مقالة منهجية

العزلة والتصوير الفاصل الزمني لخلايا ميسنشيم الجنينية للفأر الأولي لتحليل سمات الحركة الجماعية

DOI:

10.3791/62151

⸱

فبراير 13, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكولا لعزل وثقافة الخلايا الميكنشية الجنينية الأولية للفأرة للتصوير الفاصل الزمني للنمو ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) ويقيس إصلاح الجروح. كما نقدم منهجية تحليل بيانات التصوير الفاصل الزمني لتحديد تكوين تيار الخلية والحركة الاتجاهية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الحنك هو عملية ديناميكية ، والتي تنطوي على النمو الرأسي للرفوف الفخمة الثنائية بجوار اللسان تليها الارتفاع والانصهار فوق اللسان. تؤدي العيوب في هذه العملية إلى الحنك المشقوق ، وهو عيب خلقي شائع. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ارتفاع الجرف الفخم ينطوي على عملية إعادة عرض تحول اتجاه الرف من عمودي إلى أفقي. كان من الصعب دراسة دور الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي في هذا إعادة عرض ديناميكية. وقد استخدم مؤخرا التحليل الكمي القائم على الفاصل الزمني للتصوير لإظهار أن خلايا الفأرة الجنينية الأولية يمكن أن تنظم نفسها بنفسها في حركة جماعية. يمكن للتحليلات الكمية تحديد الاختلافات في خلايا MEPM المتحولة من نموذج الماوس مع عيوب ارتفاع الحنك. تصف هذه الورقة أساليب عزل واستزراع خلايا MEPM من الأجنة E13.5 على وجه التحديد للتصوير بفارق زمني وتحديد السمات الخلوية المختلفة للحركة الجماعية ، بما في ذلك تدابير تكوين التيار ، ومحاذاة الشكل ، واستمرار الاتجاه. فإنه يفترض أن خلايا MEPM يمكن أن تكون بمثابة نموذج وكيل لدراسة دور mesenchyme الجرف الحنكي خلال عملية ديناميكية من الارتفاع. وستسمح هذه الأساليب الكمية للمحققين في مجال القحف الوجهي بتقييم ومقارنة سمات الحركة الجماعية في الخلايا المسيطرة والمتحولة، مما سيزيد من فهم إعادة عرض الميكنشيمال أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. وعلاوة على ذلك، توفر خلايا MEPM نموذج خلايا حساسة نادرة للتحقيق في حركة الخلايا الجماعية بشكل عام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد درس تطوير الحنك على نطاق واسع كما عيوب في palatogenesis يؤدي إلى شق الحنك - عيب خلقي شائع يحدث في حالات معزولة أو كجزء من مئات المتلازمات1،2. تطور الحنك الجنيني هو عملية ديناميكية تنطوي على حركة وانصهار الأنسجة الجنينية. ويمكن تقسيم هذه العملية إلى أربع خطوات رئيسية: 1) التعريفي من الرفوف الفخمة, 2) النمو الرأسي للرفوف فخمة بجانب اللسان, 3) ارتفاع الرفوف الفخمة فوق اللسان, و 4) الانصهار من الرفوف الفخمة في خط الوسط1,3,4. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تحديد العديد من المسوخ الماوس التي تظهر الحنك المشقوق5،6،7،8. وقد أشار توصيف هذه النماذج إلى وجود عيوب في خطوات التعريفي والانتشار والانصهار على الرف الفخم؛ ومع ذلك، كانت عيوب ارتفاع الجرف الحنكي نادرة. وبالتالي ، فإن فهم ديناميات ارتفاع الجرف الفخم هو مجال مثير للاهتمام من البحث.

تحليل دقيق لبعض المسوخ الماوس مع عيوب ارتفاع الجرف الحنكي أدى إلى النموذج الحالي تبين أن المنطقة الأمامية جدا من الرف الفخم يبدو أن الوجه، في حين أن حركة عمودية إلى أفقية أو "إعادة عرض" من الرفوف الفخمة يحدث في المناطق الوسطى إلى الخلفية من الحنك1،3،4، 9،10،11. ظهارة حافة وسيطة من الرف الفخم من المرجح أن يبدأ الإشارات المطلوبة لإعادة عرض هذا، الذي هو ثم مدفوعة mesenchyme الجرف الفخم. في الآونة الأخيرة, وقد حددت العديد من الباحثين تأخير ارتفاع الجرف الفخم في نماذج الماوس التي أظهرت الالتصاقات الشفوية العابرة التي تنطوي على رفوففخمة 12,13. ينطوي إعادة عرض mesenchymal على إعادة تنظيم الخلايا لخلق انتفاخ في الاتجاه الأفقي ، مع التراجع في نفس الوقت عن الرف الحنكي في الاتجاه الرأسي9و10و14. من بين العديد من الآليات المقترحة للتأثير على ارتفاع الجرف الحنكي وإعادة عرض mesenchymal الكامنة هي انتشار الخلايا15،16،17، التدرجات الكيميائية18، ومكونات مصفوفة خارج الخلية19،20. نشأ سؤال مهم: هل تأخر ارتفاع الرف الحنكي الملاحظ في الفئران الناقصة Specc1l -يرجع جزئيا أيضا إلى عيب في إعادة عرض الرف الحنكي ، ويمكن أن يظهر هذا العيب في إعادة العرض في عيب جوهري في سلوك خلايا MEPM الأولية21؟

