تحليل وقت السكون أحادي الجزيء لانقسام الحمض النووي بوساطة نوكلياز التقييد

ملخص

باستخدام الحمض النووي المسمى بالنقاط الكمومية والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي ، يمكننا التحقيق في آلية تفاعل نوكلياز التقييد أثناء استخدام البروتين غير المسمى. تسمح تقنية الجزيء الواحد هذه بمراقبة متعددة الإرسال على نطاق واسع لتفاعلات البروتين والحمض النووي الفردية ، ويمكن تجميع البيانات لتوليد توزيعات وقت مكوث مكتظة بالسكان.

الملخص

يسهل هذا الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي الجديد القياس المتزامن لطول الدورة التحفيزية لمئات من جزيئات نوكلياز التقييد الفردي (REase) في تجربة واحدة. لا يتطلب هذا الفحص وضع علامات على البروتين ويمكن إجراؤه باستخدام قناة تصوير واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تجميع نتائج التجارب الفردية المتعددة لإنشاء توزيعات وقت مكوث مكتظة بالسكان. يمكن أن يساعد تحليل توزيعات وقت السكون الناتجة في توضيح آلية انقسام الحمض النووي من خلال الكشف عن وجود خطوات حركية لا يمكن ملاحظتها مباشرة. مثال على البيانات التي تم جمعها باستخدام هذا الفحص مع REase المدروس جيدا ، EcoRV - وهو نوكلياز داخلي من النوع IIP من النوع الثاني يشق التسلسل التناظري GAT↓ATC (حيث ↓ هو موقع القطع) - تتفق مع الدراسات السابقة. تشير هذه النتائج إلى أن هناك ثلاث خطوات على الأقل في مسار انقسام الحمض النووي الذي يبدأ بإدخال المغنيسيوم بعد أن يربط EcoRV الحمض النووي في غيابه ، بمتوسط معدل 0.17 ^s-1 لكل خطوة.

المقدمة

نوكلياز التقييد (REases) هي إنزيمات تؤثر على فواصل مزدوجة الشريط خاصة بالتسلسل في الحمض النووي. أدى اكتشاف REases في سبعينيات القرن العشرين إلى تطوير تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف ، وهذه الإنزيمات هي الآن أدوات مختبرية لا غنى عنها للتعديل الوراثي والتلاعب¹. الإنزيمات من النوع الثاني هي الإنزيمات الأكثر استخداما في هذه الفئة؛ لأنها تشق الحمض النووي (DNA) في موقع ثابت إما داخل تتابع التعرف عليها أو بالقرب منه. ومع ذلك ، هناك قدر كبير من الاختلاف بين النوع الثاني من REases ، وهي مقسمة إلى عدة أنواع فرعية بناء على خصائص إنزيمية معينة بدلا من تصنيفها وفقا لعلاقاتها التطورية. من بين كل نوع فرعي ، هناك استثناءات متكررة لنظام التصنيف ، والعديد من الإنزيمات تنتمي إلى أنواع فرعية متعددة². تم تحديد الآلاف من أنواع REases من النوع الثاني ، والمئات منها متاحة تجاريا.

ومع ذلك ، على الرغم من التنوع بين النوع الثاني من REases ، فقد تمت دراسة عدد قليل جدا من REases بالتفصيل. وفقا ل REBASE ، قاعدة بيانات إنزيم التقييد التي أنشأها السير ريتشارد روبرتس في 1975³ ، تتوفر بيانات الحركية المنشورة لأقل من 20 من هذه الإنزيمات. علاوة على ذلك ، في حين أن بعض REases قد لوحظت مباشرة على مستوى الجزيء الواحد أثناء انتشارها على طول الحمض النووي قبل مواجهة تسلسل التعرف عليها^4،5،6،7 والارتباط به ، إلا أن هناك عددا قليلا جدا من الدراسات أحادية الجزيء لحركية تفاعل الانقسام. الدراسات الحالية إما لا تبلغ عن إحصاءات كافية لإجراء تحليل مفصل للتباين في الأوقات التي تحدث فيها أحداث الانقسام الفردي^8،9،10 أو أنها غير قادرة على التقاط التوزيع الكامل لأوقات الانقسام¹¹. يمكن أن يكشف هذا النوع من التحليل عن وجود وسيطات حركية طويلة العمر نسبيا ويمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لآليات انقسام الحمض النووي بوساطة REase.

على مستوى الجزيء الواحد ، تكون العمليات الكيميائية الحيوية عشوائية - وقت الانتظار لحدوث مثيل واحد من العملية ، τ ، متغير. ومع ذلك ، يمكن توقع أن تطيع العديد من قياسات τ التوزيع الاحتمالي ، p (τ) ، الذي يدل على نوع العملية الجارية. على سبيل المثال ، ستخضع عملية من خطوة واحدة ، مثل إطلاق جزيء ناتج من إنزيم ، لإحصائيات بواسون ، وستتخذ p (τ) شكل توزيع أسي سالب:

حيث β هو متوسط وقت الانتظار. لاحظ أن معدل العملية ، k ، سيكون مساويا ل 1/β ، معكوس متوسط وقت الانتظار. بالنسبة للعمليات التي تتطلب أكثر من خطوة واحدة ، ستكون p (τ) هي التفاف التوزيعات الأسية المفردة لكل خطوة من الخطوات الفردية. الحل العام لالتفاف دوال الاضمحلال الأسي الأحادي N مع متوسط أوقات انتظار متطابقة ، β ، هو توزيع احتمال جاما:

حيث Γ (N) هي دالة جاما ، التي تصف استيفاء مضروب N-1 إلى القيم غير الصحيحة ل N. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذا الحل العام كتقدير تقريبي عندما يكون متوسط أوقات الانتظار للخطوات الفردية متشابهة ، يجب أن يكون مفهوما أن وجود خطوات سريعة نسبيا سيتم حجبه بخطوات ذات أوقات انتظار أطول بكثير. بمعنى آخر ، تمثل قيمة N حدا أدنى لعدد الخطوات¹². مع وجود عدد كاف من قياسات وقت الانتظار ، يمكن تقدير المعلمات β و N عن طريق تجميع الأحداث وملاءمة توزيع جاما مع الرسم البياني الناتج أو باستخدام نهج تقدير الاحتمال الأقصى. وبالتالي يمكن أن يكشف هذا النوع من التحليل عن وجود خطوات حركية لا يمكن حلها بسهولة في مقايسات المجموعة ويتطلب عددا كبيرا من الملاحظات لتقدير المعلمات بدقة^12,13.

تصف هذه الورقة طريقة لاستخدام الحمض النووي المسمى بالنقاط الكمومية والمجهر الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) لمراقبة مئات من أحداث انقسام الحمض النووي الفردية بوساطة REase بالتوازي. يتيح تصميم الفحص تجميع نتائج العديد من التجارب ويمكنه إنشاء توزيعات في وقت الإقامة تحتوي على آلاف الأحداث. يسمح الثبات الضوئي العالي وسطوع النقاط الكمومية بدقة زمنية تبلغ 10 هرتز دون التضحية بالقدرة على مراقبة أحداث الانقسام التي تحدث حتى بعد دقائق عديدة من بدء التجربة. تسمح الدقة الزمنية الجيدة والنطاق الديناميكي الواسع ، جنبا إلى جنب مع القدرة على جمع مجموعة كبيرة من البيانات ، بالتوصيف الدقيق لتوزيعات وقت السكون للكشف عن وجود خطوات حركية متعددة في مسارات الانقسام في REases ، والتي لها معدلات دوران في نطاق 1 ^min-1 . في حالة EcoRV ، يمكن حل ثلاث خطوات حركية ، تم تحديدها جميعا من خلال وسائل أخرى ، مما يؤكد أن الفحص حساس لوجود مثل هذه الخطوات.

يتم إنتاج ركائز الحمض النووي المزدوجة التي تحتوي على تسلسل التعرف محل الاهتمام عن طريق تلدين قليل النوكليوتيد البيوتينيل إلى شريط مكمل موسوم بنقطة كمومية نانوية شبه موصلات واحدة متصلة تساهميا. يتم إدخال هذه الركائز في قناة تدفق مبنية فوق غطاء زجاجي مع عشب من جزيئات البولي إيثيلين جلايكول عالية الوزن الجزيئي (PEG) متصلة تساهميا بسطحه. يتم التقاط ركائز الحمض النووي عن طريق ارتباط البيوتين - الستربتافيدين - البيوتين بواسطة جزء صغير من جزيئات PEG التي تحتوي على البيوتين في نهايتها الحرة. في الفحص المجهري TIRF ، توفر الموجة المتلاشية التي تتحلل أضعافا مضاعفة مع المسافة من واجهة الزجاج والسائل الإضاءة. عمق الاختراق بترتيب الطول الموجي للضوء المستخدم. في ظل هذه الظروف ، سيتم إثارة النقاط الكمومية فقط المربوطة بالسطح بواسطة جزيء الحمض النووي الذي تم التقاطه على السطح الزجاجي الوظيفي. لن تكون النقاط الكمومية الحرة في المحلول مقيدة داخل المنطقة المضيئة وبالتالي لن تلمع. إذا كان الحمض النووي الذي يربط نقطة كمومية بالسطح مشقوقا ، فستكون هذه النقطة الكمومية حرة في الانتشار بعيدا عن السطح ، وستختفي من الصورة الفلورية.

على الرغم من أنه من المعروف أن العديد من أنواع REases من النوع الثاني تربط الحمض النووي في غياب المغنيسيوم¹⁴ ، إلا أن جميعها تتطلب المغنيسيوم للتوسط في انقسام الحمض النووي¹⁵. يمكن أن تربط هذه REases الحمض النووي المجمد على السطح في غياب المغنيسيوم. عندما يتم تدفق المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم عبر قناة مع ارتداد REase إلى الحمض النووي ، يبدأ الانقسام على الفور ، كما يتضح من اختفاء النقاط الكمومية. يسهل التزامن الذي يتحقق عن طريق الربط المسبق لجزيئات REase ، ثم بدء انقسام الحمض النووي عن طريق إدخال المغنيسيوم ، قياس وقت التأخر حتى اكتمال انقسام الحمض النووي بشكل مستقل لكل جزيء في مجموعة الإنزيمات التي لوحظت في التجربة. يتم تضمين الفلوريسئين كصبغة تتبع في المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم للإشارة إلى وصول المغنيسيوم إلى مجال الرؤية. نظرا لعدم تضمين أي إنزيم في المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم ، فإن وقت التأخر من وصول المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم إلى اختفاء كل نقطة كمومية يشير إلى الوقت الذي يستغرقه REase المرتبط بالفعل بالحمض النووي لشق الحمض النووي وإطلاق النقطة الكمومية من سطح الزجاج. يحدث اختفاء النقاط الكمومية بسرعة ويؤدي إلى انخفاض حاد في مسار الشدة ، مما يوفر مؤشرا واضحا على الوقت الذي يتم فيه شق جزيء الحمض النووي المعين. يتم تحديد أوقات الأحداث من خلال التحليل الرياضي لمسارات الشدة ، وتؤدي التجربة النموذجية إلى مئات من أحداث الانقسام التي يمكن تحديدها. يمكن تجميع نتائج التجارب المتعددة لتوفير إحصاءات كافية للسماح بتقدير المعلمات ، N و β ، إما عن طريق المربعات الصغرى غير الخطية أو تحليل الاحتمال الأقصى.

