تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

لا يمكن للنباتات الهروب من الضغوط الحيوية ، على سبيل المثال ، الحشرات التي تتغذى عليها ، لذلك فقد تطورت أنظمة متطورة لاستشعار الإجهاد ونقل الإشارات للكشف عن ثم حماية نفسها من تحديات مثل عشبي¹. عند الجرح أو هجوم عشبي ، تبدأ النباتات استجابات دفاعية سريعة بما في ذلك تراكم حمض الجاسموني النباتي (JA) ليس فقط في موقع الجرحى ولكن أيضا في الأعضاء البعيدة غير التالفة². هذا JA ثم يؤدي كل من الاستجابات الدفاعية في الأنسجة التالفة مباشرة ويحفز بشكل استباقي الدفاعات في الأجزاء غير التالفة من المصنع. في Arabidopsis، تم الكشف عن تراكم JA الناجم عن الجرح في أوراق بعيدة وسليمة في غضون دقائق قليلة من الضرر في مكان آخر في المصنع مما يشير إلى أن إشارة سريعة وطويلة المدى يتم إرسالها من ورقة الجرحى³. وقد اقترح العديد من المرشحين، مثل Ca^{2 +}، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، والإشارات الكهربائية، لتكون بمثابة هذه الإشارات الجرح لمسافات طويلة في النباتات^4،5.

Ca^{2 +} هي واحدة من العناصر رسول الثاني الأكثر تنوعا وفي كل مكان في الكائنات الحية eukaryotic. في النباتات، مضغ كاتربيلر والميكاميكالية تسبب زيادات كبيرة في تركيز Ca²⁺ الخلوية ([Ca²⁺]_cyt) سواء في ورقة الجرحى أو في أوراق بعيدة غير مذبذبة^6،7. يتم تلقي هذه الإشارة Ca^{2 +} الجهازية بواسطة بروتينات الاستشعار Ca^{2 +}داخل الخلية ، والتي تؤدي إلى تنشيط مسارات إشارات الدفاع المصب ، بما في ذلك التمثيل الحيوي JA^8،9. على الرغم من العديد من هذه التقارير التي تدعم أهمية إشارات Ca^{2 +} في استجابات جرح النبات ، فإن المعلومات حول الخصائص المكانية والزمنية لإشارات Ca^{2 +} الناجمة عن الإصابة محدودة.

التصوير في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات Ca²⁺ المشفرة وراثيا هو أداة قوية لرصد وقياس الديناميكيات المكانية والزمنية لإشارات Ca²⁺ . حتى الآن، وقد وضعت إصدارات من أجهزة الاستشعار من هذا القبيل التي تمكن التصور من إشارات Ca^{2 +} على مستوى خلية واحدة، إلى الأنسجة والأعضاء وحتى النباتات كلها¹⁰. وكان أول جهاز استشعار حيوي مشفرة وراثيا لCa^{2 +} المستخدمة في النباتات aequorin البروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا¹¹. على الرغم من أن هذا البروتين chemiluminescent قد استخدمت للكشف عن Ca^{2 +} التغييرات استجابة لضغوط مختلفة في النباتات^{12،13،14،15،16،17،18}، فإنه ليس مناسبا تماما للتصوير في الوقت الحقيقي بسبب إشارة الإنارة منخفضة للغاية التي تنتجها. Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) المستندة إلى Ca^{2 +} المؤشرات، مثل cameleons الأصفر، كما استخدمت بنجاح للتحقيق في ديناميات مجموعة من Ca²⁺ إشارات الأحداث في محطات^{19،20،21،22،23،24}. تتوافق أجهزة الاستشعار هذه مع نهج التصوير وتتكون الأكثر شيوعا من كالمودولين بروتين Ca^{2 +} الملزم (CaM) والببتيد الملزم ل CaM (M13) من سلسلة كيناز ضوء الميوسين ، وكلها تنصهر بين اثنين من بروتينات الفلوروفور ، وعموما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) ومتغير البروتين الفلوري الأصفر (YFP)^10. Ca^{2 +} ملزمة لCAM يعزز التفاعل بين CaM و M13 مما يؤدي إلى تغيير تشكيلي للمستشعر. ويعزز هذا التغيير نقل الطاقة بين CFP وYFP، مما يزيد من كثافة الفلورسينس في YFP مع تقليل انبعاثات الفلورسينس من CFP. رصد هذا التحول من CFP إلى فلورية YFP ثم يوفر مقياسا للزيادة في مستوى Ca^{2 +} . بالإضافة إلى أجهزة الاستشعار FRET هذه، فإن أجهزة الاستشعار الحيوية Ca²⁺ المستندة إلى البروتين الفلوري الواحد (FP)، مثل GCaMP و R-GECO، تتوافق أيضا مع نهج التصوير النباتي وتستخدم على نطاق واسع لدراسة [Ca²⁺] تغييرات_السيت بسبب حساسيتها العالية وسهولة استخدامها^{25و26و27و28و29و30}. تحتوي GCaMPs على GFP واحد معتبدل بشكل دائري (cp) ، ومرة أخرى تنصهر في CaM والببتيد M13. يؤدي التفاعل المعتمد على Ca²⁺بين CaM و M13 إلى تغيير تشكيلي في المستشعر يعزز التحول في حالة البروتونات في cpGFP ، مما يعزز إشارة الفلورسنت. وهكذا، مع ارتفاع مستويات Ca²⁺ ، تزداد إشارة cpGFP.

للتحقيق في ديناميات إشارات Ca^{2 +} المتولدة استجابة للجرح الميكانيكي أو التغذية آكلة الأعشاب ، استخدمنا نباتات أرابيدوسيس ثاليانا المعدلة وراثيا التي تعبر عن متغير GCaMP ، GCaMP3 ، ومجهر مضان واسع المجال⁶. وقد نجح هذا النهج في تصور انتقال سريع لإشارة Ca^{2 +} لمسافات طويلة من موقع الجرح على ورقة إلى النبات بأكمله. وهكذا، تم الكشف عن زيادة في [Ca²⁺]_cyt على الفور في موقع الجرح ولكن تم نشر هذه الإشارة Ca²⁺ بعد ذلك إلى الأوراق المجاورة من خلال الأوعية الدموية في غضون بضع دقائق من الجرح. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن انتقال هذه الإشارة الجرح الجهازية السريعة يتم إلغاؤها في النباتات Arabidopsis مع الطفرات في اثنين من الجينات مثل مستقبلات الغلوتامات، ومستقبلات الغلوتامات مثل (GLR)، GLR3.3، وGLR3.6⁶. وGLRs يبدو أن تعمل كأحماض أمينية مسور Ca^{2 +} قنوات المشاركة في العمليات الفسيولوجية المتنوعة, بما في ذلك استجابة الجرح³, نمو أنبوب حبوب اللقاح³¹, تطوير الجذر³², استجابة الباردة³³, والمناعة الفطرية³⁴. على الرغم من هذه الوظيفة الفسيولوجية الواسعة المفهومة جيدا ل GLRs ، فإن المعلومات حول خصائصها الوظيفية ، مثل خصوصية الليغند ، والانتقائية الأيونية ، والتوطين دون الخلوي ، محدودة^35. ومع ذلك، ذكرت الدراسات الحديثة أن GLR3.3 و GLR3.6 مترجمة في phloem وxylem، على التوالي. GLRs النباتية لها أوجه تشابه مع مستقبلات الغلوتامات الأيونية (iGluRs)³⁶ في الثدييات ، والتي يتم تنشيطها عن طريق الأحماض الأمينية ، مثل الغلوتامات والجليسين وD-سيرين في الجهاز العصبي للثدييات³⁷. في الواقع، أثبتنا أن تطبيق الغلوتامات 100 mM، ولكن ليس غيرها من الأحماض الأمينية، في موقع الجرح يحفز سريعة، لمسافات طويلة Ca^{2+ إشارة} في Arabidopsis،مما يشير إلى أن الغلوتامات خارج الخلية من المرجح أن يكون بمثابة إشارة الجرح في النباتات⁶. يتم إلغاء هذا الرد في glr3.3/glr3.6 متحولة مما يوحي بأن الغلوتامات قد يكون يتصرف من خلال واحدة أو كل من هذه القنوات مثل مستقبلات وبالفعل, AtGLR3.6 وقد تبين مؤخرا أن بوابات من قبل هذه المستويات من الغلوتامات³⁸.

