هنا، ونحن نصف السابقين في الجسم الحي وفي أساليب الجسم الحي لتقييم التشتت البكتيري من عدوى الجرح في الفئران. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار فعالية العلاجات الموضعية المضادة للميكروبات والأغشية الحيوية، أو لتقييم قدرة تشتت السلالات البكتيرية المختلفة أو الأنواع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم تشتت بيو فيلم في جروح مورين
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتورط العدوى ذات الصلة بيو فيلم في مجموعة واسعة من الحالات المزمنة مثل قرحة القدم السكري غير الشفاء، والتهاب الجيوب الأنفية المزمن، والتهاب الأذن الوسطى المتكرر، وغيرها الكثير. الخلايا الميكروبية داخل هذه العدوى محمية بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، والتي يمكن أن تمنع المضادات الحيوية وتستضيف الخلايا المناعية من إزالة العدوى. للتغلب على هذه العقبة، بدأ المحققون في تطوير عوامل التشتت كعلاجات محتملة. تستهدف هذه العوامل مكونات مختلفة داخل EPS بيو فيلم، وإضعاف الهيكل، والشروع في تشتت البكتيريا، والتي يمكن نظريا تحسين فعالية المضادات الحيوية وإزالة المناعة. لتحديد فعالية عوامل التشتت لالتهابات الجروح ، قمنا بتطوير بروتوكولات تقيس تشتت بيو فيلم في الجسم الحي السابق وفي الجسم الحي. نحن نستخدم نموذج استئصال الماوس الجراحية التي تم وصفها بشكل جيد لخلق التهابات الجروح المزمنة المرتبطة بيو فيلم. لرصد التشتت في الجسم الحي، نصيب الجروح بسلالات بكتيرية تعبر عن لوسيفيراز. بمجرد أن تنشأ العدوى الناضجة ، نروي الجروح بمحلول يحتوي على إنزيمات تتحلل مكونات EPS بيو فيلم. ثم نراقب موقع وشدة الإشارة الإنارة في الجرح وتصفية الأعضاء لتوفير معلومات حول مستوى التشتت الذي تم تحقيقه. لتحليل الجسم الحي السابق لتشتت بيو فيلم ، يتم غمر أنسجة الجرح المصابة في محلول الإنزيم المهين للبيو فيلم ، وبعد ذلك يتم تقييم الحمل البكتيري المتبقي في الأنسجة ، مقابل الحمل البكتيري في المحلول. كلا البروتوكولين لديها نقاط القوة والضعف ويمكن تحسينها للمساعدة في تحديد بدقة فعالية العلاجات التشتت.
المقدمة
ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية في جميع أنحاء العالم يؤدي إلى عدم وجود خيارات المضادات الحيوية لعلاج مجموعة متنوعة من الالتهابات البكتيرية1. بالإضافة إلى مقاومة المضادات الحيوية، يمكن للبكتيريا الحصول على تحمل المضادات الحيوية من خلال اعتماد نمط الحياة المرتبطة بيو فيلم2. بيو فيلم هو مجتمع من الكائنات الحية الدقيقة التي تحميها مصفوفة من السكريات، الحمض النووي خارج الخلية، الدهون، والبروتينات3،تسمى مجتمعة مادة البوليمر خارج الخلية (EPS). ومع استمرار أزمة مقاومة المضادات الحيوية، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة تطيل أمد استخدام المضادات الحيوية أو تعمل على فعاليتها. عوامل مكافحة بيو فيلم هي واحدة واعدة الحل4.
من بين مختلف استراتيجيات مكافحة بيو فيلم التي تم اقتراحها، واستخدام عوامل التشتت، والتي تستهدف مكونات مختلفة من EPS بيو فيلم، هي في طليعة التنمية العلاجية5. الهدرلاسات الجليكوزيدية (GH) هي واحدة من هذه الفئة من عوامل التشتت. هرمون النمو هي فئة كبيرة من الانزيمات التي تحفز انشقاق الروابط المختلفة داخل السكريات التي توفر السلامة الهيكلية لEPS. وقد أظهرت مجموعتنا، فضلا عن غيرها، أن هرمون النمو يمكن أن تتحلل بشكل فعال الأغشية الحيوية، والحث على التشتت وتحسين فعالية المضادات الحيوية لعدد من الأنواع البكتيرية المختلفة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي6،7،8،9،10،11.