وقد استخدمت الخلايا MEPM الأولية في مجال القحف الوجهي لكثير من الدراسات التي تنطوي على التعبير الجيني22،23،24،25،26،27،28،29، وعدد قليل منها التي تنطوي على انتشار30،31 والهجرة25،31،32 ، ولكن لا شيء لتحليل سلوك الخلية الجماعية. تم إجراء التصوير الفاصل الزمني لخلايا MEPM في الثقافة ثنائية الأبعاد و مقايسات إصلاح الجروح لإظهار أن خلايا MEPM أظهرت حركة اتجاهية وشكلت تيارات الخلايا المعتمدة على الكثافة - سمات الحركة الجماعية21. وعلاوة على ذلك، شكلت الخلايا المتحولة Specc1l تيارات خلايا أضيق وأظهرت مسارات هجرة الخلايا متغيرة للغاية. ويعتبر هذا النقص في حركية منسقة للمساهمة في تأخير ارتفاع الحنك في الأجنة متحولة Specc1l 13,21. وهكذا، فإن هذه المقايسات البسيطة نسبيا باستخدام خلايا MEPM الأولية قد تكون بمثابة وكيل لدراسة إعادة عرض mesenchymal أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. تصف هذه الورقة عزلة وثقافة خلايا MEPM الأولية ، وكذلك التصوير والتحليل الفاصل الزمني ، للمقاايسات 2D وإصلاح الجروح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب التي شملت الحيوانات ببروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كومك، وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة بها (رقم البروتوكول: 2018-2447).

1. حصاد E13.5 الأجنة

  1. قتل الفئران الإناث الحوامل باستخدام غرفةاستنشاق ثاني أكسيد الكربون أو عن طريق إجراء وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه. المتابعة فورا إلى تشريح.
  2. كشف النصف السفلي من تجويف البطن عن طريق إزالة الجلد والغشاء الصفاق. استئصال كلا قرني الرحم، والتي تحتوي على الأجنة E13.5.
  3. ضع الرحم لفترة وجيزة في ملحية معقمة بكمية الفوسفات قبل الحرب 37 درجة مئوية (PBS) لشطف الدم الزائد أو الشعر أو غيرها من الحطام. ضع الرحم في طبق معقم 10 سم مملوءة برنامج تلفزيوني معقم.
  4. باستخدام مقص صغير، وقطع من خلال جدار الرحم على طول الرحم لفضح كل جنين، لا يزال في كيس صفار له. إزالة كيس صفار المحيطة الجنين، ولكن حفظه ل genotyping، إذا لزم الأمر. كما تتم إزالة الأجنة، ضع كل جنين في بئر الخاصة به من لوحة 12 جيدا مليئة برنامج تلفزيوني.

2. تشريح رفوف فخمة من الأجنة (الشكل 1)

ملاحظة: تعقيم أدوات تشريح الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد)بعد معالجة كل جنين عن طريق وضع الأدوات أولا في كوب من الكحول الإيثيلي 100٪ (EtOH)، ثم في جهاز تعقيم الأدوات عند 350 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، ومن ثم تبريدها في كوب ثان من 100٪ EtOH.

