادل للضوء أو حتى الحرارة التي يمكن أن تؤثر على الآبار المجاورة. هذا يمكن أن يؤثر عن غير قصد على نتائج المخرجات المقاسة عند اكتمال التجارب. للتخفيف من هذا ، يمكن للمستخدمين تنفيذ مصفوفة عشوائية على برنامج IRIS للتدافع على مواقع الآبار ، مما يقلل من تأثيرات الحافة. ويرد وصف مثال على ذلك في النتائج التمثيلية أدناه (الشكل 4 ألف - باء).
    3. وبالإضافة إلى ذلك، وجد أن الكثافة العالية للضوء الأزرق تتداخل مع النمو الخلوي وقابلية البقاء48. لذلك ، للتخفيف من سمية الضوء ، من المهم إنتاج منحنى استجابة شدة الضوء أو مدة النبض أو دورة العمل اعتمادا على الطريقة التي يتم التحقيق فيها.
      1. على سبيل المثال ، برنامج 8 قيم شدة الضوء مع ثلاثة تكرارات لكل لوحة 24 بئر ، مع نطاق من عدم وجود ضوء إلى أقصى كثافة ل LPA. بعد ذلك ، قم بتشغيل هذه العينات على مقياس تدفق خلوي مع بوابة SSC-FSC أو بقعة حية مثل يوديد البروبيديوم لتحديد بقاء الخلايا السكانية (الخلايا الحية مقارنة بإجمالي الأحداث بما في ذلك الخلايا الميتة / الحطام الخلوي) في كل قيمة ضوء.
      2. بعد ذلك ، حدد الكمية المثالية لبقاء السكان على قيد الحياة للإعداد التجريبي ، لأن أي حافز قد يؤثر سلبا على الانتشار أو التعبير الجيني أو البقاء على قيد الحياة (على سبيل المثال ، تحديد بقاء 80٪ من الخلايا كمقايضة مناسبة). على سبيل المثال ، في هذا العمل ، بمجرد معايرته ، لم تتجاوز الكثافة 3000 وحدة جم (~ 3/4 الحد الأقصى لكثافة جهاز LPA). ويرد مثال على ذلك في النتائج التمثيلية أدناه.
    4. بالإضافة إلى تقييد قيم الضوء بسبب السمية ، قد يرغب المستخدمون في تقييد قيم الضوء لتوصيف جزء معين من استجابة الجرعة ، مثل نطاق الاستجابة الرتيبة.
      1. ولتحقيق ذلك، قم في البداية بمسح مجموعة واسعة من شدة الضوء أو فترات النبض أو دورات العمل اعتمادا على الطريقة التي يتم تحليلها عند تحديد استجابة الجرعة المطلوبة (الجدول 2) لتضييق نطاق نظام الضوء محل الاهتمام، على سبيل المثال، حيث يرتبط التعبير الجيني بشكل إيجابي مع زيادة قيم الضوء لاستجابة الجرعة الرتيبة.
      2. لتحديد نطاق الضوء محل الاهتمام ، قم ببرمجة LPA واحد مع ما يصل إلى 24 بئرا ذات كثافة مختلفة / مدة النبض / دورة العمل / إلخ أو المزيد من الآبار (على سبيل المثال ، 48 ، 72 ، 96 ، إلخ) اعتمادا على ما إذا كانت LPAs متعددة معايرة لتقديم كميات ضوئية مكافئة والمضي قدما في عمل أو فحوصات زراعة الخلايا الموضحة أدناه. لذلك ، ابدأ في توصيف نظام بصري وراثي مع مجموعة واسعة من جرعة المحفزات الضوئية لتحديد الفاصل الزمني للنطاق الذي يعطي التعبير الجيني المطلوب ومن ثم إجراء تجارب في نطاق الجرعة المكررة هذا.
      3. على سبيل المثال ، في هذا العمل ، مرة واحدة تم تحديد وحدات 3000 g.s. كعتبة لشدة الضوء السام ؛ تم استخدام هذه العتبة كحد أعلى للضوء للمقايسات الموضحة أدناه (على سبيل المثال ، التألق المناعي).
        ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه مستقلة عن المعايرة البصرية ل LPA وتشير إلى معايرة على المستوى الجزيئي لكل نظام بصري وراثي.
  6. بمجرد برمجة قيم شدة الضوء المناسبة في IRIS، أدخل بطاقة ذاكرة مزودة بمنفذ USB 3.0 في LPA لتنزيل الملفات ونقلها.
  7. إذا اكتملت معايرة LPA31 ، فانتقل إلى عمل زراعة الخلايا لبدء فحص تحريض الضوء. إذا لم يتم إجراء المعايرة، فقم بمعايرة LPA باستخدام طريقة تحليل الصور (الخطوات 3.7.1-3.7.3) بمجرد برمجة LPA باستخدام مبرمج المتحكم الدقيق.
    1. برمجة LPA لفترة وجيزة للحصول على نفس مستوى IRIS كما هو موضح من قبل Gerhardt et al. (2016)31.
      ملاحظة: بالنسبة للمعايرة، تمت برمجة LPA بحيث تبلغ قيمتها 2000 غرام.
    2. بمجرد برمجة الجهاز باستخدام بطاقة الذاكرة والضغط على زر إعادة الضبط (الزر الفعلي على LPA) ، احصل على صورة للجهاز بأكمله (على سبيل المثال ، جهاز تصوير محطة الهلام ، جهاز الماسح الضوئي ، إلخ). للمعايرة، احصل على صورتين مع تدوير الجهاز بمقدار 180 درجة.
    3. ثم ، استخدم برنامجا مفتوح المصدر صممه Gerhardt et al. (2016)31 لإظهار التباين في كثافة LED على لوحة LPA وحساب قيم تعويض LED لجعل الكثافة متساوية عبر الآبار. ويرد مثال على ذلك في النتائج الممثلة أدناه (الشكل 3). بمجرد اكتمال هذه المعايرة ، انتقل إلى عمل زراعة الخلايا لبدء فحص تحريض الضوء.
  8. احصل على قوارير من الخلايا وحيدة النسيلة المهندسة من القسم السابق للتحقيق في تأثيرات الحث الضوئي على التعبير الجيني.
  9. قم بإزالة الوسائط القديمة من القارورة.
  10. أضف 1 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضنها لمدة 5 دقائق.
  11. بعد 5 دقائق ، قم بتحييد التربسين بإضافة 4 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM أو الوسائط الأخرى المرغوبة) المكملة بالمواد الكيميائية الضرورية (استخدم هذا العمل 50 ميكروغرام / مل من الهيغروميسين ، محلول البنسلين / الستربتومايسين 10٪ ، مصل البقر الجنيني ، FBS).
  12. أضف ~ 75000 خلية لكل بئر في صفيحة سوداء مكونة من 24 بئرا بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. يمكن أن يختلف عدد الخلايا المصنفة اعتمادا على مدة التجربة المطلوبة ونوع الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، لاحظ أن كثافة بذر الخلايا تؤثر على الحفاظ على الثقافة وربما على مدة التجربة. إن البدء من عدد أقل من الخلايا لكل بئر يضمن فترات زمنية أطول قبل أن تصل الثقافة إلى التقاء. وعلاوة على ذلك، فإن نوع المكونات البصرية الجينية المدمجة في الدوائر الجينية ذات الأهمية سيؤثر عندما يصل التعبير الجيني إلى حالة ثابتة، وبالتالي يؤثر على مدة التجارب. العوامل الأخرى التي يمكن أخذها في الاعتبار هي معدلات النمو الخاصة بخط الخلية ، وتكوين الوسائط ، وتأثيرات النمو المشروطة (أي الضوء).
  13. بعد الطلاء ، ضع الخلايا في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 للسماح لها بالاستقرار لمدة 2-6 ساعات.
  14. بعد الحضانة ، انقل الخلايا إلى غطاء زراعة الأنسجة ، وقم بإزالة الغطاء البلاستيكي ، وأضف شريطا لاصقا إلى الجزء العلوي من اللوحة (الشكل 2D). تسمح هذه الخطوة بالحد الأدنى من نقل الضوء بين الآبار ، حيث يتم طلاء الجزء العلوي وجوانب الآبار ، ولا يمكن للضوء الآن الدخول إلا من أسفل البئر حيث يتم وضع LED.
