يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المكثفات البروتينية الناجمة عن الديميرات الكيميائية على التيلوميرات

2.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62173

⸱

أبريل 12, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول نظام تعتيم البروتين المستحث كيميائيا لإنشاء المكثفات على الكروماتين.  يتم إظهار تشكيل الجسم النووي لسرطان الدم البروميلوسيتيكي (PML) على التيلوميرات ذات الخافضات الكيميائية. يتم رصد نمو القطيرات وانحلالها وتوطينها وتكوينها من خلال تصوير الخلايا الحية والفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH).

الملخص

والمكثفات المرتبطة بالكروماتين متورطة في العديد من العمليات النووية، ولكن الآليات الأساسية لا تزال بعيدة المنال. يصف هذا البروتوكول نظام تضفير البروتين الناجم عن المواد الكيميائية لإنشاء المكثفات على التيلوميرات. ويتكون المخمل الكيميائي من اثنين من الليغندات المرتبطة التي يمكن أن يرتبط كل منها بالبروتين: هالو ليغند إلى هالو إنزيم وتريمثوبريم (TMP) إلى إعادة الاختزال الإشريكية القولونية (eDHFR)، على التوالي. الانصهار من إنزيم هالو إلى بروتين التيلومير المراسي ديميرز إلى التيلوميرات من خلال التعادل هالو ليغاند إنزيم ملزمة. ربط TMP إلى eDHFR المجندين eDHFR تنصهر المرحلة فصل البروتينات إلى التيلوميرات ويحفز تشكيل المكثفات. لأن TMP-eDHFR التفاعل غير التكافؤ، يمكن عكس التكثيف باستخدام TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. ويظهر مثال على تحفيز سرطان الدم النووي (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات وتحديد نمو المكثفات، وانحلال، والتوطين وتكوينها. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للحث على المكثفات في مواقع الجينوم الأخرى عن طريق دمج هالو إلى بروتين يرتبط مباشرة بالكروماتين المحلي أو dCas9 الذي يستهدف الموضع الجينومي مع الحمض النووي الريبي الإرشادي. من خلال تقديم الدقة الزمنية المطلوبة للتصوير الحي للخلية الواحدة مع الحفاظ على فصل المرحلة في مجموعة من الخلايا لإجراء المقايسات الكيميائية الحيوية ، فإن هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في كل من تكوين ووظيفة المكثفات المرتبطة بالكروماتين.

المقدمة

تخضع العديد من البروتينات والأحماض النووية لفصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) والتجمع الذاتي في المكثفات الجزيئية الحيوية لتنظيم الكيمياء الحيوية في الخلايا1،2. LLPS من البروتينات الكروماتين ملزمة يؤدي إلى تشكيل المكثفات التي ترتبط مع loci الجينوم محددة وتورطت في مختلف وظائف الكروماتين المحلية3. على سبيل المثال، LLPS من بروتين HP1 يكمن وراء تشكيل مجالات heterochromatin لتنظيم الجينوم4،5، LLPS من عوامل النسخ تشكل مراكز النسخ لتنظيم النسخ6، LLPS من mRNAs الوليدة والبروتين أمشاط متعددة الجنس يولد أجسام مكان الهستون لتنظيم نسخ ومعالجة الهستون mRNAs7.  ومع ذلك ، على الرغم من اكتشاف العديد من الأمثلة على المكثفات المرتبطة بالكروماتين ، فإن الآليات الأساسية لتشكيل المكثفات وتنظيمها ووظيفتها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. على وجه الخصوص، ليست كل المكثفات المرتبطة الكروماتين تتشكل من خلال LLPS والتقييمات الدقيقة لتشكيل المكثفات في الخلايا الحية لا تزال هناك حاجة8،9. على سبيل المثال، يظهر بروتين HP1 في الماوس أن لديها سوى قدرة ضعيفة على تشكيل قطرات السائل في الخلايا الحية وم بؤر heterochromatin تتصرف كما الكريات البوليمرالمنهارة 10. لذلك ، فإن الأدوات اللازمة لحث المكثفات دي نوفو على الكروماتين في الخلايا الحية مرغوبة ، خاصة تلك التي تسمح باستخدام التصوير الحي والمقايسات الكيميائية الحيوية لمراقبة حركية تكوين المكثفات ، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للمكثفات الناتجة ، والعواقب الخلوية لتشكيل المكثفات.