  1. باستخدام ملعقة مثقبة معقمة، ضع الجنين في طبق جديد طوله 10 سم مليء بوسيلة زراعة MEPM تتكون من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي لدولبيكو (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) ، L-glutamine (4 mM L-Glu) ، والمضادات الحيوية البنسلين والستريبتوميسين (50 وحدة / مل).
  2. قطع رأس الجنين الحق تحت خط الفك باستخدام مقص معقم (الشكل 1A، خط منقط أحمر). إزالة الفك السفلي عن طريق إدراج نقطة واحدة من المعقمة غرامة # 5 ملقط في الفم، والاحتفاظ بها فقط داخل الخد. دفع نقطة من ملقط إدراجها من خلال حتى يخرج من الجزء الخلفي من الجمجمة.
  3. توجيه ملقط، على طول الخط الأصفر في الشكل 1B،بحيث الجانب الآخر من ملقط (الذي لا يزال خارج الجنين) تحوم فقط فوق قناة الأذن، ثم قرصة ملقط مغلقة لقطع الأنسجة. إذا لزم الأمر، تشغيل ملقط غرامة أخرى على طول التماس من ملقط مغلقة الآن لقطع من خلال أي الأنسجة التي لم يتم قطعها تماما من قبل قرصة.
  4. كرر الخطوة السابقة للجانب الآخر من رأس الجنين. مواصلة الإجراء قرصة قطع لإزالة الفك السفلي واللسان، وجزء أدنى من الجمجمة وفضح الرفوف الفخمة.
  5. إزالة الجمجمة عن طريق قطع فقط فوق العينين، كما هو مبين في الشكل 1C (الخط الأخضر). القيام بذلك عن طريق وضع الرأس على الجانب الأيسر أو الأيمن ووضع نقاط مقص الفولاذ المقاوم للصدأ الصغيرة أمام وخلف الجمجمة فقط فوق مستوى العين الجنين. قطع الجزء العلوي من الجمجمة مع قصاصة واحدة سريعة من مقص، وخلق سطح مستو من شأنها أن تكون مهمة للاستقرار في خطوات لاحقة، وأنه ينبغي أن تبدو وكأنها الشكل 1D عند النظر إليها من الجانب.
  6. ضع الجزء المتبقي من الرأس رأسا على عقب ، مع الجانب المتفوق من الرأس (إزالة الجمجمة) يستريح مسطحا في الجزء السفلي من الطبق ، مما سيوفر سطحا مستقرا لإزالة الرف الحنكي. خذ لحظة لتحديد الرفوف الفخمة ، والتي تتعرض الآن وتواجه ما يصل وسوف تظهر على اثنين من التلال التي أثيرت على جانبي الأخدود المركزي في النصف الأمامي من الرأس(الشكل 1E).
  7. دبوس الجزء المتبقي من الرأس إلى الطبق لشل الحركة في حين تتم إزالة الرفوف. القيام بذلك عن طريق إدراج نقطة واحدة من ملقط غرامة من خلال الأنسجة بالقرب من منطقة الأنف من الرأس, الأمامي إلى الرفوف الفخمة, وإدراج النقطة الأخرى من ملقط من خلال قاعدة الجمجمة, الخلفي إلى الرفوف الفخمة. عقد هذه في مكان أثناء أداء ختان الرفوف الفخمة.
    1. شل الرأس بيد واحدة، واختيار أي واحد من اثنين من الرفوف لإزالة الأولى، وإدراج كل نقطة من زوج الثاني من ملقط غرامة في الأنسجة في قاعدة السطح الجانبي للجرف، وقرصة لقطع الأنسجة (الشكل 1F). كرر هذا على طول قاعدة سطح الوسيطة من الرف ومن ثم في كل من النهايات الأمامية والخلفية للجرف لفصل من الرأس.
  8. ارفع الرف برفق، مما يجعل قرصات إضافية، حسب الحاجة، لتحرير الرف تماما من الأنسجة المحيطة.
  9. كرر الخطوتين السابقتين لإزالة الرف الحنكي الثاني.
  10. مع الرفوف الفخمة تحررت الآن من الأنسجة المحيطة بها ووضعها في برنامج تلفزيوني (الشكل G), استخدام لمبة بلاستيكية معقمة نقل ماصة لوضع الرفوف في ماصة, ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5mL جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على رفوف فخمة على الجليد كما تتم معالجة بقية القمامة في نفس الطريقة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن وضع الرفوف في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل يحتوي على تريبسين قبل الحرب (0.25٪) مباشرة بعد تشريحه (بدلا من وضعها على الجليد). وستكون العينات أعذب، ولكن يجب توخي الحذر في توقيت جميع خطوات الإجراءات لكل عينة على حدة بدلا من معالجة العينات بشكل جماعي.

3. ثقافة خلايا MEPM

ملاحظة: في ظل الظروف الموضحة هنا، لا تنجو الخلايا الظهارية الحنكية من المقطع الأول، مما يؤدي إلى ثقافة الخلايا الميكنشيمالية الحنكية النقية. استخدام تقنية معقمة لتنفيذ جميع الخطوات في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.