  15. ضع اللوحة في الأجزاء 3D المجهزة من LPA. ثم ، قم بتغطية اللوحة بغطاء LPA المطبوع 3D ، والذي يتناسب مع مسامير الجهاز في كل زاوية.
  16. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة واضغط على زر إعادة الضبط على جهاز LPA لضمان تطبيق إعدادات تجربة LPA المحدثة.
  17. احتضان الخلايا داخل النظام التجريبي لفترة مناسبة من الوقت ، اعتمادا على كثافة البذر الأصلية ، وسرعة النمو الخاصة بخط الخلية ، وظروف النمو. في هذا المثال ، تم تحفيز خطوط الخلايا لمدة 3 أيام متواصلة للتعبير الجيني للوصول إلى حالة ثابتة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العديد من الأنظمة البصرية الجينية (على سبيل المثال ، VVD) قد تصل إلى التعبير الجيني في حالة ثابتة في وقت أقرب بكثير (على سبيل المثال ، 24 ساعة) ، وبالتالي يمكن تقليل أوقات الحث التجريبية أو إطالة أمدها حسب الحاجة.
  18. في نهاية تجربة الحث الضوئي ، استخدم العينات لأي من الفحوصات الأربعة التالية لتوصيف خطوط الخلايا الهندسية (الأقسام 4-7).

4. المجهر الفلوري للخلايا الهندسية المستحثة بالضوء

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا الموجودة في LPA من الحاضنة ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. قم بإزالة شريط الرقائق واترك اللوحة لمدة 1-2 دقيقة. هذا يمنع التكثيف من التشكل على الغطاء البلاستيكي ، إذا تم وضعه على الفور على اللوحة.
  3. بعد 1-2 دقيقة من الجلوس ، ضع الغطاء البلاستيكي الأصلي مرة أخرى على اللوحة.
  4. صورة الخلايا باستخدام تباين الطور المناسب أو المجهر الفلوري.
  5. اعتمادا على الجهاز، اضبط وقت التعريض الضوئي وشدة مصدر الضوء والكسب لعرض الخلايا الهندسية. في هذه التجربة ، تم تطبيق المعلمات التالية: 50 مللي ثانية لوقت التعرض لمصدر الضوء FITC / GFP (البروتين الفلوري الأخضر) و 1-5 مللي ثانية لوقت التعرض لتباين الطور بكثافة 100٪ لكل منهما.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن أوقات التعرض المثلى ومستويات الكسب وكثافة مصدر الضوء غالبا ما تستمد تجريبيا من تجربة هذا العمل لتقليل التشبع الزائد في مراسل التألق ، وتقليل الضرر الخلوي ، والتقاط صور كافية للتحليل النوعي والكمي. عند تحديد مستويات كل من هذه المعلمات ، تشمل الجوانب التي يجب وضعها في الاعتبار زيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد ، وتقليل السمية الضوئية ، وتقليل التشبع المفرط لإشارات التألق ، وزيادة القدرة على تضخيم إشارات التألق الضعيفة.
    1. تحسين هذه المعلمات بشكل كبير مخصص ؛ ومع ذلك ، فإن القيم التجريبية السابقة (على سبيل المثال ، شدة مصدر الضوء التي تسبب التشبع الزائد لمراسل التألق) يمكن أن توجه الإعدادات التجريبية المستقبلية عند الاقتضاء. على سبيل المثال، يمكن استخدام إعدادات الكسب وأوقات التعرض والقيم الأولية لشدة الضوء من دائرة واحدة (LITer1.0) أو الإعداد التجريبي (على سبيل المثال، شدة الضوء) كنقطة انطلاق عند الانتقال إلى دائرة جينية مماثلة ولكنها مختلفة (LITer2.0)11 أو طريقة إضاءة مختلفة (على سبيل المثال، دورة عمل خفيفة).
  6. تبسيط تصوير الصفائح بواسطة قالب إحداثي مبرمج في برنامج الفحص المجهري مما يسمح لحجم اللوحة بالكامل (على سبيل المثال ، 24 بئرا) بالحصول الآلي على الصور من مواقع صور متعددة لكل بئر.