البروتوكول

1. معلومات عامة

1. تصميم قليل النوكليوتيد
   ملاحظة: تتكون ركيزة الحمض النووي ذات 60 زوجا من القواعد (bp) من زوج من قليل النيوكليوتيدات التكميلية بدرجة حرارة انصهار مزدوجة تبلغ 75 درجة مئوية في 100 مللي متر كلوريد الصوديوم.
   1. اطلب واحد قليل النوكليوتيد المركب مع تعديل واحد 5 'البيوتين والآخر مع تعديل 5 'ثيول (مع فاصل سداسي الكربون). ضع موقع التعرف في وسط منطقة الدوبلكس.
      ملاحظة: يتم عرض تسلسلات قليل النوكليوتيد للاستخدام مع EcoRV أدناه (موقع التعرف بالخط العريض).
      5' البيوتين - AAA لجنة التنسيق الإدارية GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC زز ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' ثيول - سي جي جي سي تي جي تي جي تي جي تيجيإيه تي جي إيه تي
2. استخدم ماء عالي النقاء بمقاومة 18 MOhm لجميع الخطوات.
3. حماية جميع المحاليل التي تحتوي على نقاط كمومية من الضوء لمنع التبييض الضوئي.
4. استخدم مصدر هواء مضغوط لإكمال هذا البروتوكول.

2. تحضير مواد ركيزة الحمض النووي ذات النقاط الكمومية

ملاحظة: إلى جانب قليل النيوكليوتيدات الموصوفة أعلاه ، انظر جدول المواد للمواد الأخرى والجدول 1 للمخازن المؤقتة اللازمة لإعداد ركائز الحمض النووي ذات النقاط الكمومية.

