مقالة منهجية

فحصان للعدوى لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة في المطثية البيضاء باستخدام المطثية العلبة

DOI:

10.3791/62170

⸱

مايو 17, 2021

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تسبب مسببات الأمراض الفطرية الانتهازية التهابات مهددة للحياة وكذلك التهابات طفيفة ، ولكن غالبا ما يتم تجاهل الأنماط الظاهرية غير المميتة عند دراسة الفوعة. لذلك ، قمنا بتطوير نموذج الديدان الخيطية الذي يراقب كلا من جوانب البقاء والتكاثر للمضيف للتحقيق في الفوعة الفطرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن مسببات الأمراض يمكن أن تكون مميتة للإنسان ، فإن العديد منها يسبب مجموعة من أنواع العدوى ذات الأنماط الظاهرية غير المميتة. المبيضات البيضاء ، وهي مسببات الأمراض الفطرية الانتهازية للإنسان ، هي رابع أكثر الأسباب شيوعا لعدوى المستشفيات التي تؤدي إلى ~ 40٪ من الوفيات. ومع ذلك ، فإن عدوى المطثية البيضاء الأخرى أقل حدة ونادرا ما تكون مميتة وتشمل داء المبيضات الفرجي المهبلي ، مما يؤثر على ~ 75٪ من النساء ، بالإضافة إلى داء المبيضات الفموي البلعومي ، ويؤثر في الغالب على الرضع ومرضى الإيدز ومرضى السرطان. بينما تستخدم نماذج الفئران بشكل متكرر لدراسة التسبب في المطثية البيضاء ، فإن هذه النماذج تقيم في الغالب بقاء المضيف وهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ومحدودة التكرار. لذلك ، تم تطوير العديد من أنظمة النماذج المصغرة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة السوداء ، ودانيو ريريو ، وجاليريا ميلونيلا ، وCaenorhabditis elegans ، لدراسة المطثية البيضاء البيضاء. هذه النماذج المصغرة مناسبة تماما لفحص المكتبات الطافرة أو الخلفيات الجينية المتنوعة ل C. albicans. نصف هنا طريقتين لدراسة عدوى المطثية البيضاء باستخدام C. elegans. الأول هو اختبار الخصوبة الذي يقيس تكاثر المضيف ويراقب بقاء المضيفين الفرديين. والثاني هو مقايسة توسيع النسب التي تقيس كيف تؤثر عدوى المطثية البيضاء على نمو السكان المضيفين على مدى أجيال متعددة. توفر هذه المقايسات معا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم ضراوة المطثية البيضاء بسرعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيضات البيضاء هي مسببات الأمراض الفطرية الانتهازية للبشر المقيمين في منافذ مختلفة ، بما في ذلك تجويف الفم والجهاز الهضمي والجهاز البوليالتناسلي 1. في حين أن المطثية البيضاء عادة ما تكون متزاملة ، إلا أنها تسبب التهابات الغشاء المخاطي ومجرى الدم ، والتي يمكن أن تكون مميتا. تعتمد شدة عدوى المطثية البيضاء على وظيفة المناعة المضيف ، حيث يكون الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة أكثر عرضة للإصابة بالعدوى من الأفراد الأصحاء1. بالإضافة إلى العوامل المتعلقة بالمضيف ، C. albicans لها العديد من سمات الفوعة التي تشمل ، الخيوط ، وتكوين الأغشية الحيوية ، وإنتاج بروتينات الأسبارياز الإفرازية (SAPs) ، والتي تعمل على تعزيز التصاق وغزو C. albicans في الخلايا الظهارية المضيفة2 ، والمبيضات ، وهو سم الببتيد المحلل الخلوي3،4. يشير هذا معا إلى أن C. albicans ضراوة هي نمط ظاهري معقد ناتج عن تفاعل بين العامل الممرض والبيئة المضيفة. لذلك ، من الأفضل دراسة التحقيق في الفوعة باستخدام الكائنات الحية النموذجية التي تعمل كبيئات مضيفة ، على عكس الأساليب المختبرية.