5. قياس التدفق الخلوي للخلايا الهندسية المستحثة بالضوء

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة تجلس لمدة دقيقة أو دقيقتين.
  3. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  4. أضف 100 ميكرولتر من التربسين بنسبة 0.25٪ إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي ، وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  5. اترك الخلايا دون إزعاج في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  6. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة اللوحة وأعدها إلى غطاء زراعة الأنسجة.
  7. تحييد كل التربسين جيدا مع 400 ميكرولتر من DMEM.
  8. قم بتسمية أنبوب البوليسترين ذو القاع المستدير سعة 5 مل مع مصفاة الخلية (أو أنبوب قياس التدفق الخلوي المناسب الذي يمكن تصفيته لإزالة كتل كبيرة من الخلايا غير المثقبة بالكامل) باسم يتوافق مع كل بئر.
  9. استخدم ماصة P1000 لماصة محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل 6-8 مرات لكسر كتل الخلايا وإنشاء عينات أحادية الخلية لقياس التدفق الخلوي49.
  10. انقل محتويات كل بئر بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب المصنفة باستخدام المصفاة.
  11. أحضر الخلايا إلى أداة قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
    ملاحظة: كان مقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذا العمل جزءا من منشأة أساسية تقع في المستشفى الجامعي.
  12. إنشاء بوابة تشتت أمامية وجانبية (FSC و SSC ، على التوالي) لالتقاط الخلايا المفردة ذات الحجم والدقة المناسبين لاستبعاد الحطام والكتل الخلوية على برنامج قياس التدفق الخلوي.
  13. بمجرد تعيين البوابة ، التقط ما يقرب من 10000 خلية باستخدام البوابة المناسبة. اضبط هذا الرقم بناء على كمية البيانات الخلوية التي يبحث عنها المستخدمون. كرر ذلك لكل أنبوب يحتوي على خلايا التجربة.
  14. بمجرد اكتمال التجربة ، قم باستيراد البيانات إلى برنامج بيانات قياس التدفق الخلوي المتاح لتحليلها.
  15. قم بإنشاء بوابة FSC-SSC (كما كان من قبل أثناء الاستحواذ) وقم بتطبيقها على كل دفعة من البيانات التجريبية. يتم استخدام بئر مرجعي لمجموعات الخلايا غير المستحثة لإنشاء هذه البوابة في هذه المخطوطة ، ولكن توجد مقاييس أخرى لإنشاء البوابة ، مثل البوابات القائمة على الكثافة.
  16. باستخدام الظروف التجريبية المغلقة ببوابة FSC-SSC ، قم برسم بيانات قياس التدفق الخلوي كرسوم بيانية أو تمثيلها بطرق أخرى لتوضيح أنماط التعبير التي تم الحصول عليها. في هذه التجربة ، تم التقاط التألق بواسطة قنوات GFP / FITC أو PE / TexasRed.

6. استخراج الحمض النووي الريبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لمكونات الدائرة الجينية

  1. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  2. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة تجلس لمدة دقيقة أو دقيقتين.
  3. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  4. تابع استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المناسبة.
  5. بمجرد اكتمال استخراج الحمض النووي الريبي، قم بإجراء تفاعل نسخ عكسي لكل عينة (الجدول 3).
  6. علاوة على ذلك ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لكل عينة (الجدول 4). استخدم بوليميراز الحمض النووي والبروتوكول المرتبط به لإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. لهذه الخطوة ، قم بإعداد تفاعل متعدد الإرسال باستخدام جين التدبير المنزلي وجين مثير للاهتمام ، أو قم بإنشاء تفاعلات منفصلة. في هذا المثال ، تم فحص مستويات GFP و KRAS و glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). بعد الانتهاء من تجربة qRT-PCR ، تابع التحليل عبر البرامج المتاحة لتوضيح تغير طية دائرة الجينات على مستوى الحمض النووي الريبي.

7. التألق المناعي لمكونات الدائرة الجينية

  1. استخدم حمام ثلج أو فريزر لتبريد الميثانول.