  1. أسبيرات والتخلص من برنامج تلفزيوني من أنبوب 1.5 مل, مع الحرص على عدم تجاهل الرفوف في هذه العملية. إضافة فورا 200 ميكرولتر من prewarmed (37 درجة مئوية) تريبسين (0.25٪) إلى كل أنبوب يحتوي على رفوف فخمة. لفترة وجيزة pipet الرفوف صعودا وهبوطا في التريبسين باستخدام تلميح ماصة 1000 ميكرولتر لتسريع المحاولة.
  2. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، ثم ماصة كل عينة صعودا وهبوطا مرة أخرى للمساعدة في تفريق الأنسجة. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق أخرى في 37 درجة مئوية، وماصة صعودا وهبوطا مرة أخرى لإكمال تفكك الأنسجة.
    ملاحظة: يجب أن تكون الرفوف تماما أو ما يقرب من فصل تماما وعلقت في تريبسين مع عدم وجود قطع مرئية من الأنسجة المتبقية.
  3. أضف 800 ميكرولتر من متوسط ثقافة MEPM (الخطوة 2.1) إلى كل أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي أنبوب 1.5 مل في 200 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. إزالة supernatant، وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة ثقافة MEPM.
  4. صفيح خلايا MEPM في لوحة معالجة بزراعة الأنسجة بشكل جيد تحتوي على وسيط ثقافة MEPM. السماح للخلايا بالالتصاق بالسطح البلاستيكي لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، فإن الغالبية العظمى (~ 90٪) من الخلايا نعلق. عند هذه النقطة، فإن الخلايا الملتزم بها تبدو متجانسة إلى حد ما، مع شكل مثلث أو ممدود قليلا.
  5. تغيير المتوسطة كل يوم عن طريق استباقة بلطف المتوسطة القديمة واستبدالها على الفور مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم دافئ دون الكالسيوم أو المغنيسيوم ل ~ 1 دقيقة. يستنشق برنامج تلفزيوني ، واستبدال 3 مل من المتوسطة ثقافة MEPM prewarmed.
  6. مرور الخلايا بمجرد أن تصبح التقاء 100٪.
    ملاحظة: يجب أن تتكاثر خلايا MEPM عن طريق مضاعفة العدد يوميا تقريبا.
    1. لتمرير الخلايا، يستنشق بلطف المتوسطة القديمة، وعلى الفور استبداله مع برنامج تلفزيوني دافئ دون الكالسيوم أو المغنيسيوم ل ~ 1 دقيقة. يستنشق برنامج تلفزيوني، واستبداله مع 0.5 مل من prewarmed 0.25٪ تريبسين.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية ل ~ 5 دقيقة، أو حتى الخلايا تنفصل عن سطح الطبق عندما هزت بلطف ذهابا وإيابا باليد. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف على الفور 5 مل من وسيط ثقافة MEPM قبل الحرب إلى الخلايا المريبة.
    3. باستخدام أنبوب مصلي 10 مل، وجمع بلطف الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي الأنبوب في 200 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. يستنشق التريبسين والمتوسطة، وإعادة إنفاق الخلايا في 3 مل من المتوسط ثقافة MEPM prewarmed. ماصة بلطف 1 مل من الخلايا في بئر واحد من طبق 6-جيدا، وإضافة 2 مل من المتوسطة ثقافة MEPM ليصل إجمالي حجم إلى 3 مل.
      ملاحظة: هذا يشكل انقسام 1:3 من الخلايا. يمكن تمرير MEPMs حتى ثلاث مرات. كثافة البذر من MEPMs مرنة إلى حد ما، وعدد الخلايا الموجودة يختلف تبعا للوعاء زراعة. ومع ذلك ، لا تتكاثر MEPMs بشكل صحيح عند تقسيمها بشكل متفرق للغاية ويجب أن تكون التقاء 20-25٪ على الأقل في طبقها الجديد بمجرد التزامها.

4. التبريد من خلايا MEPM

  1. مرة واحدة يتم بيليه خلايا MEPM جرب، resuspend الخلايا في المتوسطة ثقافة MEPM للحصول على تركيز ~ 1 × 106 خلايا / مل. Pipet الخلايا في cryovials، وإضافة تركيز النهائي من 5٪ dimethylsulfoxide في مخزون الخلية. قم بوضع غطاء للكظر، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق عكس اتجاهه، وضع القنينات على الفور في حاوية تجميد تبرد بمعدل 1 درجة مئوية/دقيقة.
  2. ضع المبرد في ثلاجة -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل cryovials إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  3. ذوبان cryopreserved خلايا MEPM
    1. إزالة cryovials من خزان النيتروجين السائل، وتذوب في درجة حرارة الغرفة حتى تبدأ محتويات لتصبح سائلة. إفراغ المحتويات في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 9 مل من وسيط ثقافة MEPM قبل الحرب.
    2. الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لبيليه الخلايا. Resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسطة ثقافة MEPM، وماصة الخلايا في بئر واحد من لوحة 6-جيدا. أضف 2 مل من متوسط ثقافة MEPM الدافئة ليصل إجمالي الحجم إلى 3 مل.
    3. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2. تغيير المتوسطة يوميا.