مع تزايد الاهتمام في التشتت بيو فيلم، من المهم تطوير أساليب فعالة لتقييم فعالية التشتت. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعلاج التهابات الجروح المرتبطة بيو فيلم مع عامل التشتت في الفئران، وتقييم فعالية التشتت، في الجسم الحي وفي الجسم الحي السابق. الهدف العام هو توفير أساليب فعالة يمكن استخدامها مع نماذج ما قبل السريرية لقياس تشتت بيو فيلم بفعالية وكفاءة.
تم استخدام نموذج عدوى استئصال مورين الجراحية في هذه الدراسات لإنشاء عدوى مرتبطة بيو فيلم. لقد استخدمنا هذا النموذج لأكثر من 15 عاما ونشرنا ملاحظاتنا على نطاق واسع7،9،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21. بشكل عام ، هذا هو نموذج العدوى غير المميتة حيث تظل البكتيريا مترجمة إلى سرير الجرح وترتبط بيو فيلم (البكتيريا التي ينظر إليها في المجاميع محاطة EPS) ، وإعداد عدوى مزمنة تستمر لمدة تصل إلى 3 أسابيع. ومع ذلك ، إذا كانت الفئران منقوصة المناعة (مع مرض السكري من النوع 1 على سبيل المثال) ، فإنها يمكن أن تصبح أكثر عرضة لتطوير عدوى جهازية قاتلة في هذا النموذج.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكولات لتقييم تشتت البكتيريا من الجرح، سواء في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يمكن استخدام كلا البروتوكولين لفحص فعالية عامل التشتت ويكون له نقاط قوته ونقاط ضعفه الخاصة. على سبيل المثال، يمكن لتقييم التشتت في الجسم الحي أن يوفر معلومات مهمة في الوقت الحقيقي حول انتشار البكتيريا إلى أجزاء أخرى من الجسم بعد التشتت، وكيفية استجابة المضيف. من ناحية أخرى ، قد يكون تقييم التشتت في الجسم الحي أكثر جاذبية لفحص عوامل أو جرعات أو تركيبات متعددة ، حيث يمكن تقسيم الأنسجة إلى أقسام متعددة يمكن اختبارها بشكل منفصل ، وبالتالي تقليل عدد الفئران المطلوبة. عند تقييم عوامل متعددة، ونحن عادة قياس التشتت أولا في المختبر كما هو موضح سابقا 6،9،22. ثم نقوم باختبار الجسم الحي السابق الأكثر فعالية والاحتياطي في اختبار الجسم الحي لعدد محدود من العوامل الواعدة للغاية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة هذا البروتوكول الحيواني والموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (البروتوكول رقم 07044). وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد البكتيريا لالتهابات الماوس
ملاحظة: هنا نحن نصف الفئران المصابة فقط مع Pseudomonas aeruginosa. ومع ذلك، يمكن استخدام أنواع بكتيرية أخرى للتسبب في العدوى. يتم تفصيل السلالات والمواد البكتيرية في جدول المواد.
- استخدام Pseudomonas aeruginosa البرية نوع سلالة PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس23 لهذه التجارب كما هو موضح سابقا7.
- تنمو P. aeruginosa سلالات في قوارير إرلينماير حائرة، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة، في لوريا-بيرتاني (LB) مرق في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. إضافة تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من أمبيسلين لثقافة بين عشية وضحاها من PAO1 (pQF50-لوكس) للحفاظ على البلازميد.
- الثقافة الفرعية P. aeruginosa بإضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على 10 مل من مرق LB مع تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. ثم تنمو لمدة 2-2.5 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، إلى OD600 نانومتر من 0.4، ومن ثم تمييع تسلسليا (1:10) ثلاث مرات لجرعة إصابة ما يقرب من 104 خلايا.
2. إعداد إنزيم التشتت بيو فيلم
ملاحظة: لهذه الدراسة نستخدم حل 10٪ من أجزاء متساوية الأميليز والسيلولاز (5٪ من كل)، والتي سوف يشار إليها باسم "GH"، لعلاج التشتت.
- استخدام محلول GH 10٪ (ث / v) من الأميليز (من العصيات subtilis)والسيلولاز الفطرية (من النيجر Aspergillus) المخفف في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS). استخدام برنامج تلفزيوني كعلاج التحكم في السيارة.
- قم بتسخين جميع العلاجات إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط الإنزيم.
3. الحيوانات التجريبية والإعداد قبل الجراحة
- فئران المنزل، 5 زملاء القمامة في القفص الواحد، في ظروف تسيطر عليها البيئة، مع 12 ساعة دورات خفيفة / مظلمة والوصول السليم إلى الغذاء والماء.