  2. 24-72 ساعة بعد الحث ، قم بإزالة الخلايا من LPA في الحاضنة أو من المجهر بعد التصوير ووضعها في غطاء زراعة الأنسجة.
  3. إذا تمت إزالته مباشرة من LPA ، فقم بإزالة شريط الرقائق ، واترك اللوحة لمدة 1-2 دقيقة.
  4. استنشاق الوسائط من كل بئر (من لوحة ال 24 بئرا بأكملها إذا تم استخدام جميع الآبار).
  5. أضف 100 ميكرولتر من التربسين بنسبة 0.25٪ إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي ، وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  6. اترك الخلايا دون إزعاج في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  7. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة اللوحة وأعدها إلى غطاء زراعة الأنسجة.
  8. تحييد كل التربسين جيدا مع 400 ميكرولتر من DMEM.
  9. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الصغيرة بأسماء تتوافق مع كل بئر.
  10. استخدم ماصة P1000 وماصة محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل 6-8 مرات لكسر كتل الخلايا.
  11. انقل محتويات كل بئر بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب الموسومة.
  12. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  13. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  14. أعد تعليق الخلايا (استخدم ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا) في 750-1000 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (مخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS).
  15. اسمح للخلايا بالجلوس لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  16. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من PBS. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  17. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  18. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  19. أعد تعليق الخلايا (استخدم ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا) في 750-1000 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج.
  20. اسمح للخلايا بالجلوس لمدة 30 دقيقة على الجليد أو في ثلاجة -20 درجة مئوية.
  21. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من PBS. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  22. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
  23. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  24. اعتمادا على نوع الأجسام المضادة المستخدمة ، قم بتعديل البروتوكول من هذه النقطة فصاعدا. اتبع أي من الخطوتين 7.24.1-7.24.14 أو 7.24.15-7.24.22.
    1. في حالة استخدام جسم مضاد أولي وثانوي ، أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 / P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية. في هذه الحالة ، تم إجراء تخفيف بنسبة 1: 800 للأجسام المضادة للمخزون ، بما في ذلك الأجسام المضادة KRAS أو الأجسام المضادة ERK ، وسمح لها بالجلوس لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تخفيف الأجسام المضادة في مخزن مؤقت للحضانة مصنوع من 1x PBS مع 0.5 جم من BSA.
      ملاحظة: حدد التخفيف الدقيق للجسم المضاد تجريبيا عن طريق إنشاء منحنى قياسي لتخفيفات الأجسام المضادة مقابل المستضد محل الاهتمام.
    2. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    3. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من مخزن الحضانة المؤقت. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    4. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    5. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
    6. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 / P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية. في هذه الحالة ، تم إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية عند تخفيف 1:800 للجسم المضاد KRAS أو 1:2000 للجسم المضاد ERK وسمح لها بالجلوس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. على غرار الأجسام المضادة الأولية ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية في مخزن الحضانة كما هو موضح أعلاه. تحديد تخفيفات الأجسام المضادة الثانوية بناء على النتائج التجريبية للمنحنى القياسي.
    7. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    8. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحضانة. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    9. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    10. عند الانتهاء، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.
    11. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
    12. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى الأنابيب المصنفة مع مصفاة.
    13. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
      ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن وجود العديد من الضوابط أمر مهم للتقدم في قياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني للخلية المهندسة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون وجود خلايا غير ملطخة تماما ، وخلايا ملطخة بالأجسام المضادة الأولية وحدها ، والخلايا الملطخة بالأجسام المضادة الثانوية وحدها مفيدا لمقارنة النتائج بإشارات الخلفية من الأجسام المضادة.
    14. بعد ذلك ، تابع التحليل كما هو موضح في القسم 5.
    15. في حالة استخدام جسم مضاد أولي فقط، أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000/P200 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية الموسومة. تحديد تخفيف الأجسام المضادة المناسبة وحضانتها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحديد تخفيف الأجسام المضادة من المنحنى القياسي تجريبيا.
    16. بعد إضافة الأجسام المضادة ، قم بتغطية الأنابيب برقائق لمنع تأثيرات الضوء على الأجسام المضادة الموسومة.