5. التصوير الحي للخلايا MEPM -- 2D الهجرة الجماعية المقايسة (الشكل 2)

  1. إعداد لوحة لاستخدامها للتصوير الحي.
    1. استخدام مقص جراحي صغير أو مشرط حاد لتقصير إدخال سيليكون معقم 2-جيدا إلى ارتفاع ~ 1 ملم. قم بإعداد إدراج لكل عينة قيد الاستخدام.
    2. باستخدام ملقط، ضع إدراج السيليكون تقصير 2-جيدا في وسط بئر من لوحة 6-جيدا. اضغط لأسفل على طول جميع الحواف لضمان الالتزام الكامل بها.
  2. تذوب الخلايا المبردة باتباع الخطوات الواردة في القسم 4.3 من هذا البروتوكول. عد MEPM الخلايا، والبذور 300 خلايا / مم2 من إدراج السيليكون تقصير في حجم إجمالي قدره 40-50 ميكرولتر MEPM الثقافة المتوسطة لكل بئر. زراعة الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2.
  3. في اليوم التالي، استعد للتصوير الحي بفاصل زمني.
    1. استخدم مجهر تباين المرحلة مع حاضنة على المسرح وقدرة تصوير تلقائية. إضافة المياه إلى خزان حاضنة على خشبة المسرح للحد من تبخر وسط الثقافة؛ تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وCO 2 إلى 5٪. السماح ~ 30 دقيقة للرطوبة لبناء قبل وضع طبق 6-جيدا في حاضنة على خشبة المسرح.
  4. استخدم إعدادات مساوية لما يلي للتصوير الفاصل الزمني.
    1. حدد الهدف 4x أن يكون حقول كبيرة من العرض ومرشح التباين المرحلة.
      ملاحظة: التركيز البؤري التلقائي، عينة البحث التلقائي، z-المكدس، والإضاءة التلقائية ليست ضرورية عادة.
    2. حدد حقلين مجهريين لكل بئر لالتقاط تجويف إدراج السيليكون المختصر. تأكد من أن جميع مواقع التصوير لديها التركيز الصحيح.
      ملاحظة: يمكن ضبط مستويات الصورة أثناء التصوير، ولكن هذا التعديل ليس ضروريا عادة.
    3. حدد نوع ملف إخراج الصورة المطلوب، ثم حدد خيارات ما بعد التصوير أو قم بإلغاء تحديدها، مثل إنشاء الفيديو التلقائي والعلامات المائية، حسب الرغبة. حدد تباين المرحلة كوضع تصوير إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظة: قد يؤدي استخدام العلامات المائية إلى إعاقة خطوات معالجة الصور اللاحقة.
    4. تعيين مدة التسجيل إلى 72 ساعة. قم بتعيين البرنامج لالتقاط الصور كل 10 دقائق.
      ملاحظة: عادة ما يكون التصوير 48 ساعة فقط مطلوبا، ولكن يمكن إيقاف التصوير في أي وقت قبل علامة 72 ساعة دون فقدان الصور التي تم التقاطها بالفعل.
    5. تأكد من أن الغرفة البيئية تعمل كما هو مطلوب في 5.3.1. حفظ هذهالإعدادات (الروتين)وبدء التصوير.
  5. استمر في التصوير حتى 72 ساعة (أو الوقت المحدد).

6. التصوير الحي للخلايا MEPM في فحص إصلاح الجرح (الشكل 3)

  1. إعداد لوحة لاستخدامها للتصوير الحي. باستخدام ملقط، ضع إدراج السيليكون العقيم 2-جيدا في وسط بئر من لوحة 6-جيدا، واضغط باستمرار على طول جميع الحواف لضمان الالتزام الكامل به. إعداد إدراج واحد 2-جيدا لكل عينة المستخدمة.
  2. تذوب الخلايا المبردة باتباع الخطوات الواردة في القسم 4.3 من هذا البروتوكول. عد خلايا MEPM، وإذا لزم الأمر، ركز الخلايا على ما لا يقل عن 350 خلية/ميكرولتر.
  3. البذور 1400 خلايا / مم2 في إدراج السيليكون في حجم 100 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة MEPM لكل بئر. زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2،وتغيير المتوسطة كل يوم.
  4. بعد 48 ساعة إعداد المجهر للتصوير الحي الفاصل الزمني كما هو موضح في القسمين 5.3 و 5.4. مباشرة قبل وضع الخلايا في حاضنة على خشبة المسرح، إضافة 3 مل من المتوسطة ثقافة MEPM prewarmed إلى البئر (ولكن خارج إدراج)، ومن ثم إزالة بعناية إدراج السيليكون.
    ملاحظة: الجدار الفاصل بين الغرفتين يترك فجوة هي "الجرح".
  5. بدء التصوير الفاصل الزمني كما هو موضح في 5.4، مع الاختلافات التالية:
    1. استخدم هدف تكبير أعلى (على سبيل المثال، 10x). لالتقاط إغلاق الجرح، حدد 5 حقول رؤية على طول كل جرح، بحيث يكون الجرح موازيا للمحور الرأسي للصورة.
  6. توقف عن التصوير بعد 72 ساعة أو عندما تكون الجروح قد أغلقت بالكامل.