- ويفضل استخدام الفئران ويبستر السويسرية الإناث، بين 8 و 10 أسابيع من العمر.
- وزن الفئران لتحديد الكمية المناسبة من التخدير لإدارة.
- إعطاء التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كجم الكيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
- ضعي كريم العين (مثل، تحديث P.M)بعناية على العين باستخدام مسحة قطنية للحد من الجفاف.
- رصد المعلمات الفسيولوجية بما في ذلك معدل الجهاز التنفسي، تلوين الجلد، ودرجة حرارة الجسم طوال الجراحة.
4. دورسال جراحة استئصال سمك كامل
- تقييم الطائرة الجراحية للتخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ورصد معدل التنفس والجهد. حلق السطح الظهري وتطبيق كريم إزالة الشعر لمدة 10 دقيقة (أو وفقا لتعليمات المنتج)، وبعد ذلك إزالة بلطف، وضمان الجلد كان جافا.
- لإدارة الألم، وإدارة 0.05 مل من الليدوكائين تحت الجلد في المنطقة ليتم استئصالها، وحقن 0.02 مل من البوبرينورفين تحت الجلد في scruff من الرقبة. انتظر 10 دقائق لضمان الوصول إلى إدارة الألم.
- قبل استئصال، تطهير السطح الظهري باستخدام مسحة الكحول ورسم دائرة قطرها 1.5 سم نحو الجزء الخلفي من الظهر. الحفاظ على حقل جراحي معقم طوال العملية واستخدام الأدوات الاوتوسلافية والقفازات العقيمة. للحد من التلوث، قم بإجراء الجراحة بواسطة موقد بونسن مضاء واستخدم أدوات نظيفة لكل.
- إدارة كامل سمك، جرح الجلد استئصالي إلى مستوى العضلات panniculus مع مقص الجراحية.
- بعد استئصال، تغطية الجروح على الفور مع خلع الملابس البولي يوريثين شبه نفاذة.
- حقن ما يقرب من 104 CFU من البكتيريا في 100 μL PBS تحت خلع الملابس، على سرير الجرح، لإنشاء عدوى.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مصابة الجروح مع أنواع متعددة من البكتيريا و / أو الفطريات في وقت واحد، أو عن طريق وضع الأغشية الحيوية شكلت مسبقا12،أو حتى الأنسجة debridement المستخرجة من المرضى19،على سرير الجرح. - بعد العدوى، ضع الفئران في قفص مع منصات التدفئة ورصد حتى استعادت منعكس الحق.
ملاحظة: تأكد من أن الفئران لا تحصل الباردة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى الموت. - تحديد التهابات الجروح لمدة 48 ساعة.
- فحص الضمادات لاصقة يوميا للدموع ومناطق عدم الالتزام واستبدالها إذا لزم الأمر.
5. في علاج تشتت الجسم الحي
ملاحظة: هنا نحن وصف إدارة عوامل التشتت من خلال تطبيق سلسلة من 3 حلول الري الجرح الموضعي(الشكل 1). ومع ذلك، يمكن تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من التسليم مثل تطبيق المواد الهلامية أو الكريمات أو الضمادات.
- ضع الفئران تحت تخدير الأيزوفلوران (بمعدل 3٪ و1 لتر في الدقيقة من الأكسجين) أثناء إدارة العلاجات.
- إعداد ثلاثة 1 مل المحاقن، مع الإبر 25 G، التي تحتوي على 200 ميكرولتر من العلاج لكل فأر.
- حقن 200 ميكرولتر من محلول الإنزيم أو التحكم في PBS على الجرح عن طريق رفع الجلد مع ملقط بعناية ، أعلى قليلا من الجرح نحو رأس الحيوان. ثقب المحاقن بعناية من خلال الجلد رفع وحقن ببطء الحل بين خلع الملابس وسرير الجرح. غالبا ما تلتزم الضمادات المستخدمة في هذه الدراسة بكل من سرير الجرح والأنسجة المحيطة به.
- لضمان تغطية سرير الجرح بأكمله بالمحلول ، ارفع الضمادة برفق مع ملقط ، وسحبها بعيدا عن سرير الجرح ، مع حقن المحلول ببطء.
- بعد العلاج، ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة من التعرض للعلاج ، قم بإعادة تخدير الفئران بالايسوففلوران وتوبيخ المحلول بحقنة ، مع التأكد من ثقب في نفس المنطقة كما كان من قبل.