تم تطوير العديد من النماذج المضيفة ، بما في ذلك الكائنات الفقارية واللافقارية ، لدراسة عدوى المطثية البيضاء البيضاء . غالبا ما يستخدم نموذج الفئران ، الذي يعتبر المعيار الذهبي ، لجهاز المناعة التكيفي والفطري ، والقدرة على مراقبة تطور المرض بشكل منهجي وفي أعضاءمحددة 5. ومع ذلك ، هناك قيود كبيرة على هذا النموذج المضيف ، بما في ذلك تكاليف الصيانة ، وعدد قليل من النسل ، وانخفاض الطاقة والقابلية للتكاثر المرتبطة بأحجام العينات الصغيرة5. لذلك ، تم تطوير كائنات نموذجية أخرى أكثر بساطة مثل أسماك الزرد (Danio rerio) ، وذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة السوداء) ، وعثة الشمع (Galleria mellonella) ، والديدان الخيطية (Caenorhabditis elegans). هذه الكائنات الحية النموذجية غير الثديية أصغر حجما ، وتتطلب صيانة معملية أقل ، وتسمح أحجام العينات الأكبر بمزيد من القوة وقابلية التكاثر مقارنة بنماذج الفئران. كل نموذج من هذه النماذج له مزايا وعيوب محددة يجب مراعاتها عند اختيار نموذج العدوى. يوفر G. mellonella بيئة أكثر تشابها من الناحية الفسيولوجية مع البشر حيث يمكن زراعته عند 37 درجة مئوية وله خلايا بلعميةمختلفة 7. علاوة على ذلك ، يسمح هذا النموذج بالحقن المباشر للقاحمعين 7. ومع ذلك ، لا يوجد جينوم متسلسل بالكامل ، ولا توجد طريقة ثابتة لإنشاء سلالات متحولة. على غرار G. mellonella ، يسمح نموذج D. rerio بالحقن المباشر للقاح معين5،7. كما أن لديها كلا من نظام المناعة التكيفي والفطري5 ، وهو فريد من نوعه لهذا النموذج غير الثديي ، ومع ذلك يتطلب خزانات تربية مائية للحفاظ عليها. D. melanogaster و C. ايليجانس لها مزايا وعيوب متشابهة ، والتي تشمل الجينومات المتسلسلة بالكامل التي يسهل التلاعب بها وتوليد سلالات متحولة7 ولكن ليس لديها مناعة تكيفية أو سيتوكينات7. من بين كل هذه النماذج غير الثديية ، C. ايليجانس لديها أسرع دورة حياة ، وتخصيب ذاتيا لتوليد أعداد كبيرة من النسل المتطابق وراثيا ، وهي الأكثر قابلية للشاشات واسعة النطاق6،7،8. C. ايليجانس كان قويا للغاية للفحص عالي الإنتاجية للأدوية المضادة للفطريات9،10 ، وتحديد عوامل الفوعة7 ، وتحديد شبكات الدفاع المضيف الخاصة ب C. albicans 11. يحتوي الجهاز المناعي الفطري في C. ايليجانس على مكونات متعددة محفوظة بشكل كبير مع البشر12. تشمل الدفاعات الفطرية المضيفة إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات13 (AMPs) وأنواع الأكسجين التفاعلية14،15،16.

تقاس شدة عدوى المطثية البيضاء في الغالب من خلال بقاء المضيف ولكن لا يمكنها التقاط الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة. التكاثر هو أحد الجوانب التي غالبا ما يتم تجاهلها في لياقة المضيف ، لكن العديد من الدراسات تشير إلى أن المطثية البيضاء تؤثر على التكاثر عن طريق تقليل صلاحية المنوية17،18 ، مما يشير إلى أن هذا قد يكون جانبا مهما من لياقة المضيف للدراسة. لذلك ، فإن تأثير عدوى المطثية البيضاء على خصوبة المضيف هو طريقة مفيدة لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة. لقد طورنا مقياسين للعدوى باستخدام C. ايليجانس للتحقيق في كل من الأنماط الظاهرية للبقاء على قيد الحياة والتكاثر في المضيفين الأصحاء19،20. نصف هنا كلا من فحوصات الخصوبة وتوسيع النسب. تقيس الخصوبة كلا من النسل المنتج وبقاء المضيفين الفرديين ، ويقيم توسع النسب عواقب العدوى على مدى ثلاثة أجيال مضيفة. نوضح كيف يمكن استخدام هذه المقايسات لفحص طفرات حذف C. albicans لالتقاط الاختلافات الدراماتيكية والدقيقة في الأنماط الظاهرية للضراوة المميتة وغير المميتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخطوات التحضيرية للتجارب