    17. بعد الحضانة ، أضف 750-1000 ميكرولتر من مخزن الحضانة المؤقت. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    18. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 400 × غرام.
    19. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 وماصة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات في كل أنبوب لكسر كتل الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
    20. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل (~ 500 ميكرولتر) إلى أنابيب ذات ملصقات مع مصافي.
    21. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة (يمكن إحضار أنابيب بها خلايا على الجليد أو خارجه).
      ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن وجود العديد من الضوابط أمر مهم للتقدم في قياس التدفق الخلوي وتحليل التعبير الجيني للخلية المهندسة. إن وجود خلايا غير ملطخة تماما وخلايا ملطخة بالأجسام المضادة الأولية وحدها مفيد لمقارنة النتائج بإشارات الخلفية من الأجسام المضادة.
    22. من هذه النقطة ، تابع التحليل كما هو موضح في القسم 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استند تجميع الدوائر الجينية وتوليد خط الخلية المستقرة في هذه المقالة إلى خلايا HEK-293 التجارية المعدلة التي تحتوي على موقع FRT واحد مستقر نشط نسخيا (الشكل 1). تم بناء الدوائر الجينية في ناقلات تحتوي على مواقع FRT داخل البلازميد ، مما يسمح بدمج Flp-FRT في جينوم خلية HEK-293. لا يقتصر هذا النهج على خلايا Flp-In ، حيث يمكن إضافة مواقع FRT إلى أي خط خلوي ذي أهمية في أي مكان في الجينوم باستخدام تقنية تحرير الحمض النووي مثل CRISPR / Cas950.

بمجر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لقراء هذه المقالة اكتساب نظرة ثاقبة على الخطوات الحيوية لتوصيف الدوائر الجينية البصرية (بالإضافة إلى أنظمة التعبير الجيني الأخرى) ، بما في ذلك 1) تصميم الدوائر الجينية وبنائها والتحقق من صحتها. 2) هندسة الخلايا لإدخال الدوائر الجينية في خطوط الخلايا المستقرة (على سبيل المثال ، إعادة تركيب Flp-FRT) ؛ 3) تحريض الخلايا الهندسية مع منصة قائمة على الضوء مثل LPA ؛ 4) التوصيف الأولي لمقايسات تحريض الضوء عن طريق المجهر الفلوري ؛ و 5) توصيف التعبير الجيني النهائي مع مجموعة متنوعة من المقايسات ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مختبر Balázsi على التعليقات والاقتراحات ، والدكتور كارل ب. جيرهاردت والدكتور جيفري ج. تابور لمساعدتنا في بناء أول LPA ، والدكتور ويلفريد ويبر لمشاركة بلازميدات LOV2-degron. وقد دعمت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561 و T32 GM008444]؛ مركز لوفر للبيولوجيا الفيزيائية والكمية. وزمالة الدراسات العليا في علوم وهندسة الدفاع الوطني (NDSEG). تمويل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561].

