يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

2.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62201

⸱

فبراير 2, 2021

 , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا، يتم تقديم بروتوكول لتسمية الأيض من الخميرة مع 14حمض الخليك C، الذي يقترن كروماتوغرافيا طبقة رقيقة لفصل الدهون محايدة.

الملخص

الدهون المحايدة (NLs) هي فئة من الجزيئات الحيوية الكارهة للماء والتهم التي تلعب أدوارا رئيسية في الطاقة وداء الدهون. يتم توليفها NLs دي نوفو من أسيتيل-CoA ومتواجدة في المقام الأول في eukaryotes في شكل الدهون الثلاثية (TGs) وستيرول-استر (SEs). يتم الحفاظ على الإنزيمات المسؤولة عن تركيب NLs للغاية من Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) للبشر ، مما يجعل الخميرة كائنا نموذجيا مفيدا لتشريح وظيفة وتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL. في حين يعرف الكثير عن كيفية تحويل أسيتيل-CoA إلى مجموعة متنوعة من أنواع NL، لا يزال يتم اكتشاف آليات لتنظيم إنزيمات التمثيل الغذائي NL، وكيف يمكن أن يسهم سوء التنظيم في الأمراض الخلوية. وقد تم تطوير العديد من الطرق لعزل وتوصيف أنواع الأنواع NL واستخدامها على مدى عقود من البحث؛ ومع ذلك، لم يناقش بروتوكول كمي وبسيط لتوصيف شامل لأنواع الكائنات الرئيسية في النواة. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة وقابلة للتكيف لتحديد تركيب دي نوفو من الأنواع الرئيسية NL في الخميرة. نحن نطبق 14C-ace حمض الوسم الأيضي إلى جانب طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا لفصل وقياس مجموعة متنوعة من NLs الهامة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة لدراسة في معدلات رد فعل الجسم الحي من الإنزيمات NL أو تدهور الأنواع NL مع مرور الوقت.

المقدمة

أسيتيل-CoA هو لبنة أساسية من الجزيئات الحيوية المتنوعة بما في ذلك الدهون المحايدة (NLs)، والتي هي بمثابة عملة الجزيئية الحيوية تنوعا لبناء الأغشية، وتوليد ATP، وتنظيم الإشارات الخلية1،2. وينظم تخزينها جزئيا توافر ال NLs لتحويلها إلى أي من هذه المسارات المعنية. قطرات الدهون (LDs)، العضيات السيتوبلازمية تتكون من النوى الكارهة للماء من الدهون الثلاثية (TGs) واستر الستيرول (SEs)، هي مقصورات التخزين الرئيسية لمعظم NLs الخلوية. على هذا النحو، LDs عزل وتنظيم NLs، والتي يمكن أن تتحلل وتستخدم في وقت لاحق للعمليات الكيميائية الحيوية والتمثيل الغذائي3،4. ومن المعروف أن سوء تنظيم NL والبروتينات المرتبطة LD يرتبط مع بداية الأمراض بما في ذلك ضمور الدهون ومتلازمات التمثيل الغذائي5،6. وبسبب هذا، تركز أبحاث LD الحالية بشكل مكثف على كيفية تنظيم توليف NL مكانيا وزمانيا وعبر أنسجة متميزة من الكائنات الحية متعددة الخلايا. نظرا للأدوار الخلوية في كل مكان لNLs، يتم الحفاظ على العديد من الإنزيمات المسؤولة عن توليف وتنظيم NLs في جميع أنحاء eukaryotes7. في الواقع ، حتى بعض prokaryotes مخزن NLs في LDs8. لذلك ، كانت الكائنات الحية النموذجية القابلة للسحب وراثيا مثل Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة) مفيدة لدراسة توليف NL وتنظيمها.