  1. تحضير مزارع المطثية البيضاء والإشريكية القولونية
    ملاحظة: السلالات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في الجدول 1.
    1. الحفاظ على سلالات المطثية البيضاء والإشريكية القولونية كمخزونات من الجلسرين عند -80 درجة مئوية.
    2. باستخدام عود أسنان معقم ، قم بإعادة سلالة C. albicans المرغوبة على سكر العنب الببتون الخميرة الصلبة (YPD) (1٪ مستخلص الخميرة ، 2٪ باكتوبتون ، 2٪ جلوكوز ، 1.5٪ أجار ، 0.004٪ أدينين ، 0.008٪ يوريدين) وينمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا كانت سلالة المطثية البيضاء ذات التغذية ، فاستكمل الوسائط بالأحماض الأمينية الضرورية.
    3. باستخدام حلقة معقمة أو عود أسنان ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من المطثية البيضاء في 2 مل من YPD السائل. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الرج لمدة 24 ساعة.
    4. باستخدام عود أسنان معقم ، ضع خطا للإشريكية القولونية (OP50) على مرق لوريا (LB ؛ 10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 15 جم / لتر أجار). احتضن بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
    5. تلقيح مستعمرة OP50 واحدة في 50 مل من LB. احتضن عند 30 درجة مئوية مع الرج طوال الليل.
  2. إعداد وسائط نمو الديدان الخيطية
    1. في قارورة سعة 2 لتر ، أضف 29 جم من مسحوق وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM ؛ 17.5 جم / لتر أجار ، 3.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 2.5 جم / لتر بيبتون ، .005 جم / لتر كوليسترول) إلى 1 لتر من الماء واخلطها مع شريط التقليب.
    2. لمنع فرط نمو الإشريكية القولونية والسماح بتكاثر المطثية البيضاء مكمل NGM مع 0.2 جم / لتر من كبريتات الستربتومايسين بعد التعقيم.
      ملاحظة: في حالة استخدام NGM لصيانة الديدان الخيطية ، فإن الستربتومايسين غير مطلوب.
  3. الحفاظ على أعداد الديدان الخيطية
    1. انشر 300 ميكرولتر من ثقافة الإشريكية القولونية طوال الليل على ألواح أجار NGM المحضرة باستخدام موزعة معدنية. سيشار إلى هذه التقنية باسم البذر.
    2. اترك الأطباق تجف في درجة حرارة الغرفة (RT). تنمو الصفائح بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
    3. حافظ على عدد الديدان الخيطية عن طريق تقطيعها كل 3-4 أيام على صفيحة NGM المصنفة حديثا مع الإشريكية القولونية. يحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية. التقطيع هو تقنية تستخدم لنقل مجموعة عشوائية من الديدان الخيطية بسرعة إلى صفيحة مصنفة حديثا ، مما يسمح للسكان بالتكاثر. للقيام بذلك ، استخدم ملعقة معقمة لقطع مربع صغير (1 × 1 بوصة) من لوحة أجار NGM. انقل المربع بعناية إلى لوحة NGM جديدة مع الجانب بحيث تكون الديدان الخيطية متجهة لأسفل على أجار8 الجديدة.
      ملاحظة: C. ايليجانس التي يتم الاحتفاظ بها عند 20 درجة مئوية ستنتج ذرية ~ 48 ساعة لاحقا وهو أمر مفيد للنظر فيه عند مزامنة مجموعة من الديدان الخيطية. C. ايليجانس التي يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية سوف تتطور وتتكاثر بشكل أسرع وسيكون للسكان الذين يتم الحفاظ عليهم عند 15 درجة مئوية نمو أبطأ.
  4. تزامن السكان الديدان الخيطية
    1. ابدأ بوجود أعداد الديدان الخيطية الموجودة في NGM/OP50.