7. التحليل الحسابي لتسلسلات الصور الفاصلة زمنيا

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات التالية على جهاز كمبيوتر مجهزة أدوات حسابية قياسية، مثل مترجم بيثون، مترجم C، و shell (راجع جدول المواد).

  1. تحليل الالتقاء
    ملاحظة: يمكن استخدام هذا الإجراء لتقدير انتشار الخلايا ضمن ثقافة متناثرة أو لتحديد تجارب إغلاق الجرح. للكشف عن المناطق التي تشغلها الخلايا، يتم تطبيق عتبة تجزئة على الانحراف المعياري المحلي لسطوع الصورة. وقد سبق وصف المدونة من قبل وو وآخرون33 ونيوفيلد وآخرون34 وهي متاحة في http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. تحديد عتبة التجزئة للصور. كمثال، لرؤية التقسيم مع عتبة 4، إصدار الأمر
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4-إخراج الاختبار.jpg
      ثم تحقق من الإخراج (الإخراج.jpg).
      ملاحظة: إذا كانت العتبة منخفضة جدا، يتم تصنيف مناطق الخلفية في ميكروجراف كخلايا مغطاة. وعلى النقيض من ذلك، إذا كانت العتبة مرتفعة جدا، لا تصنف المناطق المغطاة بالخلايا على هذا النحو. القيمة الحد الأمثل يحتفظ كلا الخطأين في الحد الأدنى.
    2. استخدم النص area.sh المتوفر لحساب قيم الالتقاء لتسلسل الصور ك
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > التقاء.dat
      ملاحظة: يتم التحقق من قيمة عتبة التمييز 4 في الخطوة 1، ويتم تخزين النتائج في التقاء الملف.dat. عن طريق فرز الصور في المجلدات المناسبة، يمكن استبدال قائمة أسماء ملفات الصور ببطاقة البدل:
      area.sh -S4 * .jpg > التقاء.dat
    3. بالنسبة لتجارب إغلاق الجروح، قم بتحويل بيانات الالتقاء A(t)- حجم المنطقة المغطاة بالخلايا المعبر عنها كنسبة مئوية كدالة لسرعة الانتشار V من الوقت إلى حافة الجرح ك
      figure-protocol-1
      حيث يشير w إلى عرض الحقل وdA/dt هو مشتق الوقت ل A(t)، أي معدل توسيع المنطقة المغطاة بالخلايا.
  2. خريطة حركة الخلية
    1. تنفيذ خوارزمية قياس سرعة تصوير الجسيمات (PIV) لتوصيف حركة الخلية، واستخراج مدى الحركة المحلية "التدفق البصري" بين أزواج الصور، ولكن ليس لتحديد الخلايا الفردية.
      ملاحظة: هنا، يتم استخدام حجم نافذة أولية من 50 ميكرومتر، كما هو موضح بالتفصيل من قبل زامير وآخرون35 وCzirokوآخرون. ينتج عن تحليل PIV حقل سرعة v(x,t) لكل إطار صورة t وموقع (داخل الصورة) x.
    2. استخراج متوسط سرعة حركة الخلية من v(x,t) كمتوسط مكاني محسوب فوق المساحة المحتلة للخلية، كما هو محدد في القسم 7.1.
  3. تعقب الخلايا اليدوي
    ملاحظة: بينما يوفر تحليل PIV تقييما تلقائيا لحركية الخلية، فإن التركيز على سلوك الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التتبع اليدوي. في حين توفر العديد من الأدوات هذه الوظيفة، من المفيد جدا إذا كان يمكن تعديل علامات وضعه يدويا بعد موضعها الأولي، وإذا كان يمكن تنفيذ تتبع سواء إلى الأمام والخلف في الوقت المناسب.
    1. قم بإجراء تعقب الخلايا باستخدام أداة python المطورة خصيصا (http://github.com/donnagreta/cm_track) ، والتي توفر أيضا وظائف المحرر الأساسية مثل حذف شرائح المسار.
      ملاحظة: هذه الأداة تتبع اليدوية ينتج المواضع P(i,t) الخلية i في وقت t في ملف نصي، واستدعاء ك
      cm_track.py -i الصور / -o المسار.dat
      حيث الصور الفاصل الزمني في الصور المجلد / ويتم جمع البيانات موقف في مسار الملف.dat (الشكل 4).