1. قلل مجموعات الثيول 5 بوصات على قليل النوكليوتيد لتقترن بالنقاط الكمومية.
   1. أعد تعليق كل قليل النوكليوتيد ثيوليتيد في الماء بتركيز 100 ميكرومتر.
   2. ماصة 650 ميكرولتر من الماء في عمود دوران استبعاد الحجم لكل عينة قليل النوكليوتيد ، ودوامة ل ~ 15 ثانية. اترك العمود ليحزم لمدة 30 دقيقة.
   3. قم بإعداد محلول ديثيوثريتول (DTT) طازج 100 مللي متر مباشرة قبل كل استخدام حيث يتحلل DTT في المحلول بسرعة. افتح بعناية قارورة واحدة تحتوي على 7.7 ملغ من DTT ، وماصة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم في القارورة ؛ دوامة لخلط جيدا.
   4. لكل قليل نيوكليوتيد معلق ، قم بإعداد أنبوب جديد ، وأضف 50 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد و 50 ميكرولتر من محلول DTT إلى الأنبوب. ماصة صعودا وهبوطا لخلط. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتقليل روابط ثاني كبريتيد بين مجموعات الثيول المؤكسدة على نهاية 5 'من oligonucleotides.
   5. قم بإزالة أغطية أعمدة الدوران ، وضع كل عمود في أنبوب التجميع. أجهزة الطرد المركزي أعمدة الدوران في 750 × غرام لمدة 2 دقيقة ، وتجاهل الشحم.
   6. نقل أعمدة الدوران إلى أنابيب طرد مركزي جديدة. قم بسحب الحجم الكامل (100 ميكرولتر) لعينة واحدة من خليط DNA / DTT برفق على كل عمود معد. أجهزة الطرد المركزي عند 750 × جم لمدة 2 دقيقة ، وقياس امتصاص الشطف عند 260 نانومتر للتأكد من أن التركيز حوالي 40 ميكرومتر.
   7. قم بتخزين أي عينات لن يتم استخدامها على الفور عند -20 درجة مئوية لمنع أكسدة مجموعات الثيول وتكوين روابط ثاني كبريتيد.
2. اقتران الحمض النووي بالنقاط الكمومية
   1. ماصة واحدة من 50 ميكرولتر من مخزون النقاط الكمومية في جهاز غسيل الكلى لكل بناء يتم إجراؤه ، مع التأكد من عدم لمس الغشاء بطرف الماصة. الدياليز مقابل حجم N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) المخزن المؤقت الذي لا يقل عن 1000x حجم العينة مع التحريك عند ~ 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
   2. قم بإعداد محلول 6 مللي متر طازج من سلفوسوكسينيميدل-4- (N-ماليميدوميثيل) سيكلو هكسان-1-كربوكسيلات (سلفو-SMCC) في محلول CHES مباشرة قبل كل استخدام. افتح بعناية قارورة واحدة تحتوي على 2 ملغ من السلفو-SMCC ، وسحب 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت CHES في القارورة. دوامة لخلط جيدا.
   3. باستخدام الماصة ، استرجع بعناية النقاط الكمومية المعلقة من جهاز غسيل الكلى ، ونقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على حجم متساو من محلول sulfo-SMCC ؛ ماصة صعودا وهبوطا لخلط. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة للسماح ل sulfo-SMCC بالتفاعل مع الأمينات الأولية على النقاط الكمومية.
   4. باستخدام الماصة ، انقل كل عينة بعناية إلى جهاز غسيل الكلى الجديد. لإزالة السلفو-SMCC الزائد، قم بغسيل الكلى مقابل حجم من المخزن المؤقت CHES لا يقل عن 1000 ضعف الحجم الموجود في جهاز (أجهزة) غسيل الكلى، مع التقليب، لمدة 15 دقيقة. استبدل المخزن المؤقت 2x ، وقم بإجراء غسيل الكلى باستخدام CHES buffer 3x في المجموع ، مما يسمح لغسيل الكلى بالمتابعة بعد 15 دقيقة من كل تبادل مؤقت.
   5. لتبادل المخزن المؤقت استعدادا للتفاعل الثاني، انقل أجهزة غسيل الكلى إلى كأس زجاجية تحتوي على حجم من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لا يقل عن 1000 ضعف الحجم الموجود في الجهاز (الأجهزة). قم بغسيل الكلى مع التحريك لمدة 15 دقيقة ، وقم باستبدال المخزن المؤقت 2x ، وقم بإجراء غسيل الكلى باستخدام برنامج تلفزيوني جديد 3x في المجموع ، مما يسمح لغسيل الكلى بالمتابعة لمدة 15 دقيقة بعد كل تبادل مؤقت.
   6. باستخدام الماصة ، استرجع بعناية المحلول الذي يحتوي على النقاط الكمومية من جهاز (أجهزة) غسيل الكلى ، وانقل كل عينة إلى أنبوب جديد يحتوي على كمية متساوية من قليل النوكليوتيد الثيولي المخفف في برنامج تلفزيوني. اجمع بين حجم متساو من PBS و 1/10^th حجم عينة oligonucleotide المختزلة والمنقاة (حوالي تركيز 40 ميكرومتر) حيث أن تركيز النقطة الكمومية في هذه المرحلة هو ~ 4 μM. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة.
   7. أضف ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 10 مجم / مل) إلى كل عينة للحصول على تركيز BSA النهائي 0.5 مجم / مل. باستخدام الماصة، انقل كل عينة بعناية إلى جهاز غسيل كلى جديد، وقم بغسيل الكلى مقابل حجم مخزن مؤقت لا يقل عن 1000 ضعف الحجم الموجود في جهاز (أجهزة) غسيل الكلى. تبادل المخزن المؤقت 2x ، وإجراء غسيل الكلى مع المخزن المؤقت تخزين جديد 3x في المجموع ، مما يسمح لغسيل الكلى بالمضي قدما لمدة 15 دقيقة بعد كل تبادل المخزن المؤقت.
   8. باستخدام الماصة ، استرجع كل عينة بعناية ، وضعها في أنبوب جديد ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لا تخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لأن النقاط الكمومية تتلف بسبب التجميد.
3. تلدين قليل النوكليوتيد المسمى بالنقاط الكمومية إلى قليل النوكليوتيد البيوتينيل
   1. أعد تعليق كل قليل النوكليوتيد البيوتينيل في مخزن مؤقت بتركيز 100 ميكرومتر. قم بتخزين العينات غير المستخدمة في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   2. اجمع بين عينة من قليل النوكليوتيد المسمى بالنقاط الكمومية مع فائض مولاري بمقدار 10 أضعاف من قليل النوكليوتيد البيوتينيل. نظرا لأن التركيز المقدر للحمض النووي في العينة ذات النقاط الكمومية هو 2 ميكرومتر ، أضف 0.2 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد البيوتينيل لكل 10 ميكرولتر من هذه العينة.
   3. سخني الخليط في كتلة حرارية إلى 75 درجة مئوية (درجة حرارة الانصهار للمنطقة التكميلية). امسك عند درجة الحرارة هذه لمدة 5 دقائق. أطفئ كتلة الحرارة واتركها لتبرد ببطء. تخزين البناء المكتمل في 4 درجات مئوية ؛ لا تجمد.

3. تشغيل السطح من أغطية

ملاحظة: تم وصف هذه العملية سابقا في بروتوكولات فيديو JoVE الأخرى^16,17. يصف هذا البروتوكول نسخة معدلة من الإجراء مع تغييرات طفيفة لاستيعاب شريحة زجاجية أصغر. انظر جدول المواد لمعرفة المواد الأخرى المطلوبة لتشغيل سطح أغطية الغطاء.