يمكن فصل وتكميم NLs من مستخلصات الخلايا بطرق لا تعد ولا تحصى ، بما في ذلك قياس الطيف اللوني الكتلي للغاز (GC-MS) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وقياس الطيف الكتلي السائل فائق الأداء (UPLC-MS)9و10و11. ولعل أبسط طريقة لفصل NLs هو عن طريق طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC)، والذي يسمح للقياس الكمي الكثافة اللاحقة من منحنى قياسي12،13. على الرغم من أن TLC يوفر فقط فصل مسار الحبيبات من NLs، فإنه لا يزال تقنية قوية لأنها غير مكلفة، وأنه يسمح لفصل سريع من NLs من عدة عينات في وقت واحد. اثنين من أكبر التحديات التي تواجه دراسة NLs عبر TLC هي: 1) مجموعة واسعة من وفرة الخلوية من الأنواع NL وسيطة لها، و 2) مجموعة من الميل المائي / hydrophobicity من وسيطة الدهون داخل مسارات توليف NL. وبالتالي، فإن التحديد الكمي لأنواع الأنواع من الكائنات البرية عبر TLC يقتصر عادة على أكثر الأنواع وفرة؛ ومع ذلك، يمكن إدخال 14C-خليك حمض شعري يعزز بشكل كبير الكشف عن وسيطة وفرة منخفضة داخل مسارات NL. يتم تحويل حمض الخليك بسرعة إلى أسيتيل-CoA بواسطة أسيتيل-CoA synthetase ACS214، مما يجعل 14حمض C-الخليك ركيزة مناسبة للتكبيل الإشعاعي في الخميرة15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق فصل كل من NLs الكارهة للماء والوسيطة المائية من NLs من قبل TLC من خلال استخدام أنظمة المذيبات المتعددة16. هنا، يتم تقديم طريقة لفصل NLs باستخدام 14C-ace حمض التمثيل الغذائي وضع العلامات في الخميرة. يتم عزل الدهون المسماة خلال فترة النبض في وقت لاحق من خلال بروتوكول عزل الدهون الكلي الراسخ17، يليه فصل أنواع NL بواسطة TLC. تطوير لوحات TLC من قبل كل من التصوير الشعاعي التلقائي لتصور الدهون المسماة ، ورذاذ كيميائي لتصور مجموع الدهون ، ويسمح لطرق متعددة للقياس الكمي. يمكن أيضا استخراج أشرطة الدهون الفردية بسهولة من لوحة TLC باستخدام شفرة حلاقة ، ويمكن استخدام عد التلألؤ لتحديد كمية المواد التي تحمل علامة إشعاعية داخل النطاق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. نمو ووضع العلامات على خلايا الخميرة مع 14حمض الخليك C