في النباتات، بالإضافة إلى دورها كحامض أميني هيكلي، كما اقترح الغلوتامات كمنظم التنمية الرئيسية^39؛ ومع ذلك، فإن دينامياتها المكانية والزمنية غير مفهومة بشكل جيد. تماما كما لCa^{2 +}, وقد وضعت العديد من المؤشرات المشفرة وراثيا للغلوتامات لرصد ديناميات هذه الأحماض الأمينية في الخلايا^{الحية 40,41}. iGluSnFR هو GFP القائم على واحد FP الجلوتامات الاستشعار الحيوي تتألف من cpGFP وبروتين ملزم الغلوتامات (GltI) من الإشريكية القولونية^42،43. التغيير التوافقي ل iGluSnFR ، الذي يسببه ربط الغلوتامات ب GltI ، يؤدي إلى انبعاث فلوري GFP معزز. للتحقيق في ما إذا كان الغلوتامات خارج الخلية بمثابة جزيء إشارة في استجابة جرح النبات ، قمنا بتوصيل تسلسل iGluSnFR مع تسلسل إفراز الببتيد الأساسي للإشارة الشيتاتينية (CHIB-iGluSnFR) لتعريب هذا الاستشعار الحيوي في الفضاء المبرمج⁶. مكن هذا النهج التصوير من أي تغييرات في تركيز الغلوتامات المبرمج ([غلو]_آبو) باستخدام النباتات أربيدوبسيس المعدلة وراثيا التعبير عن هذا الاستشعار. اكتشفنا زيادات سريعة في إشارة iGluSnFR في موقع الجرح. هذه البيانات تدعم فكرة أن تسرب الغلوتامات من الخلايا التالفة / الأنسجة إلى أبوبلاست عند الجرح ويعمل كإشارة ضرر تفعيل GLRs ويؤدي إلى إشارة Ca^{2 +} لمسافات طويلة في النباتات⁶.

هنا، ونحن نصف طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لرصد وتحليل ديناميات إشارات Ca^{2 +} بعيدة المدى والجلوتامات خارج الخلية ردا على الجرح⁶. يوفر توافر المجهر الفلوري واسع المجال والنباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا نهجا قويا ، ولكن يسهل تنفيذه للكشف عن الإشارات البعيدة المدى التي تنتقل بسرعة ، مثل موجات Ca^{2 +} .

1. إعداد المواد النباتية

1. في 1.5 مل ميكروبتوب، سطح تعقيم بذور أربيدوبسيس تاليانا (كول-0 الانضمام) مصنع التعبير عن إما GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR عن طريق هز مع 20٪ (v/v) NaClO لمدة 3 دقائق ثم يغسل 5 مرات مع الماء المقطر العقيم.
   ملاحظة: خطوط المعدلة وراثيا من Arabidopsis التعبير عن GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR وقد وصفت سابقا⁶.
2. في غطاء محرك السيارة العقيم، زرع 13 بذور تعقيم السطح على طبق بيتري البلاستيك 10 سم مربع مليئة 30 مل معقمة (autoclaved) موراشيج وسكوغ (MS) المتوسطة [1x أملاح MS، 1٪ (ث/v) السكروز، 0.01٪ (ث/v) ميوينوزيتول، 0.05٪ (ث/v) MES و0.5٪ (ث/v) علكة الجيلان؛ درجة الحموضة 5.7 معدلة مع 1N KOH]. استبدل الغطاء والتفاف مع الشريط الجراحي.
3. بعد الحضانة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة يومين، ضع اللوحات أفقيا عند 22 درجة مئوية في غرفة نمو تحت ضوء مستمر (90-100 ميكرومول م^{-2 ثانية -1)}لمدة أسبوعين تقريبا قبل الاستخدام. بعد أسبوعين، عد عدد أوراق أرابيدوسيس من أكبر إلى أصغر⁴⁴ (الشكل 1). استجابات الجرح تتحرك بشكل تفضيلي من ورقة التالفة (ن) إلى أوراق مرقم ن ± 3 و n ± 5⁶.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، سيتم فتح طبق بيتري لتصوير آثار الجرح والغلوتامات تحت المجهر الفلوري. لذلك، ينبغي أن تتم الخطوات اللاحقة في هذه التجربة في ظل ظروف الغرفة التي تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة. وذلك لأن إشارات Ca²⁺ يتم الحصول عليها أيضا من خلال التغيرات في هذه الظروف البيئية. ومن المعروف أيضا أن الضوء الأزرق، المنبعث من المجهر أثناء التسجيل لإثارة مضان بروتين الاستشعار الحيوي، قد يثير زيادة في تركيز Ca^{2+ 45} الخلوية، وبالتالي يجب أن تتكيف مع النبات لتشعيع الضوء الأزرق لعدة دقائق قبل بدء التجربة.