هذا البروتوكول تقارير نظام التعتيم الكيميائية للحث على المكثفات البروتين على الكروماتين11 (الشكل 1A). ويتكون المخمل من اثنين من الليجاندات المرتبطة التفاعل البروتين: تريميثوبريم (TMP) وهالو ليغند ويمكن أن يقلل من البروتينات تنصهر في مستقبلات cognate: Escherichia القولونية ديهيدروفوليت اختزال (eDHFR) وانزيم البكتيرية الألكيلديهالوجيناز (هالو انزيم), على التوالي12. التفاعل بين هالو ليغاند وإنزيم هالو هو التكافؤ، مما يسمح أنزيم هالو لاستخدامها كمرساة عن طريق دمجه إلى بروتين الربط الكروماتين لتجنيد بروتين فصل المرحلة تنصهر إلى eDHFR إلى الكروماتين. بعد التوظيف الأولي، زيادة التركيز المحلي للمرحلة فصل البروتين يمر تركيز الحرجة اللازمة لفصل المرحلة، وبالتالي نواة المكثفات في مرساة(الشكل 1B). عن طريق دمج البروتينات الفلورية (مثل mCherry و eGFP) إلى eDHFR و Halo ، يمكن تصور نواة ونمو المكثفات في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلوري. لأن التفاعل بين eDHFR و TMP غير تساهمي، يمكن إضافة TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. هذا وسوف الافراج عن بروتين فصل المرحلة من مرساة وحل المكثفات المرتبطة الكروماتين.

استخدمنا هذه الأداة للحث على دي نوفو promyelocytic سرطان الدم (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات في الخلايا السرطانية التيلوميراز السلبية التي تستخدم إطالة بديلة من التيلوميرات (ALT) مسار لصيانة التيلومير13,14.  الهيئات النووية PML هي مقصورات غشاء أقل المشاركة في العديد من العمليات النووية15،16 ومترجمة بشكل فريد إلى التيلوميرات ALT لتشكيل APBs ، لأجسام PML المرتبطة التيلومير ALT17،18. التيلوميرات الكتلة داخل APBs، ويفترض أن توفر قوالب إصلاح لتوليف الحمض النووي التيلومير الموجهة homology في ALT19. في الواقع، تم الكشف عن تخليق الحمض النووي التيلومير في APBs وAPBs تلعب أدوارا أساسية في إثراء عوامل إصلاح الحمض النووي على التيلوميرات20،21. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء تجميع APB وتتجمع التيلومير داخل APBs غير معروفة. منذ يتم تعديل بروتينات التيلومير في خلايا ALT بشكل فريد من قبل معدل صغير يشبه في كل مكان (SUMOs)22، تحتوي العديد من مكونات APB على مواقع السومويل 22و23و24و25 و / أو الزخارف التفاعل السومو (SIMs)26،27 والتفاعلات سومو سيم محرك مرحلة الفصل28، افترضنا أن السومويل على التيلوميرات يؤدي إلى إثراء سومو / سيم التي تحتوي على البروتينات و وتؤدي تفاعلات السومو-سيم بين تلك البروتينات إلى فصل المرحلة.  يمكن تجنيد بروتين PML ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع للسومويليشن وموقع SIM واحد ، إلى التيلوميرات السومويلات لتشكيل APBs ويؤدي تجمع APBs السائل إلى تجمع التيلوميرات. لاختبار هذه الفرضية، استخدمنا نظام التعتيم الكيميائي لمحاكاة تشكيل APB الناجم عن السومويل عن طريق تجنيد SIM إلى التيلوميرات (الشكل 2A)11. يتم دمج GFP إلى Haloenzyme للتصور وبروتين TRF1 الملزم للتيلومير لترسيخ جهاز التعتيم على التيلوميرات. يتم دمج SIM إلى eDHFR و mCherry. ويتبع الحركية من تشكيل المكثفات والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير بالخلايا الحية.  يتم عكس فصل المرحلة بإضافة TMP مجانية زائدة للتنافس مع ربط eDHFR. تستخدم الفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH) لتحديد تكوين المكثفات وارتباط التلوميريك. تجنيد SIM يثري سومو على التيلوميرات والمكثفات المستحثة تحتوي على PML وبالتالي فهي APBs. إن تجنيد متحول SIM لا يمكنه التفاعل مع SUMO لا يثري SUMO على التيلوميرات أو يحفز فصل المرحلة ، مما يشير إلى أن القوة الدافعة الأساسية لتكثيف APB هي التفاعل بين SUMO و SIM. الاتفاق مع هذه الملاحظة، بوليسومو-بوليسيم البوليمرات التي تنصهر إلى عامل الربط TRF2 RAP1 يمكن أن تحفز أيضا تشكيل APB29. بالمقارنة مع نظام الانصهار polySUMO-polySIM حيث يحدث فصل المرحلة طالما يتم إنتاج ما يكفي من البروتينات، فإن نهج التعتيم الكيميائي المعروض هنا يحفز فصل المرحلة عند الطلب وبالتالي يوفر دقة زمنية أفضل لرصد حركية فصل المرحلة وعملية تجميع التيلومير. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح نظام التضويض الكيميائي هذا بتوظيف بروتينات أخرى لتقييم قدرتها على الحث على فصل الطور وتتجمع التيلومير. على سبيل المثال ، يمكن للبروتين المضطرب الذي يتم تجنيده في التيلوميرات أيضا تشكيل قطرات وتلوميرات عنقودية دون تحفيز تكوين APB ، مما يشير إلى أن تجمع التيلومير مستقل عن كيمياء APB ويعتمد فقط على الخاصية السائلة APB11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إنتاج خطوط الخلايا العابرة