  1. تلقيح ثقافة الخميرة عن طريق اختيار مستعمرة من لوحة والاستغناء عنها في 20 مل من الوسائط الاصطناعية كاملة (SC) التي تحتوي على 2٪ dextrose (انظر الملف التكميلي لوصفة وسائل الإعلام SC). احتضان عند 30 درجة مئوية لليلة واحدة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تختلف حالة النمو وحجم العينة والعلاج استنادا إلى الدهون (الدهون) ذات الاهتمام. قبل إجراء التجارب الكاملة، ينبغي تحديد ظروف النمو المثلى وحجم الثقافة تجريبيا. يناقش هذا البروتوكول التسمية الإشعاعية لثقافات الخميرة التي تزرع إلى مرحلة ثابتة ، وهي مرحلة نمو عندما يتباطأ نمو الغشاء الحيوي والخلايا ، وتوليف NL نشط للغاية.
  2. قياس OD600 من ثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مطياف وتمييع ثقافة خلايا الخميرة إلى ODالنهائي 600 من 0.2 في 50 مل من وسائل الإعلام SC الطازجة التي تحتوي على 2٪ dextrose. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة، أو حتى أنها قد وصلت إلى مرحلة ثابتة (والتي تعرف عادة من قبل بطانة مسطحة من الخلية مضاعفة قياس OD600).
  3. قبل تجميع الخلايا، قم بإجراء المخزن المؤقت للإرواء (راجع ملف تكميلي للحصول على التفاصيل). جعل اثنين من aliquots 20 مل من المخزن المؤقت للإرواء لكل عينة (أي 40 مل إخماد العازلة لكل عينة) وتقسيم بالتساوي إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل). تخزين الاقتباسات العازلة التبريد في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  4. بمجرد أن تصل الثقافات إلى مرحلة OD أو النمو المطلوبة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4100 × غرام لمدة 10 دقائق. بينما توجد العينات في جهاز الطرد المركزي، قم بإعداد وسائط التسبيس الإشعاعي بإضافة ملح الصوديوم بحمض الخليك[1-14C] إلى وسائط SC الخالية من الدكستروز بتركيز نهائي قدره 10 ميكروسي/مل.
    تنبيه: يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) في جميع الأوقات عند العمل مع المواد المشعة. اتبع دائما الإرشادات المحلية لتخزين واستخدام والتخلص من المواد المشعة بشكل صحيح.
    ملاحظة: يجب تعديل تركيز 14حمض C-acetic في وسائط وضع العلامات ووقت حضانة التسمية الإشعاعية وفقا للم المستقلب (المستقلب) المثير للاهتمام. هنا ، يتم استخدام حضانة نبض 20 دقيقة من العلامات الإشعاعية ، وهو ما يكفي لتسمية أنواع NL بمجموعة من الوفرة.
  5. إزالة supernatant من الخلايا بيليه، وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 20 مل من وسائل الإعلام SC خالية من دكستروز عن طريق إعادة تعليق بيليه مع ماصة. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4100 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. إعادة تشغيل الخلايا في 1 مل من وسائط SC خالية من dextrose، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد الدقيق 2 مل المسمى. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4100 × ز لمدة 2 دقيقة.
  7. إعادة تشغيل الخلايا مرة أخرى في 500 ميكرولتر من وسائط SC الخالية من دكستروز. تبريد جهاز طرد مركزي مجهز بأنابيب مخروطية سعة 50 مل إلى -10 درجات مئوية أو على أقل درجة حرارة.
  8. ابدأ فترة التسمية الإشعاعية بإضافة 500 ميكرولتر بسرعة من وسائط التهيؤ الإشعاعي إلى كل 500 ميكرولتر من تعليق الخلية (تركيز حمض C-acetic النهائي 14= 5 μCi/mL). احتضان الأنابيب في حاضنة دوارة عند 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة و 2 دقيقة قبل نهاية فترة وضع العلامات ، ونقل واحد 20 مل من الكوت من عازل التبريد لكل عينة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى دلو من الثلج
  9. بمجرد انتهاء فترة التسمية الإشعاعية ، استخدم ماصة لإغراق عينة 1 مل بأكملها في 20 مل من المخزن المؤقت لإرواء التبريد. دوامة أنابيب مخروطية لمدة 5-10 ق لضمان أن العينة قد تم خلطها تماما مع المخزن المؤقت التبريد. احتضان العينات في إخماد العازلة لمدة 2 دقيقة على الجليد.
  10. جمع بيليه الخلية عن طريق الغزل في جهاز طرد مركزي في 5000 × ز لمدة 3 دقائق تعيين إلى -10 درجة مئوية أو على الإعداد أدنى درجة حرارة. بينما تدور أنابيب العينة ، قم بنقل مجموعة أخرى من المغذيات العازلة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى دلو مليء بالثلج (أي أنبوب واحد سعة 20 مل من المخزن المؤقت لإرواء العينة).
  11. إزالة سعة التخزين المؤقت التبريد من الكريات الخلية واستبداله مع 20 مل الطازجة والباردة، والتخزين المؤقت التبريد. دوامة ويهز العينات حتى تم طرد بيليه من الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي وإعادة الإنفاق بالكامل في إخماد العازلة. طرد العينات مرة أخرى في 5000 x ز لمدة 3 دقائق في -10 درجة مئوية لجمع الخلايا.
  12. مرة واحدة هي بيليه الخلايا، وإزالة تماما كل عازلة التبريد من العينات عن طريق صب قبالة supernatant وإزالة الزائدة مع ماصة. تخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.

2. عزل مجموع الدهون من الخميرة

ملاحظة: يستند البروتوكول التالي لعزل الدهون على طريقة راسخة ومستعملة بشكل متكرر تستخرج بكفاءة معظم أنواع الدهون المحايدة17،18.
تنبيه: عند استخدام المذيبات العضوية، ارتد دائما معدات الوقاية الشخصية المناسبة واعمل داخل غطاء الدخان عندما يكون ذلك ممكنا. أثناء استخراج الدهون، تجنب استخدام البلاستيك التي لا تتوافق مع المذيبات العضوية. أنابيب البولي بروبلين مناسبة للبروتوكول التالي.