2. التحضير الكيميائي

1. حل L-الجلوتامات في وسط نمو سائل [أملاح MS 1/2x، 1٪ (ث / v) السكروز و 0.05٪ (ث / v) MES؛ درجة الحموضة 5.1 المعدلة مع 1N KOH] لجعل حل عمل 100 mM.
   ملاحظة: تجنب استخدام أملاح الغلوتامات مثل الغلوتامات الصوديوم لمنع الآثار المحتملة المرتبطة بالتكون على ديناميكيات Ca²⁺ .

3. إعداد المجهر وإجراء التصوير في الوقت الحقيقي

1. قم بتشغيل مجسم المجسم المفلور المزود بعدسة هدف 1x (NA = 0.156) وكاميرا sCMOS(الشكل 2)وتكوين إعدادات الجهاز لتشعيعها بضوء إثارة 470/40 نانومتر والحصول على ضوء انبعاث يمر عبر فلتر 535/50 نانومتر.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر مضان حساس ل GFP للكشف عن إشارات GCaMP3 و iGluSnFR في الوقت الفعلي ، ولكن يوصى بعدسة موضوعية منخفضة الطاقة وكاميرا حساسة للغاية مع رقاقة sCMOS واسعة للحصول على إشارات من المصنع بأكمله. يسمح هدف الطاقة المنخفضة بتصوير استجابة محطة Arabidopsis بأكملها واستخدام كاميرا حساسة للغاية يسمح بالحصول السريع على البيانات اللازمة لالتقاط المسار الزمني السريع لموجة Ca²⁺ التي تسببها الجروح. بالنسبة للمجهر الفلوري المستخدم في هذه الدراسة، فإن القيم القصوى لمجال الرؤية والدقة الزمنية هي 3 سم × 3 سم و 30 إطارا في الثانية (FPS)، على التوالي.
2. إزالة الغطاء ووضع الطبق تحت العدسة الهدف.
3. تحقق من إشارة الفلورسينس من المصنع ثم انتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا في الظلام حتى تتكيف النباتات مع الظروف البيئية الجديدة. هذه الخطوة التكيف مطلوب لأن التغيرات في الرطوبة تثير [Ca²⁺] ارتفاع_سيت في النباتات التي يمكن أن تتداخل مع أي أحداث ذات صلة بالجروح.
4. ضبط التركيز والتكبير لرؤية المصنع كله في مجال الرؤية. في البروتوكول الحالي، تم استخدام تكبير 0.63x.
5. قبل البدء في التصوير في الوقت الحقيقي، قم بإعداد معلمات الاستحواذ للكشف عن إشارات الفلورسينس باستخدام برنامج تصوير المجهر. إعدادات التصوير في البروتوكول الحالي هي: التعرض وأوقات الفاصل الزمني المحددة إلى 1.8 ثانية و 2 ثانية (أي 0.5 إطارا في الثانية) على التوالي. تعيين وقت التسجيل إلى 11 دقيقة.
6. صورة لمدة 5 دقائق قبل بدء التجربة لتأقلم النبات مع تشعيع الضوء الأزرق من المجهر ، ثم بدء التسجيل عن طريق النقر على تشغيل الآن، أو الأمر المكافئ في برنامج المجهر المستخدم. لتحديد متوسط مضان خط الأساس، سجل ما لا يقل عن 10 إطارات (أي 20 s على الأقل في البروتوكول الحالي) قبل الجرح أو تطبيق الغلوتامات (انظر القسم 4).
   1. للتصوير في الوقت الحقيقي من الجرح الناجم [Ca^{2 +}]_{cyt و [غلو] apo} التغييرات، وقطع petiole أو المنطقة الوسطى من ورقة L1 مع مقص (الشكل 3 والشكل 4).
   2. للتصوير في الوقت الحقيقي من الغلوتامات التي أثارها [Ca^{2 +}] تغييرات_سيت، وقطع حافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 عبر الوريد الرئيسي مع مقص. بعد فترة نقاهة لا تقل عن 20 دقيقة، ضعي 10 ميكرولتر من الغلوتامات 100 م على سطح الورقة المقطوع(الشكل 5).
      ملاحظة: كان هذا القطع المسبق ضروريا للسماح بوصول الغلوتامات إلى النبات المبرمج من أجل تحريك الاستجابات. وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على تطبيق قطرة من الماء المقطر على سطح قطع من ورقة L1 أن تكون حاسمة لمنع العينات من الجفاف أثناء الانتعاش قبل تطبيق الغلوتامات.
7. بعد الانتهاء من تسجيل 11 دقيقة، حفظ البيانات.