1. ضع 5 أغطية في كل حامل غطاء. تأكد من تخطي مسافة واحدة بين كل زوج من أغطية الغطاء حتى لا تلتصق ببعضها البعض. ضع أغطية الغطاء في حاملها في برطمان بغطاء ، وأضف الإيثانول إلى البرطمان حتى يتم تغطية أغطية الغطاء ، وقم بربط الجزء العلوي بإحكام. ضع الجرة بأكملها في الماء في صوتنة الحمام ، دون غمرها بالكامل ، وصوتنة لمدة 30 دقيقة.
2. املأ دورقا أو برطمانا نظيفا بالماء عالي النقاء. استخدم ملاقط معدنية لإزالة أغطية الغطاء في حاملها من الإيثانول ، وغمرها في الماء لشطفها. بعد ذلك ، انقل أغطية الغطاء والحامل إلى برطمان يحتوي على محلول هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) 1 M. قم بربط الجزء العلوي بإحكام ، ضع الجرة في حمام الصوتنة ، وقم بصوتنة لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: توخ الحذر عند التعامل مع محلول KOH لأنه يسبب التآكل والمهيج.
3. كرر صوتنة في محلول الإيثانول و KOH ، وشطف أغطية في الماء كما هو موضح أعلاه بين كل خطوة.
4. انقل أغطية الغطاء في حاملها إلى برطمان نظيف مملوء بالأسيتون النقي. قم بإنهاء التنظيف عن طريق صوتنة الجرة كما هو موضح أعلاه لمدة 30 دقيقة. لا تشطف بالماء بعد هذه الخطوة.
5. باستخدام ملاقط معدنية ، انقل أغطية الغطاء في حاملها إلى دورق نظيف سعة 100 مل يحتوي على 80 مل من الأسيتون الطازج وقضيب تقليب صغير. ضع الدورق على لوحة تحريك مغناطيسية مضبوطة على 1000 دورة في الدقيقة على الأقل. أثناء تقليب الأسيتون بقوة ، قم بسحب 1.6 مل من 3-أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسيسيلان (APTES) في الدورق لصنع محلول 2٪ v / v.
   ملاحظة: توخ الحذر عند سحب APTES لأنه يسبب التآكل.
6. اسمح لأغطية الغطاء بالاحتضان في المحلول لمدة 2 دقيقة ، ثم استخدم ملاقط معدنية لنقل أغطية الغطاء في حاملها إلى دورق من الماء لإخماد التفاعل. شطف الغطاءزلات مرتين أخريين ، واستبدال الماء في الدورق.
7. يعالج الزجاج المسيلاني في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة. إذا لم تستمر إلى الخطوة التالية على الفور ، فقم بتخزين أغطية الغطاء تحت المكنسة الكهربائية لمدة أقصاها بضعة أيام.
8. قم بإذابة البولي إيثيلين جلايكول المشتق من الإستر N-hydroxysuccinimide (NHS) في بيكربونات الصوديوم 100 mM (الرقم الهيدروجيني 8.2). استخدم نسبة 10: 1 من PEG المنتهي بالميثوكسي إلى PEG المنتهي بالبيوتين ، مع ~ 100 مجم / مل من PEG المنتهي بالميثوكسي.
9. ماصة 100 ميكرولتر من محلول PEG على نصف أغطية الغطاء الجافة ، وقم بتغطية كل واحدة بغطاء ثان. استخدم قطعا صغيرة من البارافيلم موضوعة في كل زاوية كفواصل لمنع أغطية الغطاء من الالتصاق ببعضها البعض.
10. احتضان أغطية في بيئة رطبة لمدة 3.5 ساعة. افصل شطائر الغطاء. استخدم زجاجة بخ لغسل كل غطاء بماء غزير وتجفيفه بالهواء المضغوط.
11. قم بتخزين أغطية وظيفية تحت المكنسة الكهربائية. تأكد من إبقاء الجانب المعالج ب PEG لأعلى لأن الجانب الآخر لن يلتقط ركيزة الحمض النووي.

4. بناء جهاز الموائع الدقيقة

ملاحظة: انظر جدول المواد للمواد الأخرى المطلوبة لبناء جهاز الموائع الدقيقة.

1. باستخدام أداة دوارة متعددة الأدوات محمولة باليد مزودة بلقمة عجلة ماسية مدببة ، قم بحفر فتحتين في الزوايا المقابلة لشريحة الكوارتز لتكون بمثابة مدخل ومخرج. تأكد من تثبيت الشريحة في مكانها ، وتليين اللقمة ، والانزلاق باستمرار بالماء أثناء الحفر. بعد كل تجربة ، استرجع شريحة الكوارتز المعدة لإعادة استخدامها عن طريق نقع جهاز مستخدم في الأسيتون لإذابة المادة اللاصقة والإيبوكسي ؛ تجاهل المكونات المتبقية.
   ملاحظة: يمكن إجراء الحفر يدويا ، لكن استخدام حامل نمط الضغط للأدوات المتعددة يجعل العملية أسهل.
2. الجمع بين 25 ميكرولتر من محلول الستربتافيدين مع 80 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. قم بتغطية غطاء معالج ب PEG بهذا الخليط ، واحتضانه في بيئة رطبة لمدة 30 دقيقة.
3. أثناء حضانة الغطاء ، قم بإعداد فاصل التصوير لإنشاء قناة تدفق. قم بقص قطعة مربعة بحجم 1 بوصة من مادة فاصل التصوير ، ثم حدد قناة بعرض 2 مم محاذاة إلى نهايات الثقوب المحفورة في شريحة الكوارتز (الشكل 2). اقطع القناة من مادة الفاصل بمشرط.
4. قشر جانبا واحدا من الدعم من فاصل الصورة ، وضعه بعناية على شريحة الكوارتز ، مع الحرص على عدم تغطية فتحات المدخل والمخرج. تأكد من تنظيف شريحة الكوارتز جيدا باستخدام الأسيتون لإزالة أي بقايا من المادة اللاصقة من التجارب السابقة.
5. اغسل غطاء الغطاء بالماء وجففه بالهواء المضغوط. قم بإزالة الجانب الآخر من الدعم من فاصل التصوير ، وقم بشطره بين شريحة الكوارتز وغطاء الغطاء الوظيفي المطلي بالستربتافيدين ، باستخدام الملقط البلاستيكي للضغط على المجموعة معا وإزالة فقاعات الهواء من المادة اللاصقة.
6. أدخل أنبوبا واحدا من البولي إيثيلين بطول 30 سم في كل فتحة في شريحة الكوارتز. تأكد من قطع نهايات الأنبوب بزاوية لضمان التدفق الحر للمحلول. استخدم رفا أنبوبيا أو أي دعم آخر لتثبيت الأنابيب في مكانها ، وأغلق الأنابيب في مكانها وحواف الجهاز المجمع بالإيبوكسي.
   ملاحظة: يعمل بشكل جيد لبناء الجهاز على قطعة من parafilm ، والتي يمكن تقشيرها بسهولة من القاع عندما يتم ضبط الإيبوكسي.
7. بمجرد ضبط الإيبوكسي ، أدخل الإبرة الحادة على المحقنة الفارغة في أنبوب مخرج الجهاز ، واغمر نهاية أنبوب المدخل في وعاء مملوء بمخزن مؤقت مانع. اسحب مكبس المحقنة لملء الجهاز بمخزن مؤقت للحظر. اترك الجهاز لاحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.