  1. وزن 0.3 غرام من الخرز الزجاجي الحمضية غسلها لكل عينة وتخزينها في أنابيب الطرد المركزي 2 مل على الجليد. إزالة الكريات الخلية من الفريزر -80 درجة مئوية والاحتفاظ بها على الجليد. إضافة 350 ميكرولتر الميثانول و 700 ميكرولتر الكلوروفورم إلى كل عينة، وإعادة الإنفاق، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على حبات زجاجية وزنها مسبقا.
  2. خلايا الليس عن طريق تحريك الأنابيب على دوامة 3x لمدة 1 دقيقة، مع حضانات 30 ق على الجليد بين التحريضات. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم lysed الخلايا باستخدام الخافض حبة مصغرة لمدة ثلاث دورات 1 دقيقة. حفظ 25-30 ميكرولتر من lysate الخلية بأكملها في أنبوب منفصل لعد التلألؤ.
    ملاحظة: سيتم استخدام اللوات المحفوظة لتحديد الكمية النسبية من النظائر المشعة التي تناولتها كل عينة خلال فترة النبض، والتي ستؤثر على كمية كل عينة محملة على لوحة TLC. وقد نوقش هذا الأمر في الخطوة 3-2.
  3. صب كامل محتويات أنبوب الطرد المركزي 2 مل في أنبوب الطرد المركزي الزجاج 15 مل [أنبوب A]. اغسل أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل بإضافة 1 مل من الميثانول والدوامات لمدة 10-15 s. نقل 1 مل من الميثانول يغسل إلى أنبوب A وإضافة 2 مل من الكلوروفورم إلى أنبوب A تليها 400 ميكرولتر من الماء لحجم عينة النهائي من 4.45 مل.
  4. عينات دوامة لمدة دقيقة واحدة تليها 5 دقائق الطرد المركزي في 1000 x ز. بعد الطرد المركزي، يجب فصل المراحل المائية (العلوية) والعضوية (السفلية) بوضوح بصريا مع وجود حطام الخلية في الواجهة.
  5. باستخدام ماصة باستور زجاجية، اجمع المرحلة العضوية من الأنبوب A وانتقل إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد سعة 15 مل (الأنبوب B). إضافة 1 مل من 1M KCl إلى أنبوب B. إلى أنبوب A، إضافة 1 مل من الميثانول و 2 مل من الكلوروفورم، و 200 ميكرولتر ميليل مياه ميليكيو. كرر خطوات الدوامة والطرد المركزي على الأنبوب A.
  6. مرة أخرى جمع المرحلة العضوية من أنبوب A وإضافته إلى أنبوب B. التخلص من أنبوب A في حاوية مناسبة. دوامة أنبوب B لمدة 1 دقيقة تليها 5 دقيقة الطرد المركزي في 1000 x ز.
  7. إزالة الطبقة المائية العليا من أنبوب B والتخلص منها. إضافة 1 مل من 1 M KCl الطازجة مرة أخرى إلى أنبوب B وتكرار دوامة / خطوة الطرد المركزي. بمجرد فصل الطبقات، اجمع الطبقة العضوية السفلية بأكملها بعناية في قارورة زجاجية تحمل علامة 4 مل.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن تخزين مستخلصات الدهون عند -80 درجة مئوية، أو يمكن متابعة البروتوكول لفصل TLC من الدهون.

3. فصل وتكميم NLs المسمى بالنظائر المشعة بواسطة اللونيات طبقة رقيقة

  1. إذا وضعت مقتطفات الدهون في -80 درجة مئوية، وجلب ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضان على الجليد وبعد ذلك على مقاعد البدلاء. تتبخر تماما المذيبات من مقتطفات الدهون عن طريق فراغ التجفيف أو باستخدام تيار لطيف من الغاز الخامل (على سبيل المثال، الأرجون أو النيتروجين). وفي الوقت نفسه، قبل تسخين الفرن إلى 145 درجة مئوية لتسخين لوحة TLC.
  2. قبل تحميل العينات على لوحة TLC، حدد الكميات النسبية من البيل المشع التي تناولتها الخلايا. ماصة 10 ميكرولتر من lysate الخلية بأكملها من الخطوة 2.2 إلى قارورة 6 مل زجاج التلألؤ، إضافة 6 مل من السائل التلألؤ ووضع قوارير في رف. استخدم عداد التلألؤ لقياس cpm أو dpm لكل عينة باستخدام خيار العد الحامل الواحد المحدد لوقت عد 1 دقيقة. قياس كل خلية كاملة lysate في مكررة للحصول على متوسط لكل عينة. ضبط مقدار التحميل وفقا لنوع أو عينة مرجعية برية
    ملاحظة: يمكن تحديد مقدار كل عينة لتحميلها على لوحة TLC باستخدام المعادلة التالية: (متوسط عدد العينات)/(متوسط عدد المراجع) x حجم التحميل المطلوب. فعلى سبيل المثال، إذا كان من المقرر تحميل 20 ميكرولتر من العينة المرجعية على لوحة TLC، ويبلغ متوسط عددها 000 1، فإن عينة تجريبية يبلغ متوسط عددها 000 2 ميلليون سيكون لها 10 ميكرولتر محملة على لوحة TLC.
  3. إعادة تشكيل عينة الدهون في 40-50 ميكرولتر من 1:1 (v/v٪) الكلوروفورم: الميثانول عن طريق الدوامة لمدة 5 دقائق. إعداد 101 مل من المذيبات المرحلة المتنقلة في اسطوانة تخرج الزجاج (انظر قسم النتائج التمثيلية للحصول على مثال على فصل الأنواع NL الرئيسية من قبل 50:40:10:1 (v/v/v/v٪) Hexane:البترول الأثير:ديثيل الأثير: مذيب حمض الخليك).
  4. صب المذيبات في غرفة TLC الزجاج تحتوي على 20 × 20 TLC وسادة التشبع وغطاء ضيق المناسب. إعداد توجيه 20 × 20 هلام السيليكا 60 G لوحة عن طريق وضع علامة بلطف خط 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة باستخدام قلم رصاص. يحدد الخط الأصل ومكان تحميل الدهون. أسفل الخط، قم بتسمية العينة التي سيتم تحميلها في كل حارة بلطف. بمجرد إعداد لوحة TLC ، احتضن الطبق في فرن 145 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتسخين الطبق مسبقا وإزالة أي رطوبة زائدة.
  5. بمجرد تسخين اللوحة بما فيه الكفاية ، وتشبع لوحة التشبع TLC بالمذيبات ، قم بإزالة لوحة TLC من الفرن وشرع على الفور في تحميل لوحة TLC. تحميل لوحة في حين أنها دافئة يضمن تبخر المذيبات السريعة. لكل نوع من أنواع الدهون ذات الاهتمام، قم بتحميل 5-20 ميكروغرام من معيار الدهون المنقى على ممر من لوحة TLC لتتبع الانفصال والمسافة المتوقعة للهجرة. باستخدام ماصة، بقعة 5μL من العينة على أصل كل حارة تقع 1.5 سم فوق الجزء السفلي من لوحة TLC. تكرار تحميل 5 بقع ميكرولتر حتى 20-40 ميكرولتر من العينة قد تم تحميلها في كل حارة.
    ملاحظة: يمكن إضافة 5-20 ميكروغرام من الدهون المنقية غير المبطنة إلى كل مسار عينة كمقتفيات يمكن تلطيخها وتصورها بعد فصل TLC من الدهون. وجود معيار ملطخ يسمح لتتبع سهلة واختناق من عصابات الدهون ذات اللاتى لالاشعاعية لعد التلألؤ اللاحقة. سيتم تحديد المعايير المنقى التي يتم تحميلها على لوحة من قبل الأنواع NL من الفائدة. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على أمثلة لفصل حمض الأوليك (FFA)، 1,2 ديوليويل-غليسيرول (DG)، تريولين (TG)، الكوليسترول (تشول)، كوليستيريل لينوليات (SE)، والسكوالين في الممرات المجاورة لممرات العينة.
  6. بمجرد تحميل العينات القياسية والتجريبية ، ضع اللوحة في الغرفة النامية وانتظر حتى يصل المذيب إلى أعلى اللوحة (40-60 دقيقة). بمجرد تطوير اللوحة بالكامل، قم بإزالتها من الغرفة واتركها تجف في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.
  7. بعد تجفيف اللوحة، قم بتغطيتها بفيلم بلاستيكي ووضعها في كاسيت متطور بشاشة تصوير تلقائي. السماح للوح لتطوير مع الشاشة لمدة 24-48 ساعة.