4. تحليل البيانات

1. لتحليل كثافة الفلورية مع مرور الوقت، حدد منطقة الاهتمام (ROI) في المكان الذي يتم فيه تحليل كثافة الفلورسينس(الشكل 6 والشكل 7). لحساب سرعة موجة Ca²⁺ ، حدد 2 ROIs (ROI1 و ROI2) للتحليل. في برنامج التصوير، انقر على | قياس الوقت تعريف | دائرة. قياس المسافة بين ROI1 و ROI2 بالنقر على التعليقات التوضيحية والقياس | طول | خط بسيط (الشكل 6).
2. قياس قيم الفلورسينس الخام (F) في كل عائد استثمار مع مرور الوقت عن طريق النقر على قياس. تصدير البيانات الخام إلى برنامج جدول البيانات لتحويل إشارة مضان إلى أرقام في كل نقطة زمنية عن طريق النقر على الكل إلى Excel | تصدير.
3. تحديد قيمة الفلورسينس الأساسية، التي تعرف بأنها F_0،عن طريق حساب متوسط F على الإطارات العشرة الأولى (أي قبل المعالجة) في البيانات المسجلة.
4. تطبيع البيانات F (عن طريق حساب ΔF / F) باستخدام المعادلة ΔF / F = (F−F₀) / F₀، حيث ΔF هو التغير المعتمد على الوقت في الفلورسينس.
5. بالنسبة لتحليل^{موجة سرعة الموجة Ca 2+} ، حدد نقطة ارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا على أنها تمثل اكتشاف زيادة Ca^{2 +} في كل عائد استثمار(t₁ و t₂₎باستخدام معيار الارتفاع إلى 2× الانحراف المعياري (2x SD) الذي يتم حسابه من بيانات F₀ باستخدام البرامج الإحصائية. 95٪ من بيانات F₀ تقع ضمن 2x SD من المتوسط، مما يشير إلى أن ارتفاع الإشارة فوق هذا المستوى عن طريق الصدفة هو ≤5٪. حساب الفرق الزمني للزيادة Ca^{2 +} بين ROI1 و ROI2 [t₂- t₁ time-lag (Δt)] وقياس المسافة بين ROI1 و ROI2 ، ثم تحديد سرعات أي موجة Ca^{2 +} .