  1. ثقافة U2OS الخلايا المقبولة على 22 × 22 مم الزجاج coverslips (للتصوير الحي) أو 12 مم قطرها الأغطية الدائرية (لIF أو FISH) المغلفة بولي مد ليسين في لوحة 6-جيدا مع متوسط النمو (10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ محلول البنسلين-ستريبتومايسين في DMEM) حتى تصل إلى 60-70٪ التقاء.
  2. استبدال متوسط النمو مع متوسطة 1 مل transfection (متوسط النمو دون محلول البنسلين-ستريبتومايسين) قبل transfection.
  3. لكل بئر من أجهزة العدوى، أضف 4 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى 150 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة، ودوامة لمدة 10 ثوان ثم احتضان لمدة 5 دقائق.
  4. لكل بئر، إضافة هالو بناء البلازميد (هالو-GFP-TRF1 أو هالو-TRF1) وeDHFR بناء البلازميد (mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDHFR-SIM متحولة) بنسبة كتلة 1:1 (0.5 ميكروغرام هالو بناء البلازميد مع 0.5 ميكروغرام eDHFR بناء البلازميد) إلى 150 ميكرولتر وسائل الإعلام انخفاض المصل، دروبوايز، مزيج عن طريق pipetting.
    ملاحظة: العلامات صغيرة نسبيا (Halo 33 kD، eDHFR 28 kD، mCherry 30 kD، eGFP 27 kD) ولم يلاحظ أي تأثير على فصل المرحلة. ومع ذلك ، باستخدام المسوخ مثل متحولة SIM المستخدمة هنا للتأكد من أن سلوك المرحلة حساس للطفرات وليس ينصح العلامات. SIM من PIASx28,30. تسلسل سيم هو AAAGTCGATGACTTAACACGGACTAGGCGAGAAGAAGAAGAAGCTCTAAACGT. يتم إنشاء سيم متحولة عن طريق تحور الأحماض الأمينية SIM VIDL إلى VADA28، والتسلسل هو AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGAAGAAGAAGAGAGAGACACACTCTAAACGT. لقد أودعنا البلازميدات لدينا ل addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 متحولة mCherry-eDHFR-SIM.
  5. إضافة 150 ميكرولتر من كاشف الترانسفيكتوريون- خفض خليط وسائل الإعلام المصل إلى 150 ميكرولتر وسائل الإعلام انخفاض المصل مع الحمض النووي, دروبيادي, مزيج عن طريق pipetting, احتضان لمدة 5 دقائق.
  6. إضافة 300 ميكرولتر من خليط الكاشف الحمض النووي transfection إلى الخلايا، دروبيادي ثم وضع الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.
  7. انتظر 24-48 ساعة قبل التصوير الحي أو الفلورة المناعية (IF) أو الفلورسينس في التهجين الموقعي (FISH).