مساهمات المؤلف: M.T.G. و G.B. تصور المشروع. أجرى كل من M.T.G. و D.C. و L.G. التجارب. قام كل من M.T.G. و D.C. و L.G. و G.B. بتحليل البيانات وإعداد المخطوطة. أشرف G.B. و M.T.G. على المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 مل أنابيب PCRكاشف 951010006 Eppendorfلإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل
0.25٪ كاشف MT25053CI Trypsin EDTA 1XThermo Fisher Scientificلتقسيم وحصاد خلايا الثدييات
0.5-10 مو ؛ L أداة 3123000020 لحجمEppendorfتستخدم لتفاعلات سحب العينات
100-1000 مو ؛ L أداة 3123000039 لحجمEppendorfتستخدم لتفاعلات سحب العينات
20-200 مو ؛ L أداة3123000055قابل للتعديل Eppendorfتستخدم لتفاعلات سحب العينات
2-20 & mu ؛ L أداة 3123000039 ذات حجم قابل للتعديلEppendorfتستخدم لتفاعلات سحب العينات
مل أنبوب بوليستين مستدير القاع مع غطاء مصفاة الخليةكاشف Corning352235 لقياس التدفق الخلوي
5702R جهاز طرد مركزي ، مع 4 × 100 دوار ، محولات 15 و 50 مل ، معدات 22628113 Eppendorf 120 فولتلأعمال ثقافة الثدييات
AgaroseDenville ScientificGR140-500كاشف للهلام الكهربائي
رقائق الألومنيوم لألواح 96 بئرVWR & reg ؛60941-126أداة تستخدم لتغطية الألواح في تجارب الحث الضوئي كاشف
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Gلاختيار البكتيريا باستخدام
خلاط الدوامة التناظريةالصحيح Thermo Fisher Scientific02215365PRلحمل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التحويل أو استخراج الهلام
كاشف DF0140010 العلمي المجفف AgarFisherل البكتيريا المتنامية
BD LSRAriaBD656700أداة لفرز خطوط الخلايا المهندسة إلى مجموعات وحيدة النسيلة BD
LSRFortessaBD أداة 649225لتوصيف خطوط الخلايا الهندسية
BSA ، مصل الأبقار الألبومينالمصدر العلمي الحكوميSIGA4919-1Gلمخزن حضانة IF
لوحة ثقافة الخلية 12 بئر ، شفافة ، مسطحة القاع مع غطاء ، بوليسترين ، غير بيروجين ، لوحة353043CorningTC المستخدمة لزراعة الخلايا أحادية النسيلة
الطرد المركزيVWR22628113لزراعة خلايا الثدييات
غطاء الدخان الكيميائيN / AN / Aأداة لتنفيذ تفاعلات IF
لوحة ثقافة الخلية الشفافة 24 بئر مسطحة القاع مع غطاءBD353047لوحة تستخدم لزراعة الخلايا أحادية النسيلة
غطاء مرشح CytoOne T25 قارورة TCالولايات المتحدة الأمريكية حاوية ScientificCC7682-4825لزراعة خلايا الثدييات
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Fischer ScientificBP231-100المستخدم لتجميد خلايا الثدييات الهندسية
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011كاشف الرحلان
الكهربائي للهلامFalcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture, with lidCorning353072 container لزراعة الخلايا أحادية النسيلة المصنفة
FCS ExpressDe Novo Software:N /A برنامج لتوصيف بيانات قياس التدفق
الخلوي مصل الأبقار الجنينية, عادي, وزارة الزراعة الأمريكية 500 ملكاشف Corning35-010-CVلزراعة خلايا
الثديياتأطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف - سلسلة من التلال المرتفعة. 100 × 15 مممعدات FB0875712 علمية فيشرلزراعة البكتيريا
Gibco & nbsp ؛ DMEM ، كاشف عالي الجلوكوزالحراري فيشرالعلمي 11-965-092لزراعة خلايا الثدييات
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayAssay Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 مجم / مل) ، كاشف 20 ملLife Technologies10687-010لاختيار الخلايا ذات التكامل المناسب لدائرة
الجينات iScript Reverse Transcription Supermixمختبرات Bio-Rad1708890كاشف لتحويل الحمض النووي الريبي إلى فريزر مختبر (cDNA
-20 درجة ؛ CVWR76210-392معدات لتخزين الكواشف التجريبية
مختبر الفريزر -80 درجة ؛ CباناسونيكMDF-U74VCلتخزين الكواشف التجريبية
ثلاجة المختبر +4 درجة ؛ CVWR76359-220معدات لتخزين الكواشف التجريبية
LB Broth (Lennox) ، كاشف 1 كجمSigma-AldrichL3022-250Gلزراعة البكتيريا
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt لنقل دوائر الجينات إلى خلايا الثدييات
MATLAB 2019MathWorksN / Aلتحليل البيانات
التجريبيةكاشف 413775000 الميثانولAcros Organicsلتفاعل التألق المناعي
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، حاوية من مادة البولي بروبيلين 1.7 ملVWR20170-333