يتم عرض نشر إشارة [Ca2 +]cyt و [Glu] apo ردا على الجرح في الشكل 3، الشكل 4، فيلم S1، والفيلم S2. قطع petiole من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (في 0 ق) أدى إلى زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt التي تم حثها بسرعة محليا من خلال الأوعية الدموية (في 40 ق) (الشكل 3 والفيلم S1). في وقت لاحق، تم نشر إشارة بسرعة إلى الأوراق المجاورة (ورقة 3 و 6) في غضون بضع دقائق (في 80 ق)(الشكل 3 والفيلم S1).

عند قطع ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR، لوحظت زيادة سريعة [غلو]آبو في جميع أنحاء منطقة القطع (في 2 ق). تم نشر هذه الإشارة من خلال الأوعية الدموية محليا في غضون دقائق قليلة (في 160 ق) ولكن لم يلاحظ في الأوراق النظامية(الشكل 4 والفيلم S2).

للتصوير في الوقت الحقيقي من Ca2 + نشر إشارة الناجمة عن تطبيق الغلوتامات، تم قطع الحافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 كما هو مبين في الشكل 5A والفيلم S3. قطع حافة ورقة 1 تسبب المحلية [Ca2 +]زيادة cyt (في 40 ق) ولكن هذه الإشارة اختفت في غضون بضع دقائق (في 124 ق). بعد انتظار ما يقرب من 10 دقيقة للمصنع لاسترداد, 10 μL من 100 mM الغلوتامات تم تطبيقها على سطح قطع ورقة 1, مما تسبب في زيادة سريعة وكبيرة من [Ca2+] سيت محليا (في 56 ق) وانتشارإشارة إلى أوراق البعيدة (في 104 ق) (الشكل 5B والفيلم S4).

لقياس التغيرات في [Ca2 +]cyt الناجمة عن الجرح في ورقة النظامية، تم تعيين اثنين من ROIs (ROI1 و ROI2) في منطقة قاعدة وطرف من ورقة 6 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 كما هو مبين في الشكل 6A. تم قياس تغيير المسار الزمني لكثافة إشارة GCaMP3 في ROI1 و ROI2 عند قطع البتول من ورقة 1 (الشكل 6B). تم الكشف عن زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt في ROI1 في وقت أبكر من ROI2 (الشكل 6B). [Ca2+] بلغت ذروتها في حوالي 100 s cyt بعد الجرح، واستمرت لأكثر من 10 دقيقة، وعرضت مرحلتين(الشكل 6B).

لتحديد سرعات موجة Ca2+ عند الإصابة الميكانيكية، تم تحديد النقطة الزمنية لارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا في ROI1 و ROI2 (الفارق الزمني؛ انظر القسم 4) (الشكل 6C). لأن المسافة بين ROI1 و ROI2 كانت 2.7 مم في هذه الحالة (الشكل 6A)، تم حسابسرعة إشارة Ca 2+ في الورقة 6 على أنها 0.15 مم / ثانية. لقياس التغيرات [غلو]آبو ردا على الضرر الميكانيكي، تم تعيين ROI1 في محيط موقع قطع ورقة ملحوظ كما L1 كما هو مبين في الشكل 7A. [غلو] وقد أظهرت توقيع آبو في ROI1 ذروة واحدة في حوالي 100 ق عند الجرح(الشكل 7B).