    2. الماصة ~ 3 مل من المخزن المؤقت M9 على لوحة NGM التي تحتوي على الديدان الخيطية. اغسل بيض الديدان الخيطية من الطبق واستخدم طرف الماصة برفق لكشط البيض من الأجار (يميل إلى الالتصاق). باستخدام ماصة P1000، انقل السائل الذي يحتوي على كل من البيض والديدان إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. لتقييم عدد البيض الذي لا يزال على الطبق ، استخدم مجهر تشريح لإلقاء نظرة على الأجار.
    3. جهاز طرد مركزي مخروطي لمدة دقيقتين عند 279 × جم و RT.
    4. قم بإزالة المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الديدان الخيطية.
    5. أضف 3 مل من محلول التبييض بنسبة 25٪ ("الحذر" عند المناولة).
    6. اقلب الأنبوب لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن الديدان الخيطية ميتة باستخدام مجهر التشريح - ستكون مستقيمة وغير متحركة.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى قتل الديدان الخيطية الموجودة فقط. لن تتأثر سلامة البيض.
    7. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 279 × جم و RT.
    8. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 3 مل M9.
    9. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 279 × جم و RT.
    10. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من M9.
    11. باستخدام مجهر تشريح ، تحقق من تركيز البيض عن طريق سحب 5 ميكرولتر من البيض على صفيحة بتري صغيرة. يجب أن يكون التركيز المثالي بين 20-100 بيضة. إذا كانت الثقافة مخففة للغاية ، فقم بتركيز المحلول عن طريق الطرد المركزي وإزالة السوائل الزائدة. إذا كانت المزرعة شديدة التركيز ، أضف المزيد من M9 حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب.
  5. تحضير المطثية البيضاء ومزارع الإشريكية القولونية لعدوى الديدان الخيطية (البذر).
    1. تحضير حل فارغ. في كوفيت ، امزج 900 ميكرولتر من ddH2O و 100 ميكرولتر من YPD السائل.
    2. أدخل الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي. اضبط الطول الموجي على 600 نانومتر باستخدام السهم لأعلى. انقر فوق الزر "0 ABS 100٪ T" لتعيين الحل الفارغ.
    3. في كوفيت جديد ، امزج 900 ميكرولتر من ddH2O و 100 ميكرولتر من زراعة الخميرة الليلية. أخرج المحلول الفارغ من مقياس الطيف الضوئي وأضف الكوفيت الذي يحتوي على محلول الخميرة. سجل الكثافة البصرية المعروضة على الشاشة (لا تضغط على أي أزرار). اضرب القراءة في 10 (كان محلول الخميرة المقاس 1 في 10 تخفيف).
    4. تطبيع الثقافة إلى 3.0 OD600 / مل مع ddH2O في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. 1 OD600 هو حوالي 3 × 10-7 CFU / مل21.
      ملاحظة: إذا كانت قراءة OD600 6.7 ، 3 OD / 6.7 OD = 0.447 مل ، أضف 447 ميكرولتر من C. albicans ثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (16 ، 873 × جم) لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 1 مل من ddH2O.
    5. انقل ثقافة الإشريكية القولونية طوال الليل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    6. جهاز الطرد المركزي للثقافة عند 279 × جم لمدة دقيقتين في RT.
    7. استنشق غالبية المادة الطافية ، تاركا ~ 1 مل.
    8. أعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يزن مسبقا.
    9. قم بالدوران لأسفل أنبوب الطرد المركزي الدقيق بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
    10. باستخدام ماصة p1000 ، قم بإزالة المادة الطافية ووزن الحبيبات النهائية.
    11. تمييع الإشريكية القولونية إلى 200 ملغم/مل في DDH2O.
    12. استخدم حسابات المزيج الرئيسي (الجدول 2) وقم بتوسيع نطاقه بشكل مناسب.