4. التصور وتكميم الدهون TLC فصل

  1. قم بإزالة الشاشة من شريط كاسيت متطور ووضعها داخل صورة الفوسفور. حدد خيار التصوير الفوسفوري وطوره على 800-1000 فولت.
    ملاحظة: يعطي التصوير الفوسفوري رؤية نوعية للدهون التي تحمل علامات إشعاعية على لوحة TLC. ومع ذلك ، فإن التحديد الكمي للدهون التي تم تسميتها إشعاعيا يتم تحقيقه على أفضل وجه من خلال عد التلألؤ ، والذي يتم وصفه لاحقا.
  2. مزيج 100 مل من ع anisaldehyde الكاشف (انظر الملف التكميلي)وإيداع في زجاجة رذاذ. رش لوحة TLC مع ع أنيسالدهيد الكاشف حتى تشبع السيليكا. خبز لوحة في فرن 145 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى ظهرت العصابات.
  3. لقياس الأنواع الدهنية الفردية باستخدام العد التلألؤ باللاحم الإشعاعي، استخدم شفرة حلاقة لكشط هلام السيليكا من لوحة TLC الزجاجية. نقل كل السيليكا هلام الفرقة المقابلة لنوع واحد من الدهون التي وصفت إشعاعا إلى قارورة التلألؤ الزجاج وإضافة 6 مل السائل التلألؤ. دوامة بقوة حتى تم تخفيض الفرقة السيليكا إلى قطع صغيرة.
    1. بدلا من ذلك، يمكن استخراج الدهون من شريط هلام السيليكا باستخدام بروتوكول استخراج الدهون في القسم 3. إذا تم استخراج الدهون من هلام السيليكا، تتبخر المذيب تماما كما هو الحال في الخطوة 3.1، وإضافة 6 مل سائل التلألؤ إلى الدهون المجففة. ضع الحامل الذي يحتوي على قنينات التلألؤ في عداد التلألؤ. حدد خيار العد حامل واحد وضبط وقت العد إلى 2 دقيقة لكل قارورة. ستتم طباعة النتائج من عداد التلألؤ ويمكن تصورها كرسم بياني شريطي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا البروتوكول، أثبتنا أن وضع العلامات والكشف والتحديد الكمي لأنواع NL يمكن تحقيقه من خلال وضع علامات أيضية لحامضC-acetic. يمكن فصل الأنواع الرئيسية NL في نظام المذيبات من 50:40:10:1 (v/v/v/v٪) هيكسان:الأثير البترولي:ديثيل الأثير:حمض الخليك (الشكل 1A, B). التصوير الفوسفوري يسمح لتصور الأحماض الدهنية الحرة المسمى (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), الكوليسترول (تشول), والسكوالين (SQ) (الشكل 1A). على الرغم من أنه يمكن ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، يتم تقديم بروتوكول تسمية إشعاعية متعددة لمراقبة كميا توليف الأنواع NL في الخميرة. هذا البروتوكول هو وحدات جدا، والذي يسمح لهذا الإجراء أن ينتهي في غضون 3-6 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، توجد ثروة من الأدب على استخدام TLC لفصل أنواع الدهون والأيض ، والتي يجب أن تسمح للمستخدم بالكشف عن العديد من أنواع الدهون ذات الاهتمام مع تغيير بسيط في أنظمة المذيبات TLC16،19. هذا البروتوكول يؤدي إلى فصل وكشف وتكميم الدهون التي تم تسميتها إشعاعيا. ويمكن أيضا أن يقترن فترة مطاردة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة في إعداد هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر هين على المساعدة والمشورة المفاهيمية في إنجاز هذه الدراسة. W.M.H. مدعوم بأموال من مؤسسة ويلش (I-1873)، وNIGMS المعاهد القومية للصحة (GM119768)، وصندوق البحوث الطبية آرا Paresghian، وبرنامج العلماء الموهوبين جنوب غرب UT. تم دعم S.R بمنحة برنامج T32 (5T32GM008297).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
[1-C14] نشاط خاص بملح الصوديوم بحمض الخليك: 45-60mCiPerkinElmerNEC084H001MC
18: 1 1،2 dioleoyl-sn-glycerolAvanti800811O
200 دليل على الإيثانول المطلقSigma459836
حبات زجاجية مغسولة بالحمض 425-600umSigmaG8772
لمبات العنبر لماصات PastuerFisher03-448-24
كبريتات الأمونيوم >99٪سيجماA4418
