Method Article

تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض الخلايا باستمرار لمختلف العوامل الضارة بالحمض النووي، مما يؤدي إلى استجابات خلوية مختلفة. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية أمر ضروري في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة بتوظيف وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع. وعلاوة على ذلك، تسمح لنا التقنيات الأساسية الجديدة بدراسة هذه العمليات على مستوى دقة الخلية الواحدة باستخدام الخلايا الثابتة والحية على حد سواء. على الرغم من أن هذه التقنيات قد استخدمت لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة، وهنا نقدم البروتوكولات الأكثر استخداما في مجال إصلاح الحمض النووي، والتأني المناعي الفلوري (IF) وChromatin Immunoprecipitation (ChIP)، والتي في تركيبة مع تلف الحمض النووي الموقع القائم على الإنتونوكليز تجعل من الممكن تصور وقياس الإشغال الجينومي لعوامل إصلاح الحمض النووي بطريقة موجهة ومنظمة، على التوالي. توفر هذه التقنيات أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالجراد الجينومي التالف بالإضافة إلى تعديلاتها اللاحقة للترجمة اللازمة لتنظيمها الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينوم لدينا هو باستمرار تواجه تحديا من قبل مختلف العوامل الضارة الحمض النووي. ويمكن أن تستمد هذه الاعتداءات من مصادر بيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع، وكذلك من مصادر داخلية، مثل المنتجات الثانوية الأيضية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي أو أخطاء النسخ المتماثل1،2. يمكن أن تؤثر هذه الآفات على سلامة أحد أو كل من خيوط الحمض النووي ، وإذا أصبحت الأخطاء المتولدة مستمرة ، فإنها تؤدي في كثير من الأحيان إلى عمليات النقل وعدم استقرار الجينوم ، مما قد يؤدي إلى تكوين الورم3،4. للحفاظ على سلامة الجينوم، تم تطوير أنظمة إصلاح متعددة أثناء التطور. وفقا للخصائص....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الشفط المناعي لبروتينات محددة

  1. إعداد ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
    1. الحفاظ على خلايا U2OS في monolayers في DMEM الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني، 2 mM الجلوتامين، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية.
      ملاحظة: للحصول على تحريض تلف الحمض النووي القائم على الإندونوكليز، استخدم وسيطا معالجا بالفحم أو خاليا من الستيرويد لتجنب تسرب النظام.
    2. تنمو الخلايا في بيئة رطبة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية حتى 80٪ التقاء، وتجديد المتوسطة كل 2-3 أيام.
    3. يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x. فصل الخلايا مع حل تريبسين-EDTA. عندما تنفصل الخلايا، أوقف نشاط التريبسين بإضافة وسيط ثقافي إلى الخلايا، مما ي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تحقيق دراسة عمليات الإصلاح التي يسببها DSB الموجهة من الموقع في الخلايا عن طريق العدوى المستقرة أو العابرة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العدوى المستقرة تضمن وجود مجموعة خلايا متجانسة ، مما يعطي استجابة خلوية موحدة وبالتالي أكثر موثوقية. في حالة العدوى العابرة ، فإن نسبة صغيرة فقط من سكان الخلية تأخذ وتحافظ على البلازميد ، الذي يدخل التنوع في التجربة. إنشاء أنظمة الخلايا القائمة على ER-I-PpoI أو ER-AsiSI المستندة إلى الإندونوكلياز تتطلب 50٪ من مجموعة خلايا التقاء، والتي يتم تحويلها بشكل أكثر فعالية مع البلازميدات ت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتوسع بسرعة بمساعدة طرق كيميائية حيوية ومجههرية مختلفة. الحفاظ على المعلومات الوراثية أمر بالغ الأهمية للخلايا لأن الطفرات التي تحدث في الجينات المشاركة في عمليات الإصلاح هي من بين الأسباب الرئيسية لنشأة الورم وبالتالي توضيح الخطوات الرئيسية لمسارات إصلاح الحمض النووي أمر ضروري.

التقنيات الكيميائية الحيوية (أي، لطخة الغربية، والمناعة، وقياس الطيف الكتلي، الخ) تتطلب عددا كبيرا من الخلايا وعمليات الإصلاح المدروسة تمثل لم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل منحة المكتب الوطني للبحوث والتطوير والابتكار GINOP-2.3.2-15-2016-00020، GINOP-2.3.2-15-2016-00036، GINOP-2.2.1-15-2017-00052، EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009، NKFI-FK 132080، منحة أبحاث يانوس بولياي التابعة للأكاديمية المجرية للعلوم BO/27/20، ÚNKP-20-5-SZTE-265، زمالة إمبو قصيرة الأجل 8513، ومؤسسة تيمبوس.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات (100 مرة) ، استقرسيجما ألدريتشA5955
مضاد جاما H2A. X (phospho S139) الجسم المضادAbcamab26350
الأبقار مصل الكسر V الألبومينBioseraPM-T1725
TrackIt & trade ؛ سماوي / أصفر تحميل عازلةالحرارية فيشر العلمي10482035
DMEM مع 1.0 جم / لتر جلوكوز ، بدون L-GlutamineLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads & trade ؛ M-280 الأغنام المضادة للفأر IgGInvitrogen11202D
Dynabeads & التجارة ؛ M-280 الأغنام المضادة للأرانب IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
الإيثانولالمولار للكيماويات02910-101-340
مصل الأبقار الجنيني (أصل أمريكا الجنوبية) ، معتمد من الاتحاد الأوروبيGibcoECS0180L
الفورمالديهايد 37٪ محلول خال من الأحماضسيجما ألدريتش1.03999
جلوتا ماكس & تريد; مكملحراري فيشر 35050038
جلايسينسيجما ألدريتش50046
مجموعة IPure v2دياجينودC03010015
كحول إيزواميلسيجما ألدريتشW205702
LiClسيجما ألدريتشL9650
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS5886
Na-DOCسيجما ألدريتشD6750
NaHCO3سيجما ألدريتشS5761
نيوكارزينوستاتين من Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS مسحوق بدون Ca2 + ، Mg2 +Sigma AldrichL182-50-BC
فينولسيجما ألدريتشP4557
أنابيبسيجما ألدريتشP1851
بولي سوربات 20 (توين 20)كيماويات مولية09400-203-190
KClسيجما ألدريتشP5405
طويلة & تجارة ؛ حامل الذهب المضاد للبهتان معThermo Fisher ScientificP36935
IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs الأجسام المضادةAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3< / sub>COONaسيجما ألدريتشS2889
SDSسيجما ألدريتشL3771
تريس أسيتات-EDTA عازلةسيجما ألدريتشT6025
تريس-هيدروكلوريكسيجما ألدريتش91228
تريتون X-100مولار كيماويات09370-006-340
التربسين من البنكرياس الخنازيرسيجما ألدريتشT4799
التربسين EDTA (0.5٪) ، بدون فينول أحمرجيبكو15400054
العلمي مجموعة كوكتيل مثبطات البروتياز DAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles