يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

4.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62114

⸱

يونيو 4, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

إن إشارات الكالسيوم الجهازية التي تسببها الغلوتامات خارج الخلية أمر بالغ الأهمية لتحريض استجابات الدفاع النباتي على الجرح الميكانيكي وهجوم الحيوانات العاشبة في النباتات. توضح هذه المقالة طريقة لتصور الديناميكيات المكانية والزمنية لكل من هذين العاملين باستخدام نباتات Arabidopsis thaliana التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية الحساسة للكالسيوم والغلوتامات.

الملخص

تستجيب النباتات للضغوط الميكانيكية مثل الجرح وآكلي الأعشاب من خلال تحفيز الاستجابات الدفاعية سواء في الأجزاء التالفة أو البعيدة. عند جرح ورقة، تحدث زيادة في تركيز أيونات الكالسيوم الخلوية (Ca2+ إشارة) في موقع الجرح. يتم إرسال هذه الإشارة بسرعة إلى الأوراق غير التالفة ، حيث يتم تنشيط الاستجابات الدفاعية. كشفت أبحاثنا الأخيرة أن الغلوتامات المتسربة من الخلايا المصابة من الورقة إلى الأبوبلاست من حولهم بمثابة إشارة جرح. هذا الغلوتامات ينشط مستقبلات الغلوتامات مثل قنوات Ca2+ نفاذية، مما يؤدي بعد ذلك إلى انتشار إشارة Ca2+ لمسافات طويلة في جميع أنحاء المصنع. ويمكن التقاط الخصائص المكانية والزمانية لهذه الأحداث من خلال التصوير في الوقت الحقيقي للنباتات الحية التي تعبر عن أجهزة الاستشعار البيولوجية الفلورية المشفرة وراثيا. هنا نقدم طريقة تصوير على مستوى النبات في الوقت الحقيقي لمراقبة ديناميكيات كل من إشارات Ca2 + والتغيرات في الغلوتامات المبرمج التي تحدث استجابة للإصابة. يستخدم هذا النهج مجهر مضان واسع المجال ونباتات أربيدوبسي المعدلة وراثيا تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) القائم على Ca2+ و أجهزة الاستشعار الحيوية الغلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، نقدم منهجية للحصول بسهولة على انتشار إشارة Ca2+ الناجم عن الجروح والغلوتامات. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الدراسات المتعلقة بضغوط النباتات الأخرى للمساعدة في التحقيق في كيفية مشاركة الإشارات النظامية النباتية في شبكات الإشارات والاستجابة الخاصة بها.

المقدمة

لا يمكن للنباتات الهروب من الضغوط الحيوية ، على سبيل المثال ، الحشرات التي تتغذى عليها ، لذلك فقد تطورت أنظمة متطورة لاستشعار الإجهاد ونقل الإشارات للكشف عن ثم حماية نفسها من تحديات مثل عشبي1. عند الجرح أو هجوم عشبي ، تبدأ النباتات استجابات دفاعية سريعة بما في ذلك تراكم حمض الجاسموني النباتي (JA) ليس فقط في موقع الجرحى ولكن أيضا في الأعضاء البعيدة غير التالفة2. هذا JA ثم يؤدي كل من الاستجابات الدفاعية في الأنسجة التالفة مباشرة ويحفز بشكل استباقي الدفاعات في الأجزاء غير التالفة من المصنع. في Arabidopsis، تم الكشف عن تراكم JA الناجم عن الجرح في أوراق بعيدة وسليمة في غضون دقائق قليلة من الضرر في مكان آخر في المصنع مما يشير إلى أن إشارة سريعة وطويلة المدى يتم إرسالها من ورقة الجرحى3. وقد اقترح العديد من المرشحين، مثل Ca2 +، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، والإشارات الكهربائية، لتكون بمثابة هذه الإشارات الجرح لمسافات طويلة في النباتات4،5.

Ca2 + هي واحدة من العناصر رسول الثاني الأكثر تنوعا وفي كل مكان في الكائنات الحية eukaryotic. في النباتات، مضغ كاتربيلر والميكاميكالية تسبب زيادات كبيرة في تركيز Ca2+ الخلوية ([Ca2+]cyt) سواء في ورقة الجرحى أو في أوراق بعيدة غير مذبذبة6،7. يتم تلقي هذه الإشارة Ca2 + الجهازية بواسطة بروتينات الاستشعار Ca2 +داخل الخلية ، والتي تؤدي إلى تنشيط مسارات إشارات الدفاع المصب ، بما في ذلك التمثيل الحيوي JA8،9. على الرغم من العديد من هذه التقارير التي تدعم أهمية إشارات Ca2 + في استجابات جرح النبات ، فإن المعلومات حول الخصائص المكانية والزمنية لإشارات Ca2 + الناجمة عن الإصابة محدودة.

التصوير في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا هو أداة قوية لرصد وقياس الديناميكيات المكانية والزمنية لإشارات Ca2+ . حتى الآن، وقد وضعت إصدارات من أجهزة الاستشعار من هذا القبيل التي تمكن التصور من إشارات Ca2 + على مستوى خلية واحدة، إلى الأنسجة والأعضاء وحتى النباتات كلها10. وكان أول جهاز استشعار حيوي مشفرة وراثيا لCa2 + المستخدمة في النباتات aequorin البروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا11. على الرغم من أن هذا البروتين chemiluminescent قد استخدمت للكشف عن Ca2 + التغييرات استجابة لضغوط مختلفة في النباتات12،13،14،15،16،17،18، فإنه ليس مناسبا تماما للتصوير في الوقت الحقيقي بسبب إشارة الإنارة منخفضة للغاية التي تنتجها. Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) المستندة إلى Ca2 + المؤشرات، مثل cameleons الأصفر، كما استخدمت بنجاح للتحقيق في ديناميات مجموعة من Ca2+ إشارات الأحداث في محطات19،20،21،22،23،24. تتوافق أجهزة الاستشعار هذه مع نهج التصوير وتتكون الأكثر شيوعا من كالمودولين بروتين Ca2 + الملزم (CaM) والببتيد الملزم ل CaM (M13) من سلسلة كيناز ضوء الميوسين ، وكلها تنصهر بين اثنين من بروتينات الفلوروفور ، وعموما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) ومتغير البروتين الفلوري الأصفر (YFP)10. Ca2 + ملزمة لCAM يعزز التفاعل بين CaM و M13 مما يؤدي إلى تغيير تشكيلي للمستشعر. ويعزز هذا التغيير نقل الطاقة بين CFP وYFP، مما يزيد من كثافة الفلورسينس في YFP مع تقليل انبعاثات الفلورسينس من CFP. رصد هذا التحول من CFP إلى فلورية YFP ثم يوفر مقياسا للزيادة في مستوى Ca2 + . بالإضافة إلى أجهزة الاستشعار FRET هذه، فإن أجهزة الاستشعار الحيوية Ca2+ المستندة إلى البروتين الفلوري الواحد (FP)، مثل GCaMP و R-GECO، تتوافق أيضا مع نهج التصوير النباتي وتستخدم على نطاق واسع لدراسة [Ca2+] تغييراتالسيت بسبب حساسيتها العالية وسهولة استخدامها25و26و27و28و29و30. تحتوي GCaMPs على GFP واحد معتبدل بشكل دائري (cp) ، ومرة أخرى تنصهر في CaM والببتيد M13. يؤدي التفاعل المعتمد على Ca2+بين CaM و M13 إلى تغيير تشكيلي في المستشعر يعزز التحول في حالة البروتونات في cpGFP ، مما يعزز إشارة الفلورسنت. وهكذا، مع ارتفاع مستويات Ca2+ ، تزداد إشارة cpGFP.

للتحقيق في ديناميات إشارات Ca2 + المتولدة استجابة للجرح الميكانيكي أو التغذية آكلة الأعشاب ، استخدمنا نباتات أرابيدوسيس ثاليانا المعدلة وراثيا التي تعبر عن متغير GCaMP ، GCaMP3 ، ومجهر مضان واسع المجال6. وقد نجح هذا النهج في تصور انتقال سريع لإشارة Ca2 + لمسافات طويلة من موقع الجرح على ورقة إلى النبات بأكمله. وهكذا، تم الكشف عن زيادة في [Ca2+]cyt على الفور في موقع الجرح ولكن تم نشر هذه الإشارة Ca2+ بعد ذلك إلى الأوراق المجاورة من خلال الأوعية الدموية في غضون بضع دقائق من الجرح. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن انتقال هذه الإشارة الجرح الجهازية السريعة يتم إلغاؤها في النباتات Arabidopsis مع الطفرات في اثنين من الجينات مثل مستقبلات الغلوتامات، ومستقبلات الغلوتامات مثل (GLR)، GLR3.3، وGLR3.66. وGLRs يبدو أن تعمل كأحماض أمينية مسور Ca2 + قنوات المشاركة في العمليات الفسيولوجية المتنوعة, بما في ذلك استجابة الجرح3, نمو أنبوب حبوب اللقاح31, تطوير الجذر32, استجابة الباردة33, والمناعة الفطرية34. على الرغم من هذه الوظيفة الفسيولوجية الواسعة المفهومة جيدا ل GLRs ، فإن المعلومات حول خصائصها الوظيفية ، مثل خصوصية الليغند ، والانتقائية الأيونية ، والتوطين دون الخلوي ، محدودة35. ومع ذلك، ذكرت الدراسات الحديثة أن GLR3.3 و GLR3.6 مترجمة في phloem وxylem، على التوالي. GLRs النباتية لها أوجه تشابه مع مستقبلات الغلوتامات الأيونية (iGluRs)36 في الثدييات ، والتي يتم تنشيطها عن طريق الأحماض الأمينية ، مثل الغلوتامات والجليسين وD-سيرين في الجهاز العصبي للثدييات37. في الواقع، أثبتنا أن تطبيق الغلوتامات 100 mM، ولكن ليس غيرها من الأحماض الأمينية، في موقع الجرح يحفز سريعة، لمسافات طويلة Ca2+ إشارة في Arabidopsis،مما يشير إلى أن الغلوتامات خارج الخلية من المرجح أن يكون بمثابة إشارة الجرح في النباتات6. يتم إلغاء هذا الرد في glr3.3/glr3.6 متحولة مما يوحي بأن الغلوتامات قد يكون يتصرف من خلال واحدة أو كل من هذه القنوات مثل مستقبلات وبالفعل, AtGLR3.6 وقد تبين مؤخرا أن بوابات من قبل هذه المستويات من الغلوتامات38.

في النباتات، بالإضافة إلى دورها كحامض أميني هيكلي، كما اقترح الغلوتامات كمنظم التنمية الرئيسية39؛ ومع ذلك، فإن دينامياتها المكانية والزمنية غير مفهومة بشكل جيد. تماما كما لCa2 +, وقد وضعت العديد من المؤشرات المشفرة وراثيا للغلوتامات لرصد ديناميات هذه الأحماض الأمينية في الخلاياالحية 40,41. iGluSnFR هو GFP القائم على واحد FP الجلوتامات الاستشعار الحيوي تتألف من cpGFP وبروتين ملزم الغلوتامات (GltI) من الإشريكية القولونية42،43. التغيير التوافقي ل iGluSnFR ، الذي يسببه ربط الغلوتامات ب GltI ، يؤدي إلى انبعاث فلوري GFP معزز. للتحقيق في ما إذا كان الغلوتامات خارج الخلية بمثابة جزيء إشارة في استجابة جرح النبات ، قمنا بتوصيل تسلسل iGluSnFR مع تسلسل إفراز الببتيد الأساسي للإشارة الشيتاتينية (CHIB-iGluSnFR) لتعريب هذا الاستشعار الحيوي في الفضاء المبرمج6. مكن هذا النهج التصوير من أي تغييرات في تركيز الغلوتامات المبرمج ([غلو]آبو) باستخدام النباتات أربيدوبسيس المعدلة وراثيا التعبير عن هذا الاستشعار. اكتشفنا زيادات سريعة في إشارة iGluSnFR في موقع الجرح. هذه البيانات تدعم فكرة أن تسرب الغلوتامات من الخلايا التالفة / الأنسجة إلى أبوبلاست عند الجرح ويعمل كإشارة ضرر تفعيل GLRs ويؤدي إلى إشارة Ca2 + لمسافات طويلة في النباتات6.

هنا، ونحن نصف طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لرصد وتحليل ديناميات إشارات Ca2 + بعيدة المدى والجلوتامات خارج الخلية ردا على الجرح6. يوفر توافر المجهر الفلوري واسع المجال والنباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا نهجا قويا ، ولكن يسهل تنفيذه للكشف عن الإشارات البعيدة المدى التي تنتقل بسرعة ، مثل موجات Ca2 + .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد المواد النباتية

  1. في 1.5 مل ميكروبتوب، سطح تعقيم بذور أربيدوبسيس تاليانا (كول-0 الانضمام) مصنع التعبير عن إما GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR عن طريق هز مع 20٪ (v/v) NaClO لمدة 3 دقائق ثم يغسل 5 مرات مع الماء المقطر العقيم.
    ملاحظة: خطوط المعدلة وراثيا من Arabidopsis التعبير عن GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR وقد وصفت سابقا6.
  2. في غطاء محرك السيارة العقيم، زرع 13 بذور تعقيم السطح على طبق بيتري البلاستيك 10 سم مربع مليئة 30 مل معقمة (autoclaved) موراشيج وسكوغ (MS) المتوسطة [1x أملاح MS، 1٪ (ث/v) السكروز، 0.01٪ (ث/v) ميوينوزيتول، 0.05٪ (ث/v) MES و0.5٪ (ث/v) علكة الجيلان؛ درجة الحموضة 5.7 معدلة مع 1N KOH]. استبدل الغطاء والتفاف مع الشريط الجراحي.
  3. بعد الحضانة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة يومين، ضع اللوحات أفقيا عند 22 درجة مئوية في غرفة نمو تحت ضوء مستمر (90-100 ميكرومول م-2 ثانية -1)لمدة أسبوعين تقريبا قبل الاستخدام. بعد أسبوعين، عد عدد أوراق أرابيدوسيس من أكبر إلى أصغر44 (الشكل 1). استجابات الجرح تتحرك بشكل تفضيلي من ورقة التالفة (ن) إلى أوراق مرقم ن ± 3 و n ± 56.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، سيتم فتح طبق بيتري لتصوير آثار الجرح والغلوتامات تحت المجهر الفلوري. لذلك، ينبغي أن تتم الخطوات اللاحقة في هذه التجربة في ظل ظروف الغرفة التي تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة. وذلك لأن إشارات Ca2+ يتم الحصول عليها أيضا من خلال التغيرات في هذه الظروف البيئية. ومن المعروف أيضا أن الضوء الأزرق، المنبعث من المجهر أثناء التسجيل لإثارة مضان بروتين الاستشعار الحيوي، قد يثير زيادة في تركيز Ca2+ 45 الخلوية، وبالتالي يجب أن تتكيف مع النبات لتشعيع الضوء الأزرق لعدة دقائق قبل بدء التجربة.

2. التحضير الكيميائي

  1. حل L-الجلوتامات في وسط نمو سائل [أملاح MS 1/2x، 1٪ (ث / v) السكروز و 0.05٪ (ث / v) MES؛ درجة الحموضة 5.1 المعدلة مع 1N KOH] لجعل حل عمل 100 mM.
    ملاحظة: تجنب استخدام أملاح الغلوتامات مثل الغلوتامات الصوديوم لمنع الآثار المحتملة المرتبطة بالتكون على ديناميكيات Ca2+ .

3. إعداد المجهر وإجراء التصوير في الوقت الحقيقي

  1. قم بتشغيل مجسم المجسم المفلور المزود بعدسة هدف 1x (NA = 0.156) وكاميرا sCMOS(الشكل 2)وتكوين إعدادات الجهاز لتشعيعها بضوء إثارة 470/40 نانومتر والحصول على ضوء انبعاث يمر عبر فلتر 535/50 نانومتر.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر مضان حساس ل GFP للكشف عن إشارات GCaMP3 و iGluSnFR في الوقت الفعلي ، ولكن يوصى بعدسة موضوعية منخفضة الطاقة وكاميرا حساسة للغاية مع رقاقة sCMOS واسعة للحصول على إشارات من المصنع بأكمله. يسمح هدف الطاقة المنخفضة بتصوير استجابة محطة Arabidopsis بأكملها واستخدام كاميرا حساسة للغاية يسمح بالحصول السريع على البيانات اللازمة لالتقاط المسار الزمني السريع لموجة Ca2+ التي تسببها الجروح. بالنسبة للمجهر الفلوري المستخدم في هذه الدراسة، فإن القيم القصوى لمجال الرؤية والدقة الزمنية هي 3 سم × 3 سم و 30 إطارا في الثانية (FPS)، على التوالي.
  2. إزالة الغطاء ووضع الطبق تحت العدسة الهدف.
  3. تحقق من إشارة الفلورسينس من المصنع ثم انتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا في الظلام حتى تتكيف النباتات مع الظروف البيئية الجديدة. هذه الخطوة التكيف مطلوب لأن التغيرات في الرطوبة تثير [Ca2+] ارتفاعسيت في النباتات التي يمكن أن تتداخل مع أي أحداث ذات صلة بالجروح.
  4. ضبط التركيز والتكبير لرؤية المصنع كله في مجال الرؤية. في البروتوكول الحالي، تم استخدام تكبير 0.63x.
  5. قبل البدء في التصوير في الوقت الحقيقي، قم بإعداد معلمات الاستحواذ للكشف عن إشارات الفلورسينس باستخدام برنامج تصوير المجهر. إعدادات التصوير في البروتوكول الحالي هي: التعرض وأوقات الفاصل الزمني المحددة إلى 1.8 ثانية و 2 ثانية (أي 0.5 إطارا في الثانية) على التوالي. تعيين وقت التسجيل إلى 11 دقيقة.
  6. صورة لمدة 5 دقائق قبل بدء التجربة لتأقلم النبات مع تشعيع الضوء الأزرق من المجهر ، ثم بدء التسجيل عن طريق النقر على تشغيل الآن، أو الأمر المكافئ في برنامج المجهر المستخدم. لتحديد متوسط مضان خط الأساس، سجل ما لا يقل عن 10 إطارات (أي 20 s على الأقل في البروتوكول الحالي) قبل الجرح أو تطبيق الغلوتامات (انظر القسم 4).
    1. للتصوير في الوقت الحقيقي من الجرح الناجم [Ca2 +]cyt و [غلو] apo التغييرات، وقطع petiole أو المنطقة الوسطى من ورقة L1 مع مقص (الشكل 3 والشكل 4).
    2. للتصوير في الوقت الحقيقي من الغلوتامات التي أثارها [Ca2 +] تغييراتسيت، وقطع حافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 عبر الوريد الرئيسي مع مقص. بعد فترة نقاهة لا تقل عن 20 دقيقة، ضعي 10 ميكرولتر من الغلوتامات 100 م على سطح الورقة المقطوع(الشكل 5).
      ملاحظة: كان هذا القطع المسبق ضروريا للسماح بوصول الغلوتامات إلى النبات المبرمج من أجل تحريك الاستجابات. وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على تطبيق قطرة من الماء المقطر على سطح قطع من ورقة L1 أن تكون حاسمة لمنع العينات من الجفاف أثناء الانتعاش قبل تطبيق الغلوتامات.
  7. بعد الانتهاء من تسجيل 11 دقيقة، حفظ البيانات.

4. تحليل البيانات

  1. لتحليل كثافة الفلورية مع مرور الوقت، حدد منطقة الاهتمام (ROI) في المكان الذي يتم فيه تحليل كثافة الفلورسينس(الشكل 6 والشكل 7). لحساب سرعة موجة Ca2+ ، حدد 2 ROIs (ROI1 و ROI2) للتحليل. في برنامج التصوير، انقر على | قياس الوقت تعريف | دائرة. قياس المسافة بين ROI1 و ROI2 بالنقر على التعليقات التوضيحية والقياس | طول | خط بسيط (الشكل 6).
  2. قياس قيم الفلورسينس الخام (F) في كل عائد استثمار مع مرور الوقت عن طريق النقر على قياس. تصدير البيانات الخام إلى برنامج جدول البيانات لتحويل إشارة مضان إلى أرقام في كل نقطة زمنية عن طريق النقر على الكل إلى Excel | تصدير.
  3. تحديد قيمة الفلورسينس الأساسية، التي تعرف بأنها F0،عن طريق حساب متوسط F على الإطارات العشرة الأولى (أي قبل المعالجة) في البيانات المسجلة.
  4. تطبيع البيانات F (عن طريق حساب ΔF / F) باستخدام المعادلة ΔF / F = (F−F0) / F0، حيث ΔF هو التغير المعتمد على الوقت في الفلورسينس.
  5. بالنسبة لتحليلموجة سرعة الموجة Ca 2+ ، حدد نقطة ارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا على أنها تمثل اكتشاف زيادة Ca2 + في كل عائد استثمار(t1 و t2)باستخدام معيار الارتفاع إلى 2× الانحراف المعياري (2x SD) الذي يتم حسابه من بيانات F0 باستخدام البرامج الإحصائية. 95٪ من بيانات F0 تقع ضمن 2x SD من المتوسط، مما يشير إلى أن ارتفاع الإشارة فوق هذا المستوى عن طريق الصدفة هو ≤5٪. حساب الفرق الزمني للزيادة Ca2 + بين ROI1 و ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] وقياس المسافة بين ROI1 و ROI2 ، ثم تحديد سرعات أي موجة Ca2 + .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عرض نشر إشارة [Ca2 +]cyt و [Glu] apo ردا على الجرح في الشكل 3، الشكل 4، فيلم S1، والفيلم S2. قطع petiole من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (في 0 ق) أدى إلى زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt التي تم حثها بسرعة محليا من خلال الأوعية الدموية (في 40 ق) (الشكل 3 والفيلم S1). في وقت لاحق، تم نشر إش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإشارات النظامية مهمة للنباتات للاستجابة للمحفزات البيئية الخارجية المحلية ومن ثم الحفاظ على التوازن على مستوى النبات بأكمله. على الرغم من أنها ليست مجهزة جهاز عصبي متقدم مثل الحيوانات، فإنها تستخدم الاتصالات السريعة داخل وبين الأجهزة على حد سواء على أساس عوامل مثل الكهربائية المتنقلة (وربما الهيدروليكية) إشارات وموجات نشر ROS وكا2 + 46،47. يسمح البروتوكول المذكور أعلاه بالتصوير على مستوى النبات في الوقت الفعلي لنشاط نظام الإشارات هذا من خلال مراقبة د...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل بمنح من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H05007 و 18H05491) إلى MT والمؤسسة الوطنية للعلوم (IOS1557899 وMCB2016177) والإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء (NNX14AT25G و 80NSSC19K0126) إلى SG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Arabidopsis < / em> تعبيرا عن GCaMP3جامعة
سايتاما Arabidopsis < / em> تعبيرا عن CHIB-iGluSnFRجامعة
سايتاما GraphPad Prism 7برنامج
L-GlutamateFUJIFILM Wako072-00501مذاب في وسط نمو سائل [1/2x أملاح MS ، 1٪ (وزن / حجم) سكروز ، و 0.05٪ (وزن / حجم) MES ؛ درجة الحموضة 5.1 معدلة مع 1N KOH].
مايكروسوفت إكسلمايكروسوفت كوربوريشن
Murashige و Skoog (MS) متوسطFUJIFILM Wako392-00591التركيب: 1x أملاح MS ، 1٪ (وزن / حجم) سكروز ، 0.01٪ (وزن / حجم) ميوينوزيتول ، 0.05٪ (وزن / حجم) MES ، و 0.5٪ (وزن / حجم) صمغ جيلان ؛ درجة الحموضة 5.7 معدلة مع 1N KOH.
نيكون SMZ25 مجهر مجهرنيكون
NIS-Elements AR تحليلنيكون
موضوعية 1x (P2-SHR خطة APO)كاميرانيكون
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)Hamamatsu PhotonicsC11440-22CU
طبق بتري بلاستيكي مربعSimportD210-16
GraphPad عدسة

المراجع

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142(2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232(2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Arabidopsis
تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.