ملاحظة: يحتوي هذا الحل المهتلأ على خلايا بكتيرية مشتتة، والتي يمكن حفظها لمختلف التحليلات المصب. - إدارة علاجات الري الثانية والثالثة كأول، وذلك باستخدام حقنة جديدة في كل مرة.
6. في التصوير والتحليل في تشتت الجسم الحي
ملاحظة: إذا تم استخدام سلالة من البكتيريا الإنارة لبدء العدوى، يمكن استخدام نظام التصوير في Vivo (IVIS) لتصور التشتت من سرير الجرح.
- الفئران صورة مباشرة قبل وبعد العلاج وعلى 10 و 20 ساعة بعد العلاج (الشكل 2 والشكل التكميلي 1).
- إجراء التصوير بينما الفئران تحت التخدير عن طريق وضعها بشكل فردي في IVIS والتصوير كل واحد لمدة 5 ق في الطول الموجي من 560 نانومتر. احفظ الصور لمزيد من التحليل.
ملاحظة: يعتمد الطول الموجي الأمثل ووقت التعرض على المراسل المستخدم وأداة IVIS وبرامج التصوير. - للتحليل، افتح الصور في برنامج IVIS وحدد المنطقة التي سيتم تحليلها في لوحة الأدوات.
- لحساب الخلفية، ضع دائرة على خلفية صورة ثم ضع نفس الدائرة الحجم فوق سرير الجرح لكل فأر.
- لتحميل قيم القياس، حدد عرض قياسات منطقة الاهتمام (ROI) > وتحميل جدول القياسات إلى جدول بيانات. طرح قراءة دائرة الخلفية من كل من قياسات سرير الجرح لحساب التلألؤ لكل عينة. حساب النسبة المئوية للتألق التي تم تغييرها بواسطة:
عائد الاستثمار قبل العلاج-ROI بعد العلاج/ العائد على الاستثمار قبل العلاج) × 100.
ملاحظة: يجب تحليل الماوس التحكم ومعالجتها في وقت واحد لتطبيع للمتغيرات التي قد تؤثر على الحصول على الصورة أو التألق.
7. تقييم التشتت من خلال تحديد CFU
- القتل الرحيم إنسانيا الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 0.2 مل من الصوديوم pentobarbital (على سبيل المثال، زائد فادح) تحت التخدير مع 100 ملغم / كجم كيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
- حصاد أنسجة سرير الجرح عن طريق إزالة أولا بلطف خلع الملابس مع ملقط معقم، ومن ثم قطع حول محيط سرير الجرح مع مقص الجراحية العقيمة. رفع بلطف نهاية واحدة من سرير الجرح مع ملقط أثناء استخدام مقص لقطع / ندف العينة بعيدا عن طبقة العضلات.
- ضع الأنسجة من سرير الجرح في أنبوب تجانس 2 مل قبل التسمية والوزن المسبق الذي يحتوي على 1 مل من PBS. وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إدراج العينات، ومن ثم عكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي البكتيريا المنتشرة أو فضفاضة الالتزام بها، وإزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
- من أجل حصاد الطحال ، ضع الفئران في وضع تشريحي قوي وآمن عن طريق تثبيت أطرافها على سطح تشريح. نقع المنطقة ليتم تشريحها مع الإيثانول 70٪ من أجل تطهير المنطقة والحفاظ على الفراء من تلويث العينة.
- قم بإجراء شق صغير عمودي على خط الوسط مع مقص جراحي في الأدمة في أسفل البطن ، مع التأكد من سحب الجلد صعودا وبعيدا عن الأعضاء الداخلية. استمر في الشق داخليا ، على طول الخط الأوسط ، حتى تم الوصول إلى القص. بمجرد تعرض التجويف البريتوني وكانت الأعضاء الداخلية مرئية ، افصل الطحال برفق عن النسيج الضام ووضعها في أنبوب تجانس منفصل.
- وزن الطحال وشطف مع برنامج تلفزيوني، كما هو موضح لأنسجة سرير الجرح.
ملاحظة: يمكن حصاد أجهزة أخرى ذات أهمية مماثلة.- عند إجراء الشق الأولي، يجب الحرص على تجنب ثقب الأمعاء أو الأعضاء الأخرى.
- تجانس العينات في 2 مل قبل مملوءة أنابيب مطحنة حبة باستخدام متجانس benchtop في 5 م / ث لمدة 60 ثانية، مرتين.