الشكل 1: ترقيم أوراق وردية Arabidopsis. يتم ترقيم أوراق Arabidopsis من الأكبر سنا إلى الأصغر (اللوحة اليسرى). يتم الإشارة إلى رسم تخطيطي لموقف الأوراق في اللوحة اليمنى. L: ورقة، C: كوتيلونس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:تم تصويرمجهر مضان يستخدم في هذه الدراسة. [Ca2+]cyt و [Glu]apo ديناميات مع مجسم مفلور واسع المجال. R: وحدة تحكم عن بعد، O: عدسة الهدف 1x، C: كاميرا sCMOS، T: أنبوب إمالة Trinocular، S: المرحلة، P: المواد النباتية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:الجرح الناجم عن المسافات الطويلة Ca 2 + إرسالإشارة. قطع petiole (السهم الأبيض، 0 ق) من ورقة 1 (L1) في النبات التعبير عن GCaMP3 أثار المحلية [Ca2 +]زيادة سيت (السهم الأحمر، 40 ق) التي انتقلت إلى أوراق النظامية [ورقة 3 (L3) وورقة 6 (L6)] (السهام البرتقالية، 80 s). شريط المقياس، 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الجرح الناجم عن [غلو] ارتفاعآبو. قطع ورقة 1 (L1) (السهم الأبيض، 0 ق) في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR تسبب ارتفاع سريع من [غلو]آبو (السهم الأحمر، 80 ق) التي انتشرت من خلال الأوعية الدموية (السهم البرتقالي، 160 ق). شريط المقياس، 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الغلوتامات التي أثارها لمسافات طويلة Ca2 + نقل إشارة. (أ) قطع الحافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 (L1) في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (السهم الأبيض, 0 ق) تسبب في زيادة [Ca2 +]cyt (السهم الأحمر, 40 ق). (ب)تطبيق الغلوتامات 100 mM على سطح قطع L1 (السهم الأبيض، 0 s) تسبب المحلية [Ca2+]زيادة السيت (السهم الأحمر، 56 ق) التي انتشرت بسرعة إلى أوراق البعيدة [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3)، ورقة 4 (L4)، وورقة 6 (L6)] (السهام البرتقالية، 104 ق). أشرطة المقياس، 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: [Ca2+] توقيعالسيت في الأوراق النظامية استجابة للجرح الميكانيكي. (A) تظهر صورة موسعة للورقة 6 (L6) في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 في الشكل 3. تم تعيين ROI1 (الدائرة الزرقاء) و ROI2 (الدائرة الوردية) في منطقة القاعدة والطرف ، على التوالي. يشير السهم الأبيض إلى موقع القطع من البتيول ورقة 1 (L1). في هذه الحالة، كانت المسافة بين ROI1 و ROI2 2.7 مم (B) كميا [Ca2+] توقيعاتالسيت في ROI1 و ROI2. تم تحليل تغيرات كثافة الفلورسينس باستخدام برامج التصوير. (ج)أثر موسع للبيانات في (ب) بين 0 s و 80 s. تم تعريف نقاط الكشف عن زيادة Ca2+ في ROI1 و ROI2 على أنها t1 و t2، على التوالي ، باستخدام معيار ارتفاع إلى 2x الانحراف المعياري لقيم التحفيز المسبق (2x SD ، خط منقط). تم تعريف قيمة t2 - t1 على أنها الفارق الزمني(Δt)في البروتوكول الحالي. السهم الأسود يشير إلى وقت القطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: [غلو]apo التوقيع ردا على الجرح الميكانيكي. (أ) صورة موسعة من ورقة 1 (L1) في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR يظهر في الشكل 4. تم تعيين ROI1 في المنطقة المجاورة لموقع القطع. يشير السهم الأبيض إلى منطقة القطع. (ب)يتم رصد كمية [Glu]apo التوقيع في ROI1 باستخدام برامج التصوير. السهم الأسود يشير إلى وقت القطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم S1: طويل المسافة Ca2 + انتقال بعد الجرح الميكانيكي. تسبب الجرح الميكانيكي في petiole من ورقة 1 (L1) زيادة [Ca2 +]cyt تنتقل إلى أوراق البعيدة [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3) وورقة 6 (L6)]. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S2: ارتفاع مستويات الغلوتامات المبرمج استجابة للقطع. تسبب الجرح الميكانيكي للرقة 1 (L1) في زيادة فورية في [غلو]آبو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S3: ارتفاع [Ca2 +]مستوياتcyt ردا على القطع. تسبب الجرح الميكانيكي على حافة ورقة 1 (L1) على الفور، المحلية [Ca2 +] ارتفاعcyt. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S4: تطبيق الغلوتامات مشغلات النظامية [Ca2+]يزيدسيت. تطبيق الغلوتامات 100 mM أثار Ca2 + انتقال إلى أوراق الجهازية [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3)، ورقة 4 (L4) وورقة 6 (L6)]. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.