2. فحص الخصوبة

ملاحظة: البيانات التمثيلية الموضحة في الجدول التكميلي 1 ورسم تخطيطي موضح في الشكل 1 أ.

  1. الحصول على أو إعداد ما يلي: ألواح بتري مقاس 35 مم × 10 مم ، NGM مكملة بكبريتات الستربتومايسين 0.2 جم / لتر ، بكتيريا القولونية OP50 ، LB ، C. albics ، YPD ، Wire Pick ، M9 Buffer (3.0 جم / لتر KH2PO4 ، 6.0 جم / لتر Na2HPO4 ، 0.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 1.0 جم / لتر NH4Cl) ، 15 مل أنابيب مخروطية الشكل.
    قبل يومين من التجربة
  2. تلقيح C. albicans سلالات في 2 مل من YPD و E. coli (OP50) في 50 مل من LB وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد ألواح بتري مقاس 35 مم × 10 مم مع NGM مكملة ب 0.2 جم / لتر من كبريتات الستربتومايسين. يجب أن يستمر عدد اللوحات المعدة للتجربة بأكملها. العدد الموصى به من التكرارات هو 10 لكل علاج. ل 10 نسخ مكررة ، سيتم استخدام 70 لوحا. 1 لتر من NGM سوف يصنع ~ 250 لوحا.
    قبل يوم واحد من التجربة
  4. بذرة 35 مم × 10 مم NGM أجار صفائح مكملة بالستربتومايسين لليوم 0 واليوم 2 واليوم 3 وفقا لبروتوكول البذر الموضح أعلاه مع تركيز ماستر ميكس (الجدول 2). ماصة الكمية المناسبة من الماستر ميكس في وسط اللوحة. إن نشر المزرعة ليس ضروريا لأن بقعة واحدة من النمو الميكروبي كافية لتغذية المضيف وتسمح لنا بالتعرف بسهولة على العوائل خارج البذرة. احتضن اللوحات طوال الليل في RT.
    ملاحظة: يحتوي اليوم 0 mastermix على 50 ميكرولتر من "البذور" لكل تكرار لكل معالجة تجريبية. تتضمن الأيام 2-7 10 ميكرولتر من "البذور" لكل تكرار لكل معالجة تجريبية. لا توجد لوحة في اليوم 1 لأن الديدان الخيطية ستصل إلى المرحلة L4 بعد 48 ساعة من مزامنتها على لوحة اليوم 0. بمجرد وصولهم إلى L4 ، سيتم نقل الديدان الخيطية الفردية إلى لوحات اليوم 2.
ل 1 النسخ المتماثلحالة التحكم في الإشريكية القولونية (OP50)المطثية البيكان والشرقية القولونية (OP50) حالة العلاج
50 ر.بH2Oمجموع50 ر.بج. ألبكنسH2Oمجموع
اليوم 06.25 ul43.75 ميكروتر50 أولتر6.25 ul1.25 ميكرولتر42.5 ميكرول50 أولتر
الأيام 2-71.25 ميكرولتر8.75 ul10 ميكرولتر1.25 ميكرولتر.25 ul8.5 ميكرولتر10 ميكرولتر

الجدول 2: أحجام Mastermix من بكتريا قولونية و C. albicans المزارع اللازمة لإصابة الديدان الخيطية لمقايسة الخصوبة.

يوم التجربة (اليوم 0)