5. الربط السطحي لركيزة الحمض النووي ذات النقاط الكمومية

ملاحظة: إلى جانب جهاز الموائع الدقيقة ، وركيزة الحمض النووي ، والمخزن المؤقت المانع الموصوف أعلاه ، انظر جدول المواد للمواد الأخرى والجدول 1 للمخازن المؤقتة المطلوبة للربط السطحي لركائز الحمض النووي ذات النقاط الكمومية.

1. قم بتوصيل جهاز الموائع الدقيقة بلوحة مرحلة المجهر بشريط ، واجعل الهدف ملامسا لقاع الجهاز ، وضع الهدف بحيث يكون مجال الرؤية داخل قناة الموائع الدقيقة.
2. اغسل قناة الموائع الدقيقة بمخزن مؤقت جديد عن طريق سحب مكبس المحقنة للخلف بعد توصيل أنبوب المخرج بمضخة المحقنة. تحقق للتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة في الأنبوب أو في القناة.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، تأكد من أن أنبوب المدخل في سائل حتى لا يتم إدخال فقاعات هواء في الجهاز.
3. تمييع 1 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي المحضرة إلى 1 مل من المخزن المؤقت للحظر. ضع أنبوب المدخل في ركيزة الحمض النووي المخففة ، واتدفق 800 ميكرولتر من محلول الركيزة عبر القناة بمعدل 200 ميكرولتر / دقيقة. اترك محلول الحمض النووي يحتضن في القناة دون عائق لمدة 15 دقيقة بعد توقف التدفق.
4. تدفق ما لا يقل عن 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع عبر القناة بمعدل 200 ميكرولتر / دقيقة لشطف الحمض النووي غير المرتبط خارج القناة.
5. اضبط طاقة الليزر وتركيز المجهر وزاوية TIRF بحيث تكون النقاط الكمومية المربوطة بالسطح مرئية بوضوح.
   ملاحظة: على الرغم من أن النقاط الكمومية لا تبيض بسرعة ، فمن الأفضل الحفاظ على الطاقة منخفضة قدر الإمكان لتقليل الوميض.

6. انقسام الحمض النووي بوساطة REase

ملاحظة: انظر جدول المواد للمواد والجدول 1 للمخازن المؤقتة المطلوبة لانقسام الحمض النووي بوساطة REase.

1. تأكد من تبريد الكاميرا إلى درجة حرارة التشغيل المثلى وإعدادها للبث عالي السرعة مع وقت تعرض يبلغ 0.10 ثانية. كن مستعدا لجمع البيانات لمدة ~ 4 دقائق.
2. اغسل جهاز الموائع الدقيقة ب 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت التجريبي بدون المغنيسيوم بمعدل تدفق 200 ميكرولتر / دقيقة.
3. أضف REase إلى قسمة (1 مل) من المخزن المؤقت التجريبي بدون مغنيسيوم ، واخلطه برفق عن طريق الماصة. استخدم 4 ميكرولتر من مخزون 100000 وحدة / مل ، وهو ما يتوافق مع 400 وحدة / مل من EcoRV. تدفق 800 ميكرولتر من الإنزيم المخفف عبر القناة بمعدل تدفق 200 ميكرولتر / دقيقة.
4. ابدأ التجربة بتدفق المخزن المؤقت التجريبي الذي يحتوي على المغنيسيوم والفلوريسئين بمعدل تدفق 200 ميكرولتر / دقيقة. ابدأ في التقاط البيانات فور بدء تشغيل مضخة المحقنة. بعد تدفق 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، توقف عن الحصول على البيانات.

7. تحليل البيانات

ملاحظة: راجع جدول المواد الخاص ببرنامج تحليل البيانات المستخدم لهذا البروتوكول ، وقم بإجراء التعديلات في حالة استخدام نظام أساسي تحليل مختلف.