بيكمان LS6500 عداد التلألؤبيركين إلمرA481000
كلوروفورم (درجة HPLC)فيشرC607SK
الكوليسترول >99٪سيجماC8667
كوليستريل لينوليت >98٪سيجماC0289
حامض الكبريتيك المركزسيجما339741
كورنينج 50 مل أنابيب مخروطية ، بولي بروبيلين مع غطاء مركزيسيجماCLS430829
سكر العنب ، درجة لامائيةسيجماD9434
ثنائي إيثيل الأثير الصف اللامائيسيجما296082
فرن التجفيففيشر11-475-155
سائل التلألؤ EcoLumeVWRIC88247001
Eppendorf 5424R جهاز طرد مركزيفيشر05-401-205
GE شاشة فوسفور تخزين GESigmaGE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
حمض الخليك الجليدي ، ACS الصفسيجما695092
زجاج 6 مل قارورة التلألؤSigmaM1901
أغطية أنبوب الطرد المركزي الزجاجيةفيشر14-595-36A
أنابيب الطرد المركزي الزجاجيةفيشر14-595-35A
ماصة زجاجية باستورفيشر13-678-20C
هكسان ، لا مائية الصفسيجما296090
L-Adenine >99٪SigmaA8626
L-Alanine >98٪SigmaA7627
L-Arginine >99٪سيجماA1270000
L-Asparagine >98٪سيجماA0884
L-Aspartate >98٪سيجماA9256
L-Cysteine >97٪سيجماW326305
L-Glutamic ملح أحادي الصوديوم أحادي الهيدرات >98٪سيجما49621
L-Glutamine >99٪سيجماG3126
L-جلايسين >99٪سيجماG8898
L-هيستيدين >99٪سيجماH8000
L-Isoleucine >98٪سيجماI2752
L-ليوسين >98٪سيجماL8000
L-Lysine >98٪سيجماL5501
L-ميثيونين ، HPLC الصفسيجماM9625
L-فينيل ألانين ، كاشف الصفسيجماP2126
L-Proline >99٪سيجماP0380
L-سيرين >99٪سيجماS4500
L-ثيرونين ، كاشف الصفسيجماT8625
L-تريبتوفان >98٪سيجماT0254
L-تيروزين >98٪سيجماT3754
L-Uracil >99٪سيجماU0750
L-Valine >98٪سيجماV0500
ميثانول ، ACS الصففيشرA412
حمض الأوليك >99٪سيجماO1008
p-anisaldehydeSigmaA88107
الأثير البترولي ، ACS الصفسيجما184519
فوسفاتيديل كولين ، ديبالميتويل >99٪سيجماP1652
ماصاتإيبندورف2231000713
كلوريد البوتاسيوم ،سيجماP3911
ACS ، معتمدة من ACSFisherS318-100
Squalene >98٪SigmaS3626
حمض السكسينيك بلوري / معتمدفيشر110-15-6
TLC وسادة تشبعسيجماZ265225
TLC هلام السيليكا 60G لوحة زجاجيةموجهة فيشرNC9825743لا توجد مؤشرات فلورية
فيلم بلاستيكي شفافأبولو829903
تريسينسيجماT0377
تريولين >99٪سيجماT7140
خلاط دوامةفيشر02-215-414
كاسيت التعرض واتمانسيجماWHA29175523
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون كبريتات الأمونيوم والأحماض الأمينيةسيجماY1251
كريات هيدروكسيد الصوديوم من الدرجة

المراجع

  1. Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
  2. Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
  3. Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
  4. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  5. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  6. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
  7. Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
  8. Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
  9. Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
  10. Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).
  11. Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
  12. Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
  13. Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006(2018).
  14. Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).
  15. Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
  16. Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  18. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).
  19. Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.