$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تنزيل البيانات
- تحميل البيانات من الانضمام PRJNA386367 شكل قاعدة بيانات NCBI. من بيانات الانضمام PRJNA386367، حدد بيانات ميكروبيوم رهيزوسفير ورهيزوبلان والاندوسفير من نباتات الأرز التي نمت لمدة 14 أسبوعا في حقل أرباكل المغمور في أربوكل، كاليفورنيا في عام 2014.
ملاحظة: تم عرض بيانات الميكروبيوم الخاصة ب rhizosphere و rhizoplane و الميكروبيوم المحيط المحيطي من قبل جدول OTUs في الانضمام PRJNA386367.
2. تحديد قيمة الطاقة الأمثل
ملاحظة: تحتوي حزمة WGCNA على كافة المعلمات الوظيفية التالية. WGCNA هو حزمة R لتحليل شبكة الارتباط المرجح. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S1.
- في بيئة اللغة R، افتح برنامج Rstudio وتثبيت حزمة WGCNA.
- تحميل البيانات واستخدام الدالة goodSamplesGenes للتحقق من صحة البيانات. تنفيذ أسطر الأوامر:
"gsg = goodSamplesGenes(datExpr0، مطول = 3)
gsg $allOK "
انقر فوق تشغيل.
- تحقق من القيم المتطرفة وتخزين العينات التي تلبي المتطلبات. عندما تكون نتيجة التحقق TRUE، تابع إلى الخطوة التالية. حفظ النتيجة.
- استخدم الدالة PickSoftThreshold لحساب الفهرس R2 الخالي من المقياس من مجموعتي البيانات ضمن قيم طاقة مختلفة. تنفيذ سطر الأوامر:
"sft = pickSoftThreshold(datExpr0، powerVector = القوى، مطول = 5)"
انقر فوق تشغيل.
- تصور النتائج (الشكل 1). تنفيذ سطر الأوامر:
"مؤامرة (sft $fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab ="العتبة الناعمة (قوة)",ylab="مقياس طبولوجيا حرة نموذج صالح,موقع R ^2",type="n",
الرئيسية = لصق("ES_Scale الاستقلال"))؛
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
تسميات = القوى، cex = cex1، col ="أحمر")؛
abline(h=0.9,col="أحمر")
مؤامرة (sft $fitIndices[,1], sft $fitIndices[,5],
xlab ="العتبة الناعمة (قوة)",ylab="متوسط الاتصال", اكتب ="n",
الرئيسي = لصق("ES_Mean الاتصال"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], التسميات =القوى, cex=cex1,col="red")"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: فرضية خوارزمية شبكة الارتباط المرجح هو أن بنية شبكة التعبير المشترك المنشأة تتوافق مع معايير معيار الطوبولوجيا الخالي من المقياس، مما يزيد من متانتها. يشير فهرس خال من المقياس أقرب إلى 1 إلى بنية شبكة اتصال أقرب إلى الشبكة الخالية من المقياس.
- حدد قيمة الطاقة عندما يكون الفهرس R2 الخالي من المقياس مربع أكبر من 0.9 ثم انتقل إلى الخطوة التالية من التحليل.
ملاحظة: عندما يكون الفهرس الخالي من المقياس قريبا من 1، تكون بنية الشبكة أقرب إلى الشبكة الخالية من المقاييس. عند تحليل شبكتين أو أكثر، من الضروري اختيار جعل كل شبكة قريبة من قيمة الطاقة للشبكة الخالية من النطاقات لتلبية إمكانية المقارنة بين الشبكات المشتركة.
3. بناء شبكة التعبير المشترك وتحديد وحدة
ملاحظة: استنادا إلى قيمة الطاقة المحسوبة أعلاه، يتم إنشاء شبكة التواجد المشترك. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S2.
- استخدم دالة التجاور في حزمة WGCNA لإضافة معلمات موقعة لإنشاء شبكة مشاركة رمزية. تنفيذ سطر الأوامر:
"التجاور = التجاور (datExpr0، الطاقة = softPower)"
انقر فوق تشغيل.
- تطبيق الدالة TOM-التشابه لتطوير شبكة تداخل طوبولوجية وحساب شبكة الاختلاف. تنفيذ سطر الأوامر:
"توم = التجاور(التجاور)؛
ديستوم = 1-توم"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: تمت إضافة المعلمة الموقعة لتعيين نوع شبكة اتصال تراكب الطوبولوجيا.