  1. قم بمزامنة الديدان الخيطية والصفيحة ~ 50 بيضة في كل يوم 0 تكرار للوحات التحكم (OP50 فقط) وألواح المعالجة (C. albicans + OP50). احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    اليوم 2
  2. انقل ديدان خيطية L4 واحدة عن طريق اختيار8 من لوحة اليوم 0 إلى كل من الألواح المصنفة في اليوم 2 المكررة. يمكن التعرف على مضيفات L4 من خلال جيب صغير في منتصف الجانب الظهري من أجسامهم22. انقل الديدان الخيطية المفرغة والناضجة من نفس النوع من الألواح المصنفة (على سبيل المثال ، يجب نقل الديدان الخيطية L4 من لوحات التحكم D0 إلى لوحات التحكم في اليوم 2).
  3. تلقيح مزارع المطثية البيضاء المطلوبة في 2 مل من YPD والإشريكية القولونية (سلالة OP50) في 50 مل من LB.
    اليوم 3
  4. انقل الديدان الخيطية من لوحات اليوم 2 إلى لوحات اليوم 3 المصنفة ، مع تتبع كل نسخة مكررة (على سبيل المثال ، يجب نقل النسخ المتماثل A من اليوم 2 إلى لوحة Replicate A Day 3).
  5. احتضان أطباق اليوم 2 (تحتوي فقط على البيض) واليوم 3 (تحتوي على شخص بالغ واحد) عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  6. بذور 35 مم × 10 مم NGM مكملة بألواح الستربتومايسين لليومين 4 و 5 باستخدام 10 ميكرولتر من الماستر ميكس لكل طبق (الجدول 2) واحتضان الألواح في RT لمدة 24 ساعة.
    يوم 4
  7. انقل الديدان الخيطية من أطباق اليوم 3 إلى أطباق اليوم 4.
  8. احتضان أطباق اليوم 3 واليوم 4 عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  9. باستخدام نطاق تشريح ، احسب النسل القابل للحياة لكل لوحة Day 2. لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 2.
    ملاحظة: يشير الخريبة إلى الديدان الخيطية التي تختفي على اللوحة. يمكن أن يحدث هذا عندما تزحف الديدان الخيطية من اللوحة. على الرغم من أنها أقل شيوعا خلال نافذة ال 24 ساعة ، إلا أن جثث الديدان الخيطية الميتة تتفكك في الأجار مما يؤدي أيضا إلى الرقابة. لا يتم تضمين البيانات الخاضعة للرقابة في التحليل النهائي لبيانات النسل والبقاء على قيد الحياة.
  10. تلقيح مزارع جديدة من سلالات المطثية البيضاء في 2 مل من YPD و E. coli (OP50) في 50 مل من LB.
    اليوم 5
  11. انقل الديدان الخيطية من أطباق اليوم 4 إلى أطباق اليوم 5.
  12. احتضن أطباق اليوم 4 واليوم 5 عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  13. عد النسل القابل للحياة لكل لوحة يوم 3. لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 3.
  14. بذرة 35 مم × 10 مم NGM مكملة بألواح الستربتومايسين لليومين 6 و 7 باستخدام 10 ميكرولتر من الماستر ميكس لكل طبق (الجدول 2) واحتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    يوم 6
  15. انقل الديدان الخيطية من أطباق اليوم 5 إلى أطباق اليوم 6.
  16. احتضان أطباق اليوم 5 واليوم 6 عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  17. عد النسل القابل للحياة لكل لوحة يوم 4. لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 4.
    اليوم 7
  18. انقل الديدان الخيطية من أطباق اليوم 6 إلى أطباق اليوم 7.
  19. احتضان أطباق اليوم 6 واليوم 7 عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  20. عد النسل القابل للحياة لكل لوحة يوم 5. لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 5.
    يوم 8
  21. عد النسل القابل للحياة لكل لوحة يوم 6. لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 6.
    اليوم 9
  22. عد النسل القابل للحياة لكل لوحة يوم 7. لا تحسب أكبر ديدان خيطية (الوالد). لاحظ أي مكررات ماتت أو لم تعد موجودة على اللوحة (خاضعة للرقابة). بمجرد تسجيل عدد النسل ، تخلص من لوحات اليوم 7.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار لتقييم البقاء على قيد الحياة. سجل متى ماتت كل ديدان خيطية. في نهاية التجربة ، يمكن مقارنة النسبة المئوية للديدان الخيطية التي نجت خلال التجربة التي استمرت سبعة أيام لكل علاج. تزحف الديدان الخيطية أحيانا بعيدا عن مصدر الغذاء / العامل الممرض وتحاول تسلق شرائح صفيحة بتري. تحقق من جميع مناطق اللوحة قبل المضي قدما. تترك الديدان الخيطية الميتة وراءها جثة بشكل عام. فرض رقابة على أي ديدان خيطية لا يمكن تحديد موقعها ولا تحسب تلك الديدان الخيطية ميتة. لا تدرج البيانات الخاضعة للرقابة في التحليل النهائي للنسل والبقاء على قيد الحياة.
  23. قم بتحليل البيانات الخاصة بحجم الحضنة والتكاثر المتأخر باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه أو Kruskal-Wallis ، اعتمادا على طبيعتها لمجموعات البيانات ، بالإضافة إلى الاختبارات المتعددة اللاحقة ل Tukey / Dunn لتحديد الاختلافات الهامة بين مجموعات العلاج باستخدام برنامج GraphPad Prism. اكتشف الاختلافات بين منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار رتبة سجل ويلكوكسون.

3. مقايسة توسيع النسب

ملاحظة: البيانات التمثيلية الموضحة في الجدول التكميلي 2 ورسم تخطيطي موضح في الشكل 2 أ.

  1. الحصول على أو إعداد ما يلي: ألواح بتري مقاس 100 مم × 15 مم تحتوي على أجار NGM مكملة بكبريتات الستربتومايسين 0.2 جم / لتر ، مزارع الإشريكية القولونية OP50 ، مزارع LB ، C. albicans ، YPD ، عازلة M9 ، انتقاء الأسلاك ، أنابيب مخروطية 15 مل.
    اليوم -2
  2. تلقيح C. albicans سلالات في 2 مل من YPD و E. coli (OP50) في 50 مل من LB وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
    اليوم -1
  3. بذرة 100 مم × 15 مم من ألواح أجار NGM مكملة بالستربتومايسين مع 300 ميكرولتر من الماستر ميكس لكل طبق (الجدول 3). انشر الماستر ميكس على الطبق باستخدام مفرشة معدنية معقمة. احتضن الألواح طوال الليل عند 30 درجة مئوية. يوصى بستة تكرارات لكل علاج. وبالتالي ، قم بإعداد سبع أطباق (لوحة واحدة للديدان الخيطية المتزامنة ، وستة أطباق لكل ديدان خيطية بالغة) لكل علاج.
حالة التحكم في الإشريكية القولونية (OP50)C. albicans & E. coli (OP50). حالة العلاج
ل 1 النسخ المتماثل50 ر.بH2Oمجموع50 ر.بج. ألبكنسH2Oمجموع
1.25 ميكرولتر8.75 ul10 ميكرولتر37.5 ميكرولتر7.5 ul255 ميكرولتر300 أولتر

الجدول 3: أحجام Mastermix من بكتريا قولونية و C. albicans المزارع اللازمة لإصابة الديدان الخيطية لمقايسة توسع النسب.

النمو السكاني للديدان الخيطية: اليوم 0

  1. مزامنة الديدان الخيطية والصفيحة 10-25 بيضة على طبق واحد لكل عنصر تحكم (OP50 فقط) ومعالجة (C. albicans + OP50) واحتضانها عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    اليوم 2:
  2. انقل دودة L4 واحدة من كل لوحة تحكم وعلاج في اليوم 0 إلى ألواح مصنفة من نفس العلاج. يمكن التعرف على مضيفات L4 من خلال جيب صغير في منتصف الجانب الظهري من أجسامهم22.
  3. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام (ما مجموعه أسبوع واحد بعد المزامنة).
    اليوم 7:
  4. باستخدام ماصة p1000 ، اغسل مجموعة الديدان الخيطية بالكامل من كل لوحة باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت M9 وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للديدان الخيطية بالاستقرار لتسهيل العد.
  6. قم بتخفيف كل حجم مخروطي إلى نهائي يبلغ 10 مل باستخدام المخزن المؤقت M9.
  7. لكل تكرار بيولوجي ، احسب عدد الديدان الخيطية في حصة 20 ميكرولتر. كرر هذا للحصول على 6 تكرارات تقنية لكل تكرار بيولوجي. الحساب الخلفي لتحديد الحجم الإجمالي للسكان. إذا كانت العينات مخففة جدا (أي أقل من 10 ديدان خيطية لكل عينة) ، فقم بتركيز السكان في حجم أصغر من المخزن المؤقت M9.
    ملاحظة: الطرد المركزي للديدان الخيطية الحية لن يضر بالديدان الخيطية.
    مثال على الحساب:
    70 مضيفا = X (إجمالي المضيفين)
    20 ميكرولتر (aliquot) 10,000 ميكرولتر (الحجم الإجمالي)
  8. قم بتحليل البيانات لتوسيع النسب باستخدام إما ANOVA أحادي الاتجاه أو Kruskal-Wallis ، اعتمادا على طبيعتها لمجموعات البيانات ، بالإضافة إلى الاختبارات المتعددة اللاحقة ل Tukey / Dunn لتحديد الاختلافات الدلالية بين مجموعات العلاج باستخدام برنامج GraphPad Prism.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا فحصين يقيسان C. albicans ضراوة كنمط ظاهري غير قاتل باستخدام C. ايليجانس كنموذج للعدوى. يراقب الاختبار الأول ، الخصوبة ، كيف تؤثر عدوى المطثية البيضاء على المضيفين الفرديين لإنتاج النسل والبقاء على قيد الحياة. يقيس الاختبار الثاني ، توسيع النسب ، كيف تؤثر عدوى المطثية البيضاء على النمو السكاني على مدى أجيال متعددة.