- لتعداد CFU، مخففة بشكل متسلسل عينات وبقعة لوحة على أجار انتقائية. لتخفيف المسلسل، ماصة 100 ميكرولتر من العينة إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل، دوامة، وتكرار 5 مرات. ماصة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحة أجار كما هو مبين في الشكل 3.
ملاحظة: إذا كان مطلوب كمية CFU أكثر دقة، انتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف العينة عبر لوحات أجار منفصلة.
8. تقييم الجسم الحي للتشتت ( الشكل4)
- الفئران الجرح وتصيب ما يقرب من 104 PAO1 كما هو موضح أعلاه، ومن ثم القتل الرحيم 48 ساعة بعد العدوى.
- إزالة بعناية خلع الملابس مع ملقط، وذلك باستخدام تقنية معقمة ودون إزعاج سرير الجرح.
- استخدم مقصا جراحيا معقما لقطع محيط سرير الجرح بعيدا عن الجلد غير المصاب باستخدام ملقط لرفع طرف واحد من سرير الجرح ومقص لاستئصال أنسجة الجرح المصابة من طبقة العضلات تحت الأنسجة غير المصابة المحيطة بها. تقسيم عينات سرير الجرح إلى أجزاء متساوية أو استخدام كامل.
- ضع أنسجة الجرح في فارغة، قبل وزنها 2 مل حبة مطحنة أنابيب التجانس. ثم وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إضافة العينة. حساب وزن العينة عن طريق:
الوزن بعد إضافة عينة - الوزن قبل إضافة عينة. - إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وانعكس بلطف أنبوب 3-5 مرات لشطف العينة وإزالة أي خلايا العوالق. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
- أضف 1 مل من علاج هرمون النمو (أو PBS كتحكم سلبي) إلى العينة واحتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة.
- إزالة محلول التشتت بيو فيلم ومكان في أنبوب منفصل 1.5 مل. هذا يحتوي على خلايا متفرقة.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى عينة الأنسجة المتبقية وعكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي خلايا مشتتة المتبقية. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة المتبقية وتجانس في 5 م / ث لمدة 60 ثانية باستخدام متجانس benchtop.
- تمييع محلول الخلايا المشتتة وعينة الأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل عن طريق وضع 100 ميكرولتر من العينة في 900 ميكرولتر من PBS في أنبوب 1.5 مل ، وتكرار خمس مرات لما مجموعه 6 تمييعات.
- بقعة لوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على وسائل الإعلام أجار انتقائية (على سبيل المثال، Pseudomonas العزلة أغار لP. aeruginosa)واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- عد CFU وحساب 'في المئة مشتتة' كما (CFU في supernatant / (CFU في supernatant + CFU في الأنسجة بيو فيلم)) × 100.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه التجربة، أصيبت 8-10 أسابيع من الفئران السويسرية ويبستر القديمة مع 104 CFU من PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس. كما هو موضح أعلاه، سمح للعدوى لتحديد لمدة 48 ساعة قبل إعطاء العلاجات 3 × 30 دقيقة من برنامج تلفزيوني إما (مراقبة السيارة) أو 10٪ GH (العلاج) لهضم EPS بيو فيلم. تم تصوير الفئران قبل العلاج، مباشرة بعد العلاج (0 ساعة) وعلى 10 ساعة و 20 ساعة بعد العلاج. الشكل 2A والشكل التكميلي 1 تظهر عدوى راسخة داخل سرير الجرح توليد إشارة مضيئة الإضاءة الحيوية...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نحن وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لدراسة فعالية عوامل التشتت بيو فيلم. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لاستخدامها مع أنواع مختلفة من عوامل التشتت أو الأنواع البكتيرية أو عينات الجسم الحي السابق، بما في ذلك عينات الحطام السريري. يوفر هذا البروتوكول أيضا نموذجا مناسبا سريريا لجمع ودراسة الخلايا البكتيرية المشتتة. وقد تبين أن الأنماط الظاهرية للخلايا البكتيرية المشتتة متميزة عن تلك الموجودة في الخلايا العوالق أو الأغشية الحيوية 5و24و
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل منح من المعاهد الوطنية للصحة (R21 AI137462-01A1) ومؤسسة تيد ناش للحياة الطويلة ومؤسسة جاسبر ل. وجاك دينتون ويلسون ووزارة الدفاع (وزارة الدفاع W0318_19_NM_PP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق فيشر | 14823434 | يستخدم لإكمال التخفيفات التسلسلية للعينات |