figure-protocol-2
الشكل 4:تحليل مسارات الخلايا الفردية. (أ) يتم عرض صور دقيقة الفاصل الزمني على النقيض من المرحلة إلى ( B، C) إجراء تتبع يدوي ، والذي يميز الخلايا (النقاط الخضراء). (د)يتم تخزين مواقع الخلية (س، ص) لكل خلية تتميز برمزها ولكل إطار f. (E) يمكن تراكب المسارات على الصور الدقيقة وترمز إلى اللون للإشارة إلى المعلومات الزمنية. وكمثال على ذلك، في كل مسار، تشير لوحة الألوان من الأزرق إلى الأحمر إلى شرائح المسار اللاحقة تدريجيا، مع وضع علامة حمراء وزرقاء على مواقع الخلايا الأولية والأخيرة على التوالي. (F)يمكن استخراج الخصائص الإحصائية المختلفة للمسارات، مثل متوسط الإزاحة المربعة، واستخدامها لتوصيف حركة مجموعات الخلايا المختلفة، والتي تشمل في هذا المثال النوع البري (wt، الأزرق)، والضربات القاضية (kd، الأحمر) خلايا MEPM. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. مسارات التراكب على الصور باستخدام أداة ثانية، يتم استدعاؤها ك
    visdat.py -d المسار.dat -i الصور / -س تراكب / -l999 -r3 -C2
  2. جمع الصور مع مسارات مضافا في تراكب المجلد.
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم تخزين بيانات موضع الخلية في مسار الملف.dat،بينما تسلسل الصورة الفاصل الزمني داخل صور المجلد. تتحكم بقية المعلمات في الطول الأقصى للمسارات المرسومة (-l)، وحجم الرموز (-r)، ونظام الألوان (-C) المستخدم.
  1. تحليل مسارات الخلايا الفردية
    1. تميز المسارات بطول المسار الإجمالي
      figure-protocol-3,
      و صافي الإزاحة نحو الجرح
      figure-protocol-4,
      حيث X يدل على إسقاط P في الاتجاه عمودي على الجرح: تنسيق س من المواقف عندما يكون الجرح موازيا لمحور ص.
    2. حساب كفاءة التوجيه كما هو الحال figure-protocol-5 بالنسبة لكل خلية ط والوقت نقطة ر37. تميز الثقافات حسب متوسط عدد السكان لهذه التدابير خلية واحدة، وتقييمها في نقطة زمنية مناسبة ر.
  2. حركة تدفق جماعية للخلايا
    1. تميز الارتباطات المكانية المحلية لحركات الخلايا بمتوسط سرعة الخلايا الأخرى التي تقع بالقرب من خلية متحركة ، كما هو موضح سابقا38،39.
      ملاحظة: يتوفر التعليمات البرمجية الحسابية في https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. محاذاة نظام مرجعي مع الاتجاهات الأمامية والخلفية واليسارية واليمينية لكل متجه v(x,t) (الشكل 5A). تعيين كل من الخلية المحيطة أو PIV متجه السرعة إلى الخلية المكانية المناسبة للنظام المرجعي(الشكل 5B). كرر الإجراء كما يخدم كل متجه كمنشأ النظم المرجعية (الشكل 5C، D) بحيث يتم تعيين متجه سرعة معينة إلى صناديق متعددة.
        ملاحظة: قد تكون نقطة بيانات أمام متجه، و إلى يسار واحد آخر.
      2. تدوير النظم المرجعية في اتجاه مشترك (الشكل 5C، F) وتجمع لهم ( الشكل5G).
        ملاحظة: متوسط كل سلة من بيانات السرعة المجمعة هو متجه السرعة(U)الذي يدل على الارتباط المكاني: المتوسط هو مقياس لمكون السرعة المشتركة(الشكل 5H).
      3. تناسب حقول تدفق U(x) مع دالة figure-protocol-6 أسية ، حيث a و x0 و U0 هي المعلمات المناسبة. من بين المعلمات الثلاثة المناسبة، ركز على x0، طول الارتباط (الشكل 5I، J)، وهي المسافة المميزة التي تختفي فيها الارتباطات بين السرعة والسرعة المحلية.