Mr04097229_mr EGFP / YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCEquipment للبكتيريا التحول
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificNDL-US-CANمعدات لقياس تركيز الحمض النووي / الحمض النووي
NEB Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة 2x كاشف Master MixNEBM0492Sل PCR لشظايا دائرة الجينات
NEB10-beta المختصة بكتريا قولونية (عالية الكفاءة) الخلاياالبكتيرية New England Biolabs (NEB)C3019Hلتضخيم دائرة الجينات من الأهمية
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lكاشف للجمع بين مجهر
نيكون Eclipse Ti-E المقلوب مع كاميرا DS-Qi2Nikon Instruments Inc.N / Aأداة لقياس التعبير الجيني
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.برنامج N / Aلتوصيف بيانات الفحص المجهري الفلوري
كاشفIDTN / Aالمستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل لمكونات الدائرة الجينية
باناسونيك MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ سلسلة CO2< / sub> حاضنة مع الأشعة فوق البنفسجية و H2< / sub>O2< / sub> التحكمباناسونيكMCO-170AICUVHL-PAلزراعة خلايا
الثديياتبارافورمالدهيد ، 16٪ علومالمجهر الإلكتروني15710-Sكاشف
PBS ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) (1x)14190144Invitrogenلزراعة خلايا الثدييات ، كاشف للمخزن المؤقت للحضانة IF
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL) ، كاشف 100xFisher Scientific15140-122لزراعة خلايا
الثديياتتقنية إشارات الخلية للأجسام المضادة الأولية ERK4370Sللجسم المضاد الأولي ERK للجسم
المضاد الأولي KRAS للجسم المضادSigma-AldrichWH0003845M1الجسم المضاد الأولي KRAS للتألق المناعي
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106لتنقية بلازميدات دائرة الجينات
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704مجموعة الكاشف لتنقية شظايا دائرة الجينات
QuantStudio 3 نظام PCR في الوقت الحقيقيمعدات EppendorfA28137لتطبيق القياس الكمي النسبي qRT-PCR
برنامج Thermo Fisher ScientificN /A لقياس كمية RNA / cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kitمجموعة Qiagen74134لاستخراج الحمض النووي الريبي لخلايا الثدييات الهندسية
الجسمالمضاد ERK الثانويتقنية إشارات الخلية8889Sالجسم المضاد ERK الثانوي للجسم
المضاد المناعي الثانوي KRASInvitrogenA11005الجسم المضاد KRAS الثانوي للتألق المناعي
الماصات المصلية 5.0 ملأوليمبوس بلاستيك12-102المستخدمة لإعداد مجموعة متنوعة من التفاعلات
SmartView Pro Imager Systemالعلوم الرئيسيةUVCI-1200أداة لتصوير نطاقات PCR الصحيحة
SnapGene Viewer (مجانا) أو SnapGeneSnapGeneN /A تصميم تسلسل الحمض النووي وتحليله
حاضنة المرحلة العلويةTokai HitINU-TIZلحمل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التحويل أو استخراج الهلام
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher كاشف 4444557 العلميل PCR لشظايا
دائرة الجيناتTaqMan Human GAPD (GAPDH) التحكم الذاتي (مسبار VIC / MGB) ، التمهيدي المحدود ، 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Radأداة 1851148 لحمل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو التحويل أو استخراج الهلام
VisiPlate-24 أسود ، أسود 24 بئر مع قاع شفاف ، معقم ومعالجة بزراعةالأنسجة لوحة PerkinElmer1450-605المستخدمة لتحريض الضوء تجارب
VWR ماصات باستور يمكن التخلص منها ، زجاج ، ماصة زجاجية من زجاج البورسليكات ، طرف قصير ، السعة = 2 مل ، الطول الكلي = 14.6 سمكاشف VWR14673-010لزراعة خلايا الثدييات
الرحلان الكهربائي الأفقي المصغرة VWR ، نظام هلام Mini10VWR89032-290معدات الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007خط خلية هندسي مع FRT موقع
الحجم الحجم ذات حجم 5 البلازميد القياسية جهاز كاشف ) معدات برنامج الريبي أداة الصف كاشف المناعي طقم كاشف كواشف الكيميائية أنظمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Optogenetic Gene CircuitsMammalian CellsGene Expression ControlLight Inducible ExpressionStable Cell LinesFlow CytometryFluorescence MicroscopyNegative Feedback CircuitGene Expression NoiseProtein Expression Quantification

مقالات ذات صلة