| 25G 58 في إبرة | فيشر | 14823434 | يعلق على 1 مل حقنة |
| أمبيسلين ملح الصوديوم | فيشر | BP1760-5 | اصنع محلول مخزون 50 مجم / مل وأضف 100 ميكرو ؛ من L إلى 10 مل من مرق LB لكل من الأميليز بين عشية وضحاها والزراعة الفرعية |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | صنع محلول 5٪ وزن / حجم ، يمكن استخدام عوامل التشتت الأخرى |
| Buprenorphine SR-LAB 5 مل (1 مجم / مل) | ZooPharm | RX216118 | استخدامها كعلاج للألم - قد تستخدم خيارات |
| أخرى Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | أضف 5٪ وزن / حجم إلى محلول الأميليز بنسبة 5٪ ، الدوامة ، تنشط عند 37 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة - يمكن استخدام عوامل التشتت الأخرى |
| كريم إزالة الشعر | وول | مارت 287746 | استخدم كمية صغيرة لتدليك بصيلات الشعر الموجودة على ظهر وخصص 10 دقائق لإزالة الشعر |
| ملقط تضميد ، نصائح مسننة | فيشر | 12-460-536 | يمكن استخدام أشكال أخرى من الملقط |
| قوارير Erlenmeyer محيرة 125 مل | فيشر | 101406 | استخدامها لتنمو بين عشية وضحاها والثقافات الفرعية للبكتيريا |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | استخدم 5 م / ث لمدة 60 ثانية مرتين لتجانس الأنسجة |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | حقن 0.2 مل داخل الصفاق لكل فأر |
| أنابيب التجانس (أنبوب حبة 2 مل 2.4 مم معدن) | يستخدم | 15340151 | فيشر لتجانس العينات لطلاء |
| أدوية | ظهر الماس الأيزوفلوران | ||
| محلول هيدروكلوريد الكيتامين / زيلازين هيدروكلوريد C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | استخدم كتخدير - يمكن أيضا استخدام خيارات أخرى للحصول على مجال جراحي لمرق التخدير |
| LB ، ميلر | فيشر | BP1426-2 | أضف 25 جم / لتر والأوتوكلاف |
| ليدوكائين 2٪ | أدوية عودة الماس | 2468 | حقن 0.05 مل من خلال جانب منطقة سرير الجرح المحدد بحيث يتم ترسيبها في وسط العلامة. خصص 10 دقائق قبل قطع |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | اصنع 5 مجم / مل لإضافتها إلى محلول هرمون النمو لتطبيقه موضعيا ومحلول 15 مجم / مل لحقن داخل الصفاق قبل 4 ساعات وبعد العلاج 6 ساعات |
| إسفنج شاش قطني غير معقم | فيشر | 13-761-52 | استخدم لإزالة كريم إزالة الشعر |
| السلالة البكتيرية PAO1 pQF50-lux | المرجع [13] | غير متاح | تم استخدام PAO1 pgF50-lux كسلالة P. aeruginosa ذات الأهمية في النتائج التمثيلية لهذه الورقة أطباق |
| بتري | فيشر | PHR1772-500MG | |
| ملحي للفوسفات 10x | فيشر | BP3991 | تمييع 10x إلى 1x قبل الاستخدام |
| ضمادة البولي يوريثين | Mckesson | 66024007 | قطع الحافة المستديرة وقطع المربع المتبقي إلى 4 أقسام متساوية |
| Pseudomonas عزل أجار | VWR | 90004-394 | أضف 20 مل / لتر من الجلسرين و 45 جم / مل إلى الماء والأوتوكلاف واسكب 20 مل في أطباق بتري |
| Refresh P.M. | وول مارت | استخدمه على العينين لتقليل الجفاف أثناء العملية. | |
| وسادات تحضير الكحول المعقمة | فيشر | 22-363-750 | استخدم لتنظيف الجلد مباشرة قبل الجرح لتطهير المنطقة |
| مقص مستقيم دقيق | فيشر | 89515 | يمكن أيضا استخدام مقص منحني |
| الفئران السويسرية ويبستر | تشارلز ريفر | 551NCISWWEB | يمكن استخدام سلالات الفئران الأخرى |
| حقنة 1 مل | فيشر | 14823434 | تستخدم لإدارة المخدرات و علاج الإنزيم |
المراجع
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738(2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632(2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379(2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317(2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518(2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129(2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079(2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462(2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
