يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5'capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.
المقدمة
الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5'mRNA توج و3'mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية1 ضروري للربط.
إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الخلايا الطلاء
ملاحظة: في هذا البروتوكول الموصوف، HEK293 خطوط الخلايا مستقرة، ولدت سابقا للتعبير غير قابل للانستقراء من Nek4 استخدمت21،ومع ذلك، فإن البروتوكول نفسه هو مناسبة لكثير من خطوط الخلايا الأخرى، مثل HEK29322،HeLa23،24،25،26،U-2 OS27،COS728،SH-SY5Y29. نمط التعبير عن النظائر E1A minigene تحت ظروف القاعدية يختلف بين هذه الخلايا، وينبغي أن تتميز لكل شرط. لا يقتصر هذا البروتوكول على خطوط الخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء فحص مواقع الربط 5 'باستخدام E1A minigene لتقييم التغيرات في ملف تعريف الربط في الخلايا بعد معرض العلاج الكيميائي. تم تقييم دور Nek4 - isoform 1 في تنظيم AS في خلايا HEK293 المستقرة بعد علاج باكليتاكسيل أو سيسبلاتين.
11- تعتبر منطقة أدينوفيرالي E1A مسؤولة عن إنتاج ثلاثة من الرناس الرئيسي من سلفة واحدة من السلائف الرناية بسبب استخدام مختلف الجهات المانحة للربط. أنها تشترك المشتركة 5 'و 3' termini ولكن تختلف في حجم introns.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريقزيادة كميةهذه في الخلية 13,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط خلية مستقر يعبر عن Nek4 isoform 1 ، وتجنب القطع الأثرية من التعبير المفرط الناجم عن العدوى العابرة. لم يظهر isoform 1 من Nek4 تأثيرا في الربط البديل E1A minigene في الحالات القاعدية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100 pb DNA سلم | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 آبار لوحة | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC المياه | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| مصل الأبقار الجنينية - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| المجهر الفلوري | Leica | DMIL LED Fluo | |
| - نظام ChemiDoc Gel Imagin | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 خلايا مستقرة - HEK293 Flp-In | تم إنشاؤه من Flp-In & Trade ؛ T-REx™ 293 - Invitrogen وموصوف في المرجع 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | يستخدم لصيانة خلايا Flp-In |
| برامج معالجة وتحليل الصور - مرجع برنامج | 32 | ||
| كاشف التعداء القائم على الدهون - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| قارئ لوحة / امتصاص الأشعة فوق البنفسجية | Biotech Epoch Biotek / محول Take3 | ||
| 5 ' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |||
| pMTE1A R | Invitrogen | 5 '-GGATAGCAGGCGCCATTTTTTA-3' | |
| جهاز طرد مركزي مبرد | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse Transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease مثبط RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| كاشف قائم على الفينول والكلوروفورم - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | المستخدمة في العلم فارغ أو Nek4- العلم التعبير عن |
| الحث Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
المراجع
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