1. تحديد نقطة زمنية صفرية
   1. اطرح مضان الخلفية من كل إطار من الفيلم التجريبي باستخدام وظيفة imtophat ، وهي وظيفة تصفية القبعة العلوية المورفولوجية المضمنة في مربع أدوات معالجة الصور. حدد قرصا بنصف قطر ثلاثة بكسل كعنصر هيكلي. احصل على كثافة الخلفية عن طريق طرح الصورة التي تمت تصفيتها من الصورة الأصلية.
      ملاحظة: يحتفظ الفلتر فقط بميزات الصورة الأكثر سطوعا من الخلفية والأصغر من عنصر الهيكلة.
   2. متوسط الخلفية المطروحة على كل إطار فيلم. استخدم مسارا لهذه القيمة لتحديد نقطة الصفر الزمنية للتجربة (الشكل 3 أ). حدد وقت البدء من خلال إيجاد الإطار الأول الذي يتجاوز فيه معدل الزيادة 3x الانحراف المعياري لمعدل التغيير أثناء تدفق الحجم الميت.
      ملاحظة: تشير الزيادة الحادة في معدل التغير في متوسط قيمة الخلفية المطروحة لكل إطار فيلم إلى الوقت الذي دخل فيه المخزن المؤقت التجريبي النهائي الذي يحتوي على صبغة التتبع إلى خلية التدفق (الشكل 3B).
2. حساب وتحليل مسار كثافة النقاط الكمومية
   1. احسب الإسقاط الأقصى الكثافة لمجموعة إطارات الأفلام المصححة في الخلفية المسجلة قبل وصول صبغة التتبع. حدد مواقع النقاط الكمومية بدقة بكسل واحد في صورة الإسقاط هذه باستخدام دالة تحديد الذروة مثل pkfnd.
   2. قم بإنشاء مسارات كثافة للنقاط الكمومية الفردية عن طريق حساب متوسط الكثافة في كل إطار فيلم لمنطقة مربعة ثلاث بكسلات لكل جانب يحيط بالموقع الذي يتم إرجاعه بواسطة وظيفة تحديد الذروة.
      ملاحظة: يزيل تصحيح الخلفية الموضح أعلاه القطع الأثرية التي أدخلتها صبغة التتبع. يجب أن تكون مسارات الشدة الناتجة مسطحة نسبيا ، ولكنها لا تزال تتضمن تقلبات شدة تحدث بشكل طبيعي (الشكل 4).
   3. تحديد أحداث اختفاء النقاط الكمومية عن طريق التحليل الإحصائي لمسارات الشدة. لكل مسار كثافة نقطة كمومية ، احسب شدة عتبة أعلى من الحد الأدنى للقيمة بجزء مناسب من الفرق بين القيم القصوى والدنيا لهذا المسار ، اعتمادا على الضوضاء التي لوحظت في المسارات.
      ملاحظة: عادة ما يكون تذبذب شدة النقطة الكمومية أكبر بكثير من تذبذب الخلفية. يمكن تحديد القيمة المناسبة من خلال مقارنة هذه القيم: يجب أن تكون العتبة المحددة أعلى من أعلى قيمة خلفية ، ولكن من الناحية المثالية تكون أقل من أدنى قيمة لتألق النقاط الكمومية. وبالنسبة للبيانات المقدمة، حسبت العتبة المستخدمة لتكون أعلى من القيمة الدنيا لكل مسار مضافا إليها ثلث الفرق بين القيم القصوى والدنيا لذلك المسار. يمكن اعتبار النقطة الكمومية تختفي في آخر نقطة زمنية كانت فيها الكثافة المرصودة في موقعها أعلى من هذه العتبة.
   4. تأكيد أحداث الاختفاء المفترضة. قم بتضمين الأحداث في التحليل النهائي فقط إذا كانت الشدة المرصودة أعلى من نقطة المنتصف بين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للكثافة للمسار لأكثر من نصف إطارات الفيلم قبل وقت الاختفاء وانخفض الانحراف المعياري لمسار الشدة بعد الحدث.
      ملاحظة: يمكن استخدام اختبارات إحصائية أخرى لضمان تسجيل أحداث الاختفاء الصالحة فقط.

النتائج

تقترن خلية التدفق مباشرة بهدف تكبير 60x بفتحة عددية عالية الفتحة على مجهر مقلوب مزود بإضاءة ليزر للتصوير من خلال الهدف TIRF (الشكل 5A). بعد إدخال ركيزة الحمض النووي والتخلص من الحمض النووي الزائد والنقاط الكمومية ، يوجد عادة الآلاف من النقاط الكمومية الفردية في مجال الرؤية (الشكل 5 ب). ترتبط هذه النقاط الكمومية بثبات بالسطح الزجاجي ، ولا تخضع لتعتيم ملحوظ أو ابيضاض كبير على النطاق الزمني للتجربة. ومع ذلك ، إذا تم تدفق مخزن مؤقت يحتوي على كل من المغنيسيوم و REase...

المناقشة

يتم تمييز ركيزة الحمض النووي لهذا الفحص بنقطة كمومية باستخدام مخطط تفاعل من خطوتين باستخدام sulfo-SMCC. يتكون هذا الرابط المتشابك ثنائي الوظيفة من مجموعة إستر NHS التي يمكن أن تتفاعل مع أمين أولي ، وجزء ماليميد يمكن أن يتفاعل مع مجموعة سلفهيدريل²⁰. يتم شحن قليل النيوكليوتيدات الثيولية المستخدمة في تحضير الركيزة في شكلها المؤكسد. من المهم تقليلها وتنقيتها ، كما هو موضح ، قبل الشروع في إجراء الاقتران ، أو سيتم تقليل كفاءة تفاعل الاقتران. من الأهمية بمكان تحضير حلول DTT و sulfo-SMCC الجديدة مباشرة قب...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
3-أمينوبروبيل ثلاثي الإيثوكسيسيلان (APTS)	سيجما ألدريتش	440140-100 مل	يخزن في صندوق مجفف
5 دقائق إيبوكسي	ديفكون	20845	يستخدم لختم جهاز الموائع
الدقيقة أسيتون	فارمكو	329000ACS	يستخدم لتنظيف أغطية الحمام
سونيسر	فيشر Scientific	CPXH موديل 2800	رقم الكتالوج 15-337-410
دورق ، زجاج ، 100 مل
جهاز
Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (ميجاوات 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Succinimidyl valerate له عمر نصف أطول من كربونات السكسينيميديل
قليلة النوكليوتيد	الحيوية تقنيات الحمض النووي المتكاملة	مخصصة - انظر البروتوكول لاعتبارات التصميم	طلب 5 'تعديل البيوتين و HPLC تنقية
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	VWR	0903-5G	تحضير محلول 10 مجم / مل (aq) وتسخينه إلى 95 درجة ؛ C قبل استخدام
أعمدة الدوران لاستبعاد الحجم Centri-Spin-10	Princeton Separations	CS-100 أو CS-101	المستخدمة لتنقية قليل النوكليوتيدات الثيولية بعد تقليل أنابيب الطرد المركزي السندات ثاني كبريتيد
1.5. مل
Coverslips ، 1 بوصة مربعة غطاء زجاجي
حاملات
الماس نقطة عجلة	Dremel	7134	استخدام لحفر الثقوب في خلية تدفق الكوارتز العلوية
dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	بدون وزن ، 7.7 مجم / قارورة
مكبس الحفر الدوارة أداة محطة العمل	Dremel	220-01	يسهل حفر الكوارتز
EcoRV (يستخدم REase لإنشاء بيانات مثال)	New England Biolabs	R0195T أو R0195M	استخدم مخزون 100,000 وحدة / مل لتجنب إضافة الجلسرين الزائد تحقق من REBASE لموردي الإيثانول REases
	الآخرين CAS	64-17-5	المشوه أو 95٪ مقبولة ، وتستخدم لتنظيف أغطية
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra ، اللامائية ، وتخزينها في صندوق مجفف
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	حجم 3 مم × 10 مم ليناسب أسفل رف الغطاء
الفلوريسين	يستخدم Acros Organics	17324	لصنع المخازن المؤقتة
التجريبية فرن الحمل الحراري	بالجاذبية الموثق	9010-0131
استخدام الأدوات المتعددة الدوارة المحمولة	Dremel	8220	لحفر الثقوب في غطاء خلية تدفق الكوارتز
ImagEM X2 EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-23B	تبريد الهواء مناسب لهذه التجربة ، استخدم برنامج HCImage أو ما شابه ذلك للتحكم
فاصل التصوير ، على الوجهين ، جرة لاصقة
، زجاج مع غطاء لولبي ، (حوالي 50 مم قطره × 50 مم ارتفاع)
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	فيشر الكواشف الحيوية	BP214-500	تستخدم لعمل مخزن مؤقت تجريبي باستخدام برنامج
		MATLAB المغنيسيوم	تحليل البيانات
ملاقط معدنية	فيشر براند	16-100-110
ميثوكسي-PEG-Succinimidyl Valerate (ميغاواط 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	يجب أن يكون لكل من PEGs نفس إستر NHS بحيث يكون معدل التفاعل متسقا
لجهاز طرد مركزي دقيق	Eppendorf	5424
محرك مغناطيسي متعدد المواضع	VWR	12621-022
N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9 ، تستخدم لصنع
شاكر مداري عازل CHES وسخان لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة Q	Instruments	1808-0506	مع محول 1808-1061 لأنابيب 24 × 2.0 مل أو 15 × 0.5 مل أنابيب
Parafilm
PE60 (القطر الداخلي 0.76 مم ، القطر الخارجي 1.22 مم)	المسعف		22 G الإبر الحادة مناسبة تماما لهذا الحجم من الأنبوب
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	استخدم بقوة 1x
هيدروكسيد البوتاسيوم	VWR Chemicals BDH	BDH9262	استخدم محلول 1 متر لتنظيف الأغطية
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Quartz Slide ، 1 بوصة مربعة ، 1 مم	مجهر إلكتروني بسمك 1 مم يجب حفر ثقوب Sciences	72250-10	في الزوايا لإدخال أنابيب المدخل والمخرج
الملقط البلاستيكي المقوى	استخدام Rubis	K35a	للتعامل مع أغطية الطبقات وبناء جهاز الموائع
الدقيقة صفائح لاصقة SecureSeal	قطع Grace Biolabs	SA-S-1L	لتشكيل فاصل لجهاز الموائع الدقيقة
مضخة حقنة أحادية القناة للموائع الدقيقة	أنظمة	مضخات العصر الجديدNE-1002X-US	مزودة بحقنة سعة 50 مل وإبرة حادة 22 جم
Slide-a-Lyzer MINI أجهزة غسيل الكلى ، 10 كيلو دالتون MWCO ، 0.1 مل	Thermo Scientific	69570 أو 69572	تستخدم لتبادل المخزن المؤقت أثناء اقتران النقاط الكمومية ببيكربونات الصوديوم الحمض النووي
	EMD Millipore	SX0320	لعمل عازلة لوظائف السطح ؛ 100 ملي متر ، درجة الحموضة 8
كلوريد الصوديوم	ماكرون	7581-12	استخدم لصنع مخازن مؤقتة تجريبية
محلول ثنائي القاعدة لفوسفات الصوديوم (BioUltra ، 0.5 متر في الماء)	Sigma Aldrich	94046	لصنع 100 ملي مولار من فوسفات الصوديوم عازل
أحادي القاعدة لفوسفات الصوديوم (BioUltra ، 5M في الماء)	Sigma Aldrich	74092	لضبط درجة الحموضة ل 100 ملي مولار عازلة فوسفات الصوديوم
Streptavidin من Streptomyces avidinii< / em>	Sigma Aldrich	S4762	يذوب عند 1 مجم / مل ويخزن 25 مل من الليكوتس عند -20؟
Sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	بدون وزن ، 2 مجم / حقنة قارورة
مزودة بمضخة حقنة
			اطلب 5 'Thiol Modifier C6 SS و HPLC purificaiton
نظام التصوير TIRF مع إضاءة ليزر 488 نانومتر	تستخدم العديد من
Tris -HCl	Research Products International	T60050	المصممة خصيصا لصنع المخازن المؤقتة التجريبية
Tris base	JT Baker	4101	المستخدمة لصنع المخازن المؤقتة التجريبية
Tween-20	Sigma	P7949	لعمل الحجب عازلة
خلاط دوامة
Wash-N-Dry Coverslip Rack	علوم المجهر الإلكتروني	70366-16	المستخدمة في تشغيل سطح الأغطية