2. التضير على التيلوميرات

  1. حل الخافضات في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد في 10 M وتخزينها في أنابيب الطرد الدقيق البلاستيك في −80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: بدلا من استخدام جهاز التعتيم مع TMP مرتبطة مباشرة إلى هالو (TMP-هالو, TH), خافت TMP-NVOC-هالو (TNH) التي لديها رابط حساس للضوء, 6-نيتروفيراتريل أوكسيكوربونيل (NVOC), بين TMP وHalligand يستخدم31. وذلك لأن الأمر يستغرق وقتا أقل ل TNH (~ 5 دقائق) لنشر في الخلية من TH (~ 20 دقيقة). يمكن أيضا الحصول على النتائج الموضحة هنا باستخدام TH. عند استخدام TNH، يجب الحرص على عدم تعريض جهاز التعتيم للضوء لتجنب انشقاق NOVC. التعامل مع TNH في غرفة مظلمة مع مصباح الضوء الأحمر الخافت، وتخزين dimerizer في أنابيب بلاستيكية العنبر والتفاف الحاوية التي تحتوي على TNH أو الخلايا المعالجة مع رقائق الألومنيوم. التصوير TNH مع DIC آمنة.
  2. خذ a aliquot من 10 mM dimerizer من −80 درجة مئوية وتمييع في التصوير المتوسط إلى تركيز المخزون من 10 ميكرومتر وتخزينها في −20 درجة مئوية.
  3. عندما تكون جاهزة للاستخدام، تمييع الخافقات من محلول مخزون 10 ميكرومتر إلى تركيز عمل نهائي قدره 100 مليون متر في متوسط النمو (للتصوير الثابت) أو متوسط التصوير. علاج الخلايا مع 100 nM dimerizers (التركيز النهائي) على خشبة المسرح للتصوير الحي أو حضانة لمدة 4-5 ساعات لfluorescence المناعي (IF) والفلورسينس في التهجين الموقعي (FISH).
    ملاحظة: تركيز أجهزة التعتيم المستخدمة يؤثر على كفاءة التعتيم وبالتالي فصل المرحلة. يعتمد تركيز الخافض الذي يسمح بأقصى قدر من كفاءة التعتيم على نوع الخلية وتركيز البروتين المرساة ، لذلك ستحتاج إلى تحديدها لإجراء تجارب مختلفة. طريقة واحدة بسيطة هي احتضان الخلايا التي تعبر عن البروتين مرساة و mCherry-eDHFR (دون دمج إلى المرحلة التي تفصل بين البروتين أو تنصهر إلى غير مرحلة فصل متحولة) وتحديد تركيز الدمامل التي يتم تحقيق أعلى كثافة mCherry في مرساة. نهج أكثر منهجية هو احتضان الخلايا التي تعبر عن مرساة فقط مع تركيزات مختلفة من الخافضات ومن ثم مع صبغة هالو ملزمة للمساعدة في تحديد تركيز ديمريزر التي هالو ملزمة صبغ كثافة يبدأ إلى الهضبة (أي، يتم احتلال جميع المراسي هالو تنصهر من قبل ديمريزر وليس أكثر اليسار لصبغة هالو ملزمة)32.
  4. لعكس التعتيم، احتضان الخلايا مع ديميريزر لمدة 2-5 ساعات (مع أو بدون التصوير الحي) أو حتى يتم تحقيق حجم القطيرات المطلوب وإضافة 100 ميكرومتر TMP الحرة (التركيز النهائي) المخفف في التصوير المتوسطة إلى الخلايا.