- استخدم الدالة hclust لتحديد أسلوب التجميع الهرمي للربط المتوسط للتكتل الهرمي. تنفيذ سطر الأوامر:
"geneTree = hclust (as.dist(dissTOM)، طريقة = "متوسط")؛
انقر فوق تشغيل.
- استخدام وظيفة cutreeDynamic لأداء قطع فرع الحيوية وتعيين المعلمة minClusterSize إلى 30. الحصول على نتيجة التعرف على الوحدة النمطية. تنفيذ سطر الأوامر:
"dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree، distM = dissTOM، deepSplit = 2، pamRespectsDendro = FALSE، minClusterSize = minModuleSize)؛ "
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: قد لا يكون الحد الأدنى لحجم الوحدة النمطية أقل من 30.
- حساب الوحدة eigen من كل وحدة OTUs بواسطة moduleEigenes دالة. تنفيذ سطر الأوامر:
"MEList = moduleEigenes(datExpr0، ألوان = ألوان ديناميكية)
MEs = MEList $eigengenes"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: تمثل الوحدة النمطية eigen مستوى التعبير OTU الكلي في الوحدة النمطية. لم يكن وحدة وحدة الإرسال الكبرى محددة، ولكن العنصر الرئيسي الأول لكل كتلة التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل قيمة الشبكة المفرد.
- قم بأداء وظيفة الكتلة استنادا إلى معامل الارتباط للوحدة eigen. استخدم دالة mergeCloseModules لدمج الوحدات النمطية بقيمة أقل من 0.25. تنفيذ سطر الأوامر:
"دمج = mergeCloseModules (datExpr0، الألوان الديناميكية، cutHeight = MEDissThres، مطول = 3)"
انقر فوق تشغيل.
- وأخيرا، استخدم الدالة plotDendroAndColors التصور للحصول على الرسم التخطيطي عرض تعيين الوحدة النمطية لكل شبكة التعبير المشترك(الشكل 2). استخدم دالة الجدول لاستخراج إسناد الوحدة النمطية المطابق لكل OTin جدول تعيين الوحدة النمطية. تنفيذ سطر الأوامر:
"plotDendroAndColors (geneTree،mergedColors، "ديناميكية مدمجة"، dendroLabels = FALSE،
تعليق = 0.03، إضافةجويد = TRUE، guideHang = 0.05،
الرئيسي = "ES_Gene dendrogram وألوان وحدة")"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: في الرسم التخطيطي تعيين الوحدة النمطية شبكة التعبير المشتركة تمثل ألوان مختلفة الوحدات النمطية المختلفة، ويمثل الرمادي OTUs التي لا يمكن تصنيفها إلى أي وحدة نمطية. يشير عدد أكبر من وحدات OTUs في الوحدة النمطية الرمادية إلى أن جودة المعالجة المسبقة لمصفوفة التعبير في مرحلة مبكرة ضعيفة.
4. مقارنة الوحدة
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة وحدات الشبكة لمجتمعين ميكروبيين إيكولوجيين. في هذه المقالة، قارن الاختلافات بين وحدات الشبكة الميكروبية بين الغلاف المحيطين ورهيزوبلان، والغلاف المحيطي ورهيزوسفير، ورهيزوبلان.
- اختبار الحفظ
- تحميل المعلمات والنتائج من مجموعتي البيانات المحفوظة في الخطوات السابقة.
- تعيين نتيجة تعيين الوحدة النمطية للشبكة لمجموعة من البيانات الميكروبية كمجموعة مرجعية، بينما المجموعة الأخرى كمجموعة اختبار.
- استخدم دالة modulePreservation لحساب قيم المعلمات الإحصائية المحافظة Z_summary و medianRank. تنفيذ سطر الأوامر:
"system.time({mp=modulePreservation(multiExpr,
متعدد الألوان، referenceNetworks = 1،
nالتكفير =100, عشوائيSeed=1,quickCor=0,مطول=3)})"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: يمكن قياس هذه النتيجة المحافظة بين الوحدات النمطية. Z_summary>10 يشير إلى أن وحدتين يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، في حين أن Z_summary<2 يشير إلى وحدات غير محفوظة. medianRank يعبر عن الحفاظ النسبي للوحدة تقييمها حسب الترتيب. تشير القيم المتوسطة الأعلى إلى الوحدات النمطية غير المحفوظة. (خطوط الأوامر الرئيسية تشير إلى الملحق S3.)
- استخدم وظيفة الرسم لتصور النتائج (الشكل 3). الحصول على المعلمات Z_summary و المتوسطالنضومتر (الجدول 1).
ملاحظة: وحدات الشبكة التي تفي كل من قيمة Z_summary أقل من 2 وقيمة الرتبة المتوسطة في الأعلى، هي الوحدة النمطية الأكثر غير المحفوظة في مجتمعين ميكروبيين إيكولوجيين.
- استنادا إلى نتائج المعلمات الإحصائية المذكورة أعلاه لتحديد وحدة نمطية مع معظم وحدة غير محفوظة للغاية من الشبكتين.
- تحليل الارتباط لعضوية الوحدة النمطية
- تعيين نتائج تعيين الوحدة النمطية لشبكتي تم تعيين كمرجع ومجموعة الاختبار على التوالي.
ملاحظة: يجب أن تكون الإعدادات هي نفسها اختبار Preservation.
- استخدم الدالة corPvalueStudent لاستخراج قيمة kME (عضوية الوحدة النمطية) لكل وحدة الإرسال الكبرى في عدة وحدات نمطية المرشح.
تنفيذ سطر الأوامر:
"Pvalue = as.data.frame (كوربفالويسستودنت(as.matrix
(وحدة عضو)، عينات)"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: kME تعني درجة عضوية الوحدة النمطية. ME لتقف على وحدة eigen، والذي يمثل المستوى العام للتعبير وحدة الوحدة في وحدة نمطية. kME هو معامل الارتباط بين كل وحدة حرارية بريطانية و ME. تحديد أهمية وحدة الإرسال الكبرى في الشبكة حسب قيمة kME ل OTU. (خطوط الأوامر الرئيسية تشير إلى الملحق S4.)
- ثم استخدم الدالة مطولةScatterplot لحساب معامل الارتباط قيمة kME من OTUs المقابلة في الشبكتين ورسم الرسم التخطيطي تحليل الارتباط(الشكل 4).
تنفيذ سطر الأوامر:
"مطولالكاتربيرلوت (القيمة المطلقة(TModuleMembership
[TmoduleGenes, تكولومن]),
القيمة المطلقة (NModuleMembership[NmoduleGenes, نكولومن]),
xlab = لصق ("kME في" ، "ES") ،
ylab = لصق ("kME في" ، "RP") ،
الرئيسي = لصق("lightyellow") ،
cex.main = 1.7، cex.lab = 1.6، cex.axis = 1.6، col = وحدة تلوين)"
انقر فوق تشغيل.
- حدد الوحدة النمطية ذات معامل الارتباط الأصغر لقيمة kME لوحدة الإرسال الكبرى للشبكتين. خذ بعين الاعتبار هذه الوحدة النمطية أن يكون أكبر فرق بين شبكتي الاتصال.
5. تحليل وحدة الشبكة التفاضلية الميكروبية
- الحصول على بيانات البكتيريا المهيمنة phyla من خلال التحليل الإحصائي لمجموعة تسلسل وحدة الوحدة مع أكبر الفرق.
ملاحظة: يتم تلخيص مجموعة تسلسل وحدة الوحدة النمطية مع الفرق الأكبر بواسطة تصنيف phyla. شكلت البكتيريا المهيمنة فيلا أكثر من 10٪.
- ثم استخدم الدالة exportNetworkToCytoscape للحصول على الملف الذي يحتوي على معلومات علاقة التفاعل من وحدة الإرسال الكبرى في الوحدة النمطية التفاضلية أكبر.
تنفيذ سطر الأوامر:
"cyt = التصديرNetworkToCytoscape(modTOM،
edgeFile = لصق ("NEW-ES_CytoscapeInput-الحواف-", وحدات , ".txt", sep =""),
nodeFile = لصق ("NEW-ES_CytoscapeInput-العقد-", وحدات نمطية, ".txt", sep=")
مرجح = TRUE، عتبة = 0.5، العقدةأسماء = modProbes،
altNodeNames = modGenes، العقدةمتغير = وحدة ألوان [inModule])"
انقر فوق تشغيل.
- استيراد الملف إلى Cytoscape. تعيين العتبة إلى 0.5 وضبط المعلمات الأخرى حسب الحاجة.
- بناء شبكة مشتركة من الكائنات الحية الدقيقة التفاضلية (الشكل 5).
- الحصول على معلومات من جنس الأساسية التي لها أهم دور تنظيمي في الشبكة.
ملاحظة: وفقا لقيمة kME OUT، يمكن تعريف جنس الأساسية.
- وأخيرا، تم تقييم وظائف الجنس الأساسي وتحليل تأثيره على شبكة الفرق بأكملها.