figure-protocol-7
الشكل 5: يتم استخدامتوصيف تشكيل تيار من الخلايا المستزرعة. (A, D) المرحلة النقيض من الوقت الفاصل الصور من الشكل 4A لتحديد حركات الخلية. لكل خلية متحركة، تم محاذاة إطار مرجعي (أزرق) وصناديق مكانية (بيضاء) لتصنيف الخلايا المجاورة على أنها في الأمام أو الخلف أو اليسار أو اليمين. (B, E) سرعة الخلايا المجاورة (ناقلات سوداء) كانت مرتبطة بنفس الإطار المرجعي(C, F). تم تكرار هذا الإجراء لكل خلية ونقطة زمنية. (G)بعد تجميع هذه المعلومات المحلية، كل سلة سوف تحتوي على ناقلات سرعة متعددة (رمادي)، والتي يمكن أن تكون متوسطة لتحديد متوسط سرعة الحركة المشتركة (أسهم أرجواني) في مواقع مختلفة بالنسبة لخلية متوسطة الحركة. (H)وخريطة السرعة المتوسطة وبالتالي يميز سرعات الخلية النموذجية في مواقع مختلفة بالنسبة لخلية متحركة. (I,J) وأخيرا، تم أخذ عينات من هذا الحقل على طول المحور الأمامي الخلفي (الموازي) وكذلك على طول المحور الأيسر واليميني (المتعامد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح تشريح الرفوف الفخمة في الشكل 1. تم تصميم تسلسل الشقوق لتقليل انزلاق الأنسجة. بعد إزالة الرأس (الشكل 1A، B)، تتم إزالة الفك السفلي ( الشكل1B، C). شق الجزء العلوي من الرأس (الشكل 1C, D) يتم لتحقيق الاستقرار في الأنسجة عند وضعها رأسا على عقب ( الشكل1E) لتصور (الشكل 1E, خطوط منقط

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ارتفاع الجرف بالاتال يشكل الرأسي إلى الأفقي إعادة عرض الحدث1،3،4،9،11. ومن المسلم به أن هذه العملية إعادة عرض يتطلب الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي أن تتصرف بشكل تنسيقي. تظهر التحليلات مع خلايا MEPM البرية أن سلوك الخلية هذا جوهري ويمكن أن يكون كمي21. وهكذا، يمكن استخدام هذه المقايسات للكشف عن عيوب ارتفاع الجرف الفخم الأولية في نماذج الما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا المشروع جزئيا المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة DE026172 (I.S.)، وGM102801 (A.C). كما تم دعم I.S. جزئيا من منحة مركز التميز البحثي الطبي الحيوي (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM104936)، ومنحة امتياز أبحاث البحوث الطبية الحيوية من كانساس IDeA (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM103418)، ومنحة مركز كانساس لأبحاث الإعاقات الذهنية والتنموية (KIDDRC) (U54 يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، HD090216).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دورق ، 250 مل (x2)فيشر ساينتفيكFB-100-250
CO2< / sub>ماثيسون غازUN1013
أنابيب مخروطية ، 15 مل (x1)التحليل
Debianلصور الفاصل الزمني
L-Glutamine و Sodium PyruvateCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH ، 100٪Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisherScientific AMAFD1000
EVOS حاضنة على خشبة المسرحThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS حامل وعاء على خشبة المسرح ، لوحات متعددة الآبارThermoFisher ScientificAMEPVH028
مصل الأبقار الجنينيCorning35-010-CV
نقطة دقيقة # 5 ملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ (x2)أدوات العلوم الدقيقة11295-10تشريح
معقم حمام حبةأدوات العلوم الدقيقة18000-45
أنابيب الطرد الدقيقة ، 1.5 ملAvant2925
مقص دقيق من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مستقيمRobozRS-5910تشريح
NucBlue (Hoechst) مجسات جاهزة مباشرةThermoFisher ScientificR37605
محلول بنسلين ستربتومايسين ، 100xCorning30-002-CI
إدراج سيليكون ، 2 بئرIbidi80209
صغيرة مثقبة من الفولاذ المقاوم للصدأأدوات العلوم الدقيقةMC17C
زنبرك تشريح مقص ، 4 ممأدوات العلوم الدقيقة15018-10
معقمة 10 سم مقاس (صفائح)كورنينج430293
لوح (لواحات) معقمة 12 بئرPR1MA667512
معقمة 6 آبار ماصة
ThermoFisher Scientific202-1S
التربسين ، 0.25٪ThermoFisher Scientific25200056
الحسابي لنظام التشغيل Midwest Scientific C15B Dulbecco's Modified Eagles Medium / High Glucose مع 4 ملي مولار أداة ملعقة نقل ال 140675 لمبات البلاستيكية المعقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463(2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186(2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006(2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Collective Cell MovementPalatal Shelf ElevationMouse Embryo DissectionCell Migration AssayWound Repair AssayMesenchymal RemodelingCraniofacial DevelopmentCell Motility Analysis

مقالات ذات صلة