3. الفلورة المناعية (IF)

  1. البذور 105 خلايا على 12 مم قطرها نظارات الغطاء الدائري المغلفة بولي-D-lysine في لوحة 6-جيدا. ثم نقل اثنين من البلازميدات (هالو-GFP-TRF1 مع mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDHFR-SIM متحولة) وانتظر لمدة 24-48 ساعة قبل الشروع في immunofluorescence.
    ملاحظة: انتظر أكثر من يوم واحد بعد أن يمكن الحصول على تعبير أعلى.
  2. تمييع الخافضات مع متوسط النمو للوصول إلى تركيز نهائي من 100 مليون متر، إضافة ديميريزر المخفف إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعات.
    ملاحظة: يتم بسرعة فصل المرحلة بعد إضافة أجهزة التعتيم (< 30 دقيقة). الحضانة الأطول تساعد قطرات الخشنة إلى أحجام أكبر. بعد نمو القطيرات مع التصوير الحي يمكن استخدامها لتحديد الوقت الذي يستغرقه قطرات للوصول إلى الحالة المطلوبة.
  3. إصلاح الخلايا في حل برنامج تلفزيوني تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد و 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيرمابيليز الخلايا. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يمكن إيقافها مؤقتا ويمكن تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
    تحذير: الفورمالديهايد ضار عن طريق الاستنشاق وإذا ابتلع، فإنه يثير غضب العينين والجهاز التنفسي والجلد، وهو خطر محتمل للإصابة بالسرطان. تحتاج إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية، واستخدامها فقط في غطاء الدخان الكيميائي. أيضا وضعه في حاوية النفايات بعد الاستخدام, لا التخلص منه في الحوض.
  4. يغسل الأغطية مرتين مع 50 ميكرولتر TBS-Tx ومرة واحدة مع 50 ميكرولتر الأجسام المضادة تخفيف العازلة (AbDil). TBS-Tx تم إجراؤها بواسطة TBS، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.05٪ Na-azide. أدلى AbDil من قبل TBS-TX، 2٪ BSA و 0.05٪ نا أزيد.
  5. احتضان كل غطاء مع 50 ميكرولتر الأولية المضادة PML (1:50 التخفيف في AbDil) / المضادة SUMO1 (1:200 التخفيف في AbDil) / المضادة SUMO2/3 الأجسام المضادة (1:200 تخفيف في AbDil) في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة بين عشية وضحاها. يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة mCherry (1:200 تخفيف في AbDil) للمساعدة في الكشف عن إشارة mCherry لأسماك.
    ملاحظة: تقوم FISH بإرواء إشارة الفلورسنت mCherry، مما يجعل من الصعب التمييز بين الخلايا المصابة ب mCherry plasmids وتلك غير المصابة في تجارب FISH. ينصح باستخدام الأجسام المضادة mCherry. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يجعل خط الخلية مستقرة تعبر عن eDHFR تحتوي على البروتين.
  6. يغسل الأغطية 3 مرات مع AbDil لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة.
  7. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية [المضادة للفأرة IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية المقترنة مع اليكسا فلور 647 لPML وS SUMO، المضادة للأرنب IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية المقترنة مع اليكسا فلور 555 ل mCherry، وكلاهما في 1:1000 تخفيف في أبل] لمدة 1 ساعة في مربع مظلم في درجة حرارة الغرفة.
  8. يغسل الأغطية 3 مرات مع TBS-TX.
  9. الشرائح التسمية، تمييع DAPI في تصاعد وسائل الإعلام للوصول إلى تركيز DAPI النهائي من 1 ميكروغرام / مل. ثم وضع 2 ميكرولتر المخفف DAPI على الشريحة. الوجه coverslips أكثر ووضعها على قطرة DAPI ، تطمح السوائل الإضافية من حافة coverslip.
  10. ختم مع طلاء الأظافر، والسماح لها الجافة وشطف من أعلى غطاء بالماء. حفظ في الثلاجة للتصوير.

4. الفلورسينس في التهجين الموقعي (FISH)

  1. البذور 105 خلايا على 12 مم قطرها نظارات الغطاء الدائري المغلفة بولي-D-lysine في لوحة 6-جيدا. خلايا ترانسفيكت مع هالو-TRF1 و mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDHFR-SIM plasmids متحولة وانتظر لمدة 24-48 ساعة قبل الشروع في FISH. خطوة التضويع هي نفسها كما هو موضح في 3.2.
    ملاحظة: هنا TRF1 غير تنصهر مع GFP بحيث يتم تحرير القناة الخضراء حتى للتحقيق الحمض النووي التيلومير.
  2. إصلاح الخلايا مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل 4 مرات مع برنامج تلفزيوني. لIF-FISH، انتقل إلى بروتوكول IF من هنا وبعد غسل الأجسام المضادة الثانوية في IF (3.8)، إعادة الخلايا مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  3. أغطية الجفاف في سلسلة الإيثانول (70٪، 80٪، 90٪، 2 دقيقة لكل منهما).
  4. احتضان الأغطية مع 488-telC التحقيق PNA (1:2000 نسبة) في حل التهجين 5 ميكرولتر في 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. حل التهجين يحتوي على 70٪ من الفورماميد deionized، 10 mM تريس (pH 7.4)، 0.5٪ حجب الكاشف. ثم تحتضن بين عشية وضحاها في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل الأغطية مع عازلة غسل (70٪ فورماميد، 10 mM تريس) 2 دقيقة لمدة 3 مرات في درجة حرارة الغرفة وجبل مع 1 ميكروغرام / مل DAPI في وسائل الإعلام المتصاعدة للتصوير.
    ملاحظة: بروتوكول FISH هو بروتوكول منشور33'34.

5. التصوير الحي

  1. عندما تكون الخلايا جاهزة للتصوير، يتم الحفاظ على غطاء الحامل في غرف مغناطيسية مع الحفاظ على الخلايا في وسط تصوير 1 مل دون أحمر الفينول على مرحلة ساخنة في غرفة بيئية.
  2. إعداد المجهر وجهاز التحكم البيئي. تم الحصول على الصور مع المجهر confocal القرص الغزل مع هدف 100x 1.4 NA، وZ-Drive بيزو، وجهاز إلكترون ضرب تهمة مقرونة (EMCCD) الكاميرا، ووحدة دمج الليزر مجهزة 455، 488، 561، 594 و 647 نانومتر الليزر التي تسيطر عليها برامج التصوير. القوى الناتجة لجميع أشعة الليزر هي 20 كيلوواط تقاس في نهاية الألياف.
  3. تحديد موقع الخلايا مع إشارة GFP مشرق على التيلوميرات وإشارة mCherry المترجمة نشرها في nucleoplasm. العثور على حوالي 20 خلية، حفظ كل موقف مع معلومات س، ص، ض وإعداد المعلمات للتصوير الفاصل الزمني مع تباعد 0.5 ميكرومتر لما مجموعه 8 ميكرومتر في Z و الفاصل الزمني لمدة 5 دقائق لمدة 2-4 ساعات لكل من GFP وmCherry القنوات. استخدام 30٪ من 594 نانومتر و 50٪ من كثافة الطاقة 488 نانومتر، مع أوقات التعرض من 200 مللي ثانية والكاميرا كسب 300.
    ملاحظة: طاقة إخراج وحدات الليزر 20 كيلوواط. تشير بؤر GFP الساطعة إلى حجم مرساة أكبر يمكنه أن ينوى المكثفات بسهولة أكبر. ابحث عن خلايا ذات نطاق واسع من إشارة mCherry لأن فصل المرحلة يعتمد على تركيز SIM في الخلية. الخلايا ذات إشارة mCherry خافتة جدا أو ساطعة جدا قد لا تنفصل تدريجيا. لتجنب photobleaching، لا تستخدم الكثير من طاقة الليزر أو وقت التعرض الطويل جدا.
  4. بدء التصوير واتخاذ حلقة لمرة واحدة كما قبل التعتيم. وقف التصوير، إضافة وسائط التصوير 0.5 مل تحتوي على 15 ميكرولتر من 10 ميكرومتر ديميريزر إلى غرفة التصوير على خشبة المسرح بحيث تركيز dimerizer النهائي هو 100 مليون متر. استئناف التصوير.
  5. عندما تكون جاهزة لعكس التعتيم، وقفة التصوير، إضافة وسائط التصوير 0.5 مل تحتوي على 2 ميكرولتر من 100 MM TMP الأسهم إلى غرفة التصوير على خشبة المسرح للحصول على تركيز نهائي 100 μM TMP. استمر في تصوير الخلايا لمدة ساعة إلى ساعتين.

6. التصوير الثابت

  1. نفس المجهر إعداد التصوير الحي، لا حاجة إلى مرحلة التدفئة. استخدام 488 نانومتر لتصوير التيلومير FISH, 561 نانومتر لmCherry IF, و 647 نانومتر لPML أو سومو IF.
    ملاحظة: إذا لم يكن استخدام الأجسام المضادة mCherry، فقط مباشرة صورة mCherry البروتين ولكن إشارة ربما قاتمة بسبب إرواء في FISH.  لا تزال تستخدم 561 نانومتر بدلا من 594 نانومتر ليزر لتصوير mCherry لتجنب إشارة النزيف من خلال Cy5 إلى mCherry.
  2. حدد موقع حوالي 30-50 خلية ذات إشارة حمراء (mCherry أو mCherry IF) لتحديد الخلايا المصابة.
  3. تم التقاط الصور مع تباعد 0.3 ميكرومتر لما مجموعه 8 ميكرومتر في Z لجمع المزيد من الإشارات. استخدام 80٪ من 647 نانومتر، 80٪ من 561 نانومتر، و 70٪ من 488 نانومتر كثافة الطاقة، مع أوقات التعرض من 600 مللي ثانية والكاميرا كسب 300.

7. معالجة الصور الفاصل الزمني

  1. تعريف ثنائي للتيلوميرات
    اختر خلية واحدة مع كل الوقت ومعلومات z-stack، واختر قناة GFP فقط، ثم أنشئ طبقة ثنائية من خلال تحديد العتبة. ضبط القيم الدنيا والعليا من عتبة واستخدام وظائف مثل "سلس" ، "تنظيف" و "ملء الثقوب" لمعرفة مدى عتبة تلتقط الكائنات المطلوبة من خلال جميع النقاط الزمنية.
  2. طرح الخلفية
    اختر كل القنوات، وارسم مستطيل منطقة الاهتمام (ROI) على الخلفية (باستثناء الخلية). تعريف عائد الاستثمار هذا كخلفية ثم طرح كثافة الخلفية.
  3. ربط التيلومير ثنائي لكثافة التيلومير
    اختيار التيلومير ثنائي وربطه إلى قناة GFP لحساب كثافة GFP في الكائنات الثنائية وكثافة التيلومير.
  4. حساب عدد التيلومير وكثافته مع مرور الوقت
    حدد المعلومات التي سيتم تصديرها، مثل الوقت، معرف الكائن، متوسط الكثافة، شدة المجموع، وبيانات التصدير. استخدام الرقم رسم البرمجيات لقراءة الجدول المصدر وتوليد أرقام عدد التيلومير وكثافة التيلومير (تلخيص كثافة على حجم في كل التيلومير ومن ثم متوسط على جميع التيلوميرات في خلية) مع مرور الوقت.

8. معالجة الصور ذات الخلايا الثابتة

  1. تعريف ثنائي ل APBs
    اختر الخلايا المصابة للتحليل من خلال البحث عن إشارة في قناة 561nm. بعد الإجراء في 7.1، حدد عتبة في كل من GFP (التيلومير DNA FISH) وقناة Cy5 (PML أو SUMO IF) لتوليد ثنائي لأجهزة التيلوميرات وPML أو SUMO، على التوالي. دمج GFP وCy5 طبقات ثنائية وإنشاء طبقة جديدة تحتوي على الجسيمات التي لديها كل من GFP و Cy5 إشارة لتمثيل توطين مشترك للجسم PML على التيلوميرات، وبالتالي APBs.
  2. حساب APB / سومو عدد وكثافة
    طرح خلفية الصورة التالية 7.2. ربط APB/ طبقة ثنائية سومو إلى قناة Cy5 التالية 7.3. حساب APB / سومو عدد وكثافة. تصدير ورسم البيانات التالية 7.4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتظهر الصور التمثيلية لتوطين السومو التي حددها التيلومير DNA FISH وبروتين السومو IF في الشكل 2. الخلايا مع تجنيد SIM أثرت SUMO1 و SUMO 2/3 على التيلوميرات مقارنة مع الخلايا مع تجنيد متحولة SIM. وهذا يشير إلى أن إثراء السومو الناجم عن تعتيم SIM على التيلوميرات يعتمد على تفاعلات SUMO-SIM.

يتم عرض فيلم الفاصل الزمني التمثيلي ل TRF1 وSIM بعد التعتيم في الفيديو 1. تظهر اللقطات في أربع نقاط زمنية في الشكل 3A. تم توظيف SIM ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أظهر هذا البروتوكول تشكيل وانحلال المكثفات على التيلوميرات بنظام التعتيم الكيميائي. يتم رصد الحركية من فصل المرحلة والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير الحي. يتم تحديد توطين المكثفات وتكوينها مع الحمض النووي السمك والبروتين IF.

هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو تحديد تركيز البروتين والخافق. يعتمد النجاح في تحفيز فصل المرحلة المحلية في مكان الجينوم على زيادة التركيز المحلي للمرحلة التي تفصل البروتين فوق التركيز الحرج لفصل المرحلة (الشكل 1ب<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (1K22CA23763201 إلى H.Z. و GM118510 إلى D.M.C)ومؤسسة تشارلز كوفمان إلى H.Z. ويود المؤلفون أن يشكروا جيسون تونز على التدقيق في المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تربسين ، 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديومكورنينجMT25053CI
16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، خال من الميثانولThermo Scientific28906تحضير 1٪ في 1x PBS
6 لوحة ثقافة الآبارVWR10861-554
رقائق الألومنيومفيشر Scientific01-213-101
الأجسام المضادة ل mCherryAbcamAb183628
الأجسام المضادة ل PMLسانتا كروزsc966
الأجسام المضادة المضادة ل SUMO1AbcamAb32058
الأجسام المضادةللهيكل الخلويASM23
كاشف حجبRoche11096176001
ألبومين مصل الأبقار (BSA)فيشر BP9706100
BTX أنبوب مايكرو 1.5ML VWR89511-258
غطاء دائريThermo Scientific3350
مجهر متحد البؤر  نيكونMQS31000
DAPIفيشر العلميD1306
ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ؛سيجما ألدريتش472301
DMEM مع L-Glutamine و 4.5g / L من الجلوكوز وبيروفات الصوديومCorningMT10017CV
كاميرا EMCCDiXon Life & nbsp ؛897
الإيثانول
فيشر العلمي ، مؤهل ومعتمد من وزارة الزراعة الأمريكية مناطقGibcoA4766801
فورماميد ، منزوع الأيوناتMilliporeSigma46-101-00ML
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، الجسم المضاد الثانوي المؤتلف ، Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، الجسم المضاد الثانوي المؤتلف ، Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
ملاقط عالية الدقة مدبب فائق الدقة / ملقطفيشر Scientific12-000-122
وحدة دمج الليزر   ؛نيكونNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 كاشف الإرسالInvitrogen11668027
برنامج رسم الشكل ، MATLABThe MathWorks
Microscope Slide BoxFisher Scientific34487
طلاء الأظافرفيشر العلمي50-949-071
برنامج التصوير, NIS-Elements نيكون
أوبتي-ميم سيروم ميزيتل ميدياجيبكو51985091
بارافيلمبيميس13-374-12
PBS 10x ، درجة الحموضة 7.4فيشر ساينتفيك70-011-044
محلول البنسلين الستربتومايسين ، 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive   ؛Physik Instrumente (PI)91985
Pipet TipsVWR10017
شرائح مجهر زاوية مقصوصة عادي وبلوريفيشر ساينتفيك22-037-246
محلول بولي دي ليسينسيجما ألدريتشA-003-E
الصوديوم أزيدفيشر ScientificBP922I-500
قرص الغزليوكوجاواCSU-X1
غطاء مربع زلاتThermo Scientific3305
TBS 10x حلفيشر ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPتم تصنيعه بواسطة مختبرمتوفر عند الطلب
TNHتم تصنيعه بواسطة مختبرمتاح عند الطلب
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10٪ SolutionMilliporeSigma64-846-350MLتحضير 0.5٪ في 1x PBS
U2Os خط الخلايامن مختبر E.V. Makayev (جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة)HTB-96
VECTASHIELD مضاد للتلاشي تصاعد مختبرات ناقلات متوسطةNC9524612
المضادة العلمي زلات مصل الأبقار الجنينية 4355221 Chenoweth Chenoweth

المراجع

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SUMO SIM PML
المكثفات البروتينية الناجمة عن الديميرات الكيميائية على التيلوميرات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.