يحتوي اختبار الخصوبة على مقاييس متعددة للياقة البدنية للمضيف أثناء عدوى المطثية البيضاء الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم مقياسين بسيطين يقيسان الفوعة الفطرية. كلا المقياسين يستفيدان من C. ايليجانس كنظام مضيف يتضمن مراقبة كل من الأنماط الظاهرية للمضيف المميتة وغير المميتة. على سبيل المثال ، تبحث فحوصات الخصوبة في النجاح الإنجابي للمضيفين المصابين مع قياس البقاء على قيد الحياة الفردية أيضا. لا توفر المراقبة اليومية الحجم الكلي للحضنة فحسب ، بل توفر أيضا توقيت الإنجاب ووقت الوفاة. تم تطوير مقايسة توسيع النسب كنسخة مبسطة من مقايسة الخصوبة التي تكون أقل تعقيدا لأنها تتطلب عددا أقل من عمليات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر دوريان فيستل وريما المستقبلا وماكينا بينلي على مساعدتهم في تطوير فحوصاتنا وجمع البيانات. هذا البحث مدعوم من NSF DEB-1943415 (MAH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب دقيقة من إيبندورف 3810Xميليبور سيجماZ606340
100 مم × 15 مم ألواح بتريسيجما ألدريتشP5856-500EA
15 مل فالكون المخروطياتفيشر ساینتفيك14-959-70C
50 مل فالكون المخروطياتفيشر Scientific14-432-22
الأدينينميليبور سيجماA8626
أجار (حبيبات ، درجة بكتريولوجية)تنتج Apex BioResearch20-248
أسلاك ألومنيوم (95٪ نقطة ، 32 مقياس)جينيسي Scientific59-1M32P
كلوريد الأمونيومMillipore Sigma254134
موزع الخلايا البكتيريةSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
أنابيب الثقافة التي تستخدم لمرة واحدة (20 × 150 مم)مجهر تشريح FIsherBrand14-961-33
(مصباح إضاءة عالي الكثافة NI-150)شركةنيكون إنسترومنت إنك.
الإشريكية القولونيةCaenorhabditis GeneticsCenter OP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
أطباق بتري متوسطة الحجم (35 × 10 مم)Falcon353001
ملعقة معدنيةSP Scienceware8TL24
نمو الديدان الخيطية (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
بوتاسيوم فوسفات أحادي القاعدةسيجماP0662-500G
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-1
فوسفات الصوديومفيشر ScientificBP332-500
ستربتومايسين كبريتاتثيرمو فيشر العلمي11860038
التريبتونميليبور سيجما91079-40-2
يوريدينميليبور سيجماU3750
Wildtype C. elegans< / em>الوراثة CaenorhabditisN2
مستخلص الخميرةMillipore Sigma8013-01-2
مركز وسائط مركز علم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Candida Albicans
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة