Method Article

مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تسلل الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. يمكن تطبيق طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية على كل من أنسجة البنكرياس الماوس والإنسان5,6,8. يتم الحصول على شرائح أنسجة البنكرياس البشرية من الأنسجة المانحة للأعضاء من خلال التعاون مع شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD). يمكن إنشاء شرائح الماوس من مجموعة متنوعة من سلالات الماوس المختلفة.

سيركز هذا البروتوكول على إعادة دمج السكري غير البدين لتفعيل الجينات-1-null (NOD. Rag1-/-) ومستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) سلالات الماوس. موافقه. راغ1/- الفئران غير قادرة على تطوير الخلايا T و B بسبب اضطراب في الجين تنشيط إعادة التركيب 1 (Rag1)14. موافقه. Rag1-/-. تستخدم الفئران AI4 α/β كنموذج لمرض السكري من النوع 1 المتسارع لأنها تنتج استنساخ خلية T واحدة تستهدف سطح الأنسولين ، مما يؤدي إلى تسلل جزيرة ثابتة وتطور سريع للأمراض15. يصف البروتوكول المعروض هنا إجراءات الدراسات الوظيفية والمناعية باستخدام شرائح البنكرياس البشرية والفأرة الحية من خلال تطبيق نهج المجهر الكونفوكوكال. وتشمل التقنيات الموصوفة هنا تقييمات الجدوى، وتحديد الجزيرة وموقعها، وتسجيلات Ca2+ السيتوسوليك، فضلا عن تلطيخ وتحديد مجموعات الخلايا المناعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظات: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا (201808642). تم الحصول على أقسام البنكرياس البشري من المتبرعين بالأنسجة من كلا الجنسين عن طريق شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD) بنك الأنسجة، جامعة فلوريدا. تم حصاد pancreata الإنسان من المتبرعين بالأعضاء الجثث من قبل منظمات شراء الأعضاء المعتمدة الشراكة مع nPOD وفقا لقوانين وأنظمة التبرع بالأعضاء وتصنيفها على أنها "مواضيع غير بشرية" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فلوريدا (IRB No. 392-2008) ، مع التنازل عن الحاجة إلى الموافقة. تمت الموافقة على أنسجة nPOD المستخدمة خصيصا لهذا المشروع على أنها غير بشرية من قبل جامعة فلوريدا IRB (IRB20140093). أهداف الأقسام 1-3 من هذا البروتوكول هي شرح كيفية تشريح الماوس بنجاح، وإعداد ومعالجة البنكرياس، وتوليد شرائح أنسجة البنكرياس الحية. وينبغي إعداد الحلول في وقت مبكر، ويمكن العثور على وصفات في الجدول التكميلي 1. الوقت هو العامل الأكثر أهمية أثناء هذه الخطوات البروتوكول. بمجرد التضحية بالفأر، ستبدأ صلاحية الأنسجة في الانخفاض. يجب إكمال الأجزاء الثلاثة من هذا البروتوكول في أسرع وقت ممكن حتى يتم إنشاء كافة الشرائح الضرورية.

1. التحضير لتوليد شرائح البنكرياس الماوس

  1. المشبك شفرة على حامل شفرة هزاز، ولكن لا نعلق عليه هزاز حتى الآن.
  2. تذوب 100 مل من 1.25٪ ث / الخامس منخفضة نقطة انصهار agarose في الميكروويف. تشغيل الميكروويف في فترات 1 دقيقة، ووقف الميكروويف لمدة 10 ثانية إذا كان الحل agarose يبدأ في الغليان. كرر هذه العملية حتى يذوب الآغاروز، ويتم إنتاج حل متجانس. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تركيز agarose منخفضة هو لحساب الكثافة المنخفضة للبنكرياس الماوس.
  3. ملء 10 مل لوير قفل حقنة مع 3 مل من الآغروز الدافئ. تناسب إبرة 27 G 25 ملم على الحقنة. احتفظ بالحقنة مع الإبرة المرفقة المتوجة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يتم حقن المحلول.
    ملاحظة: يفضل إبرة 27 G لأنها تناسبها بشكل آمن في القناة الصفراوية المشتركة للفئران بين 10-25 غرام في وزن الجسم ويسمح بتدفق محلول الآجاروز اللزج للغاية. في حين يمكن اختيار الإبر الكبيرة لاستخدامها ، لا يوصى بالإبر الأصغر (أكبر مقياس) لأنها قد تكون مسدودة بسهولة أكبر بمحلول الآجاروز.
  4. أضف 20 مل من محلول خارج الخلية المبرد (ECS) إلى طبق بيتري 10 سم.
    ملاحظة: لا يحتاج ECS إلى bubbled في أي نقطة.
  5. ملء اثنين من 10 سم غير المعالجة أطباق بيتري مع 15 مل من كريبس-رينغر بيكربونات العازلة (KRBH) التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز وفول الصويا تريبسين مثبط بتركيز 0.1 ملغم / مل لكل طبق.
    ملاحظة: في جميع أنحاء هذا البروتوكول, من الضروري أن جميع الحلول المستخدمة للحفاظ على شرائح تحتوي على مثبطات فول الصويا تريبسين لمنع تلف الأنسجة الناجمة عن proteases الجهاز الهضمي البنكرياس.

2. استئصال البنكرياس الماوس ومعالجة الأنسجة

ملاحظة: يتم تعديل بروتوكول استئصال البنكرياس ومعالجة الأنسجة وتوليد شرائح من Marciniak et al5. لضمان صلاحية الأنسجة، قلل من الوقت بين إزالة البنكرياس وتوليد الشرائح. وينبغي إعداد جميع المعدات اللازمة مسبقا وتوجيهها بطريقة تسمح بالتقدم السريع من خلال الخطوات التالية. يتم إجراء القناة الصفراوية الحقن وكذلك استئصال البنكرياس أفضل تحت مجسمة.

  1. يتم تخدير الفأر بعمق مع isoflurane والتضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: Isoflurane هو أسلوب التخدير المفضل. تركيز 5٪ ايزوفلوران يجب أن تستخدم. على سبيل المثال، يجب استخدام 0.26 مل مع غرفة L 16. لوحظ انخفاض في قابلية البقاء في أنسجة البنكرياس عند استخدام ثاني أكسيد الكربون.
  2. رش الماوس مع 70٪ v/v الإيثانول بحرية للحد من تلوث الأنسجة مع الفراء أثناء تشريح واستئصال. ضع الماوس في الظهر لأسفل، اتجاه البطن لأعلى مع الجانب الأمامي إلى اليسار.
  3. باستخدام مقص، افتح الصفاق وإزالة القفص الصدري، مع الحرص على عدم ثقب القلب أو الأوعية المجاورة. استخدم ملقط لقلب الكبد في تجويف الصدر، ونقل الأمعاء من تجويف الجسم لفضح القناة الصفراوية الشائعة. استخدام المشبك البلدغ جونز هوبكنز لحصر أمبولا من فاتر.
  4. استرداد 10 مل لوير قفل حقنة محملة مسبقا مع 3 مل من محلول الآغروز الدافئ من حمام الماء 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بمجرد إزالة الحقنة مع الآغاروز من حمام الماء ، يجب إجراء حقن البنكرياس بسرعة قبل أن يبرد الآغاروز وي مجموعات في الحقنة.
  5. عقد ملقط في اليد اليسرى، واستخدامها لدعم بلطف وتحقيق الاستقرار في القناة الصفراوية للحقن.
  6. عقد الحقنة في اليد اليمنى، إدراج إبرة شطبة الجانب حتى في القناة الصفراوية. حقن البنكرياس ببطء وثبات. بمجرد بدء الحقن ، لا يمكن إيقاف التدفق دون تصلب الآغاروز في الحقنة وفي البنكرياس.
    ملاحظة: تعتمد وحدة التخزين المستخدمة على وزن الماوس. بناء على الخبرة، فمن المستحسن أن 1 مل من محلول الآغاروز يمكن استخدامها لكل 10 غرام من وزن جسم الماوس مع الحد الأقصى لحجم 2 مل. البنكرياس يجب أن تبدو مبالغ فيها قليلا مع هيكل أكثر حسما، ولكن ليس الإفراط في التوسع. الإفراط في حقن النتائج في الجزر التي تصبح منفصلة عن أنسجة الغدد الصماء التي لها مظهر "تفجير التدريجي" في شرائح.
  7. استئصال البنكرياس المملوء بالأغاروز من الفأر. باستخدام ملقط ومقص، وقطع البنكرياس بعيدا، بدءا من المعدة، والانتقال إلى الأمعاء، وتنتهي عند الطحال. قطع مرة واحدة بعيدا، وإزالة البنكرياس حقن بلطف مع ملقط، ووضعها في طبق بيتري 10 سم مليئة ECS المبردة.
  8. استخدم مقصا لإزالة الأنسجة الدهنية والكوادية والأنسجة الليفية وأجزاء البنكرياس التي لا يتم حقنها بالغاروز.
    ملاحظة: أجزاء من الأنسجة التي ينبغي إزالتها لن يكون لها هياكل راسخة بقوة وسوف تظهر الجيلاتينية إلى حد ما.
  9. بعد تشذيب الأنسجة، استخدم مقصا لقطعها إلى أقسام أصغر يبلغ قطرها حوالي 5 مم مع تركها مغمورة تحت ECS. قطع الأنسجة بعناية، مع الحرص على عدم دفع agarose من الأنسجة.
  10. إزالة قطعة من الأنسجة من ECS، ووضعها على ممسحة اثنين من ply (انظر جدول المواد). لفة بلطف لهم على ممسحة باستخدام ملقط لإزالة السائل الزائد.
  11. باستخدام ملقط، ضع بعناية قطعة من الأنسجة في طبق بيتري 35 ملم مع ما لا يزيد عن 4 قطع لكل لوحة. ضع الجانب المسطح من كتلة الأنسجة التي تواجه لأسفل. اضغط برفق على الأنسجة باستخدام ملقط.
    ملاحظة: تأكد من وجود مسافة، على الأقل بضعة ملليمترات، بين قطع الأنسجة، وأنها لا تلمس حافة اللوحة.
  12. صب ببطء agarose 37 درجة مئوية في الطبق، مع الحرص على عدم صب مباشرة على الأنسجة. صب ما يكفي بحيث يتم تغطية قطع الأنسجة تماما. تأكد من وجود طبقة من الآغاروز فوق قطع الأنسجة حيث سيتم لصق هذا الجزء على حامل العينة.
  13. نقل الطبق بعناية مع قطع من الأنسجة إلى الثلاجة للسماح للgarose لتعيين. تأكد من أن قطع الأنسجة لا تتغير أو تبدأ في الطفو. إذا فعلوا ذلك ، بسرعة إعادة ضبطها باستخدام ملقط.
    ملاحظة: إعداد agarose يجب أن يستغرق سوى بضع دقائق.
  14. مرة واحدة وقد وضعت agarose، استخدم مشرط لقطع حول الأنسجة في خطوط مستقيمة لجعل كتل agarose كما لو جعل شبكة بين قطعة من الأنسجة. تأكد من ترك بضعة ملليمترات من الآجروز المحيطة بجميع جوانب الأنسجة.
    ملاحظة: لا ينبغي أن يكون هناك أي نسيج جاحظ من الآغاروز. يجب أن يكون كل كتلة مكعب من حوالي 5 مم × 5 مم × 5 مم حجم.
  15. استخدام مشرط الوجه من أقسام فارغة من الآغاروز التي قطعت حول حواف لوحة. إزالة الكتل مع الأنسجة من الطبق عن طريق رفعها بعناية مع ملقط.

3. الماوس شريحة البنكرياس جيل

  1. باستخدام ملقط، وترتيب كتل على حامل العينة؛ وضعها جانبية، مع الأخذ في الاعتبار أنها سوف انقلبت على الغراء السوبر. ترتيب الكتل بحيث لا تمتد أبعد من عرض النصل. كما يتحرك الهزاز ببطء، وترتيب الكتل بحيث النصل يجب أن تتحرك إلى الأمام على مسافة أقل قدر ممكن.
    ملاحظة: صفين من ثلاث أو أربع كتل مع كل ملليمترات قليلة بين الصفوف يعمل بشكل جيد. يمكن للكتل داخل الصف نفسه لمس بعضها البعض، ولكن عندما يلمس كلا الصفين، قد يكون من الصعب استرداد الشرائح عند نزولها من الكتل.
  2. تطبيق خط من الغراء السوبر على حامل العينة، واستخدام نهاية موزع الغراء لنشر الغراء إلى طبقة رقيقة. الوجه كتل الأنسجة على الغراء بحيث الجانب الأقرب إلى الأنسجة يواجه صعودا. دفع بلطف إلى أسفل على كتل، والسماح للغراء الجاف لمدة ثلاث دقائق.
  3. إرفاق حامل النصل ولوحة إلى الهزاز، وعادة مع المسمار أو المغناطيس، اعتمادا على نموذج هزاز. ضبط ارتفاع النصل والمسافة المقطوعة بحيث ينتقل النصل على طول الكتل وبالكاد فوقها.
    ملاحظة: ملقط يمكن أن تكون مفيدة أثناء ضبط ارتفاع النصل. يمكن وضعها على رأس كتلة الأنسجة للمساعدة في وضع النصل أقرب إلى الجزء العلوي من الكتلة قدر الإمكان دون لمس الكتلة.
  4. تأكد من أن الغراء قد جفت عن طريق دفع بلطف كتل مع ملقط، وملء صينية هزاز مع ECS المبردة حتى يتم تغطية النصل. تعيين الهزاز لجعل شرائح سمك 120 ميكرومتر بسرعة 0.175 ملم / ثانية، تردد 70 هرتز، وسعة 1 ملم.
    ملاحظة: يمكن ضبط سرعة الهزاز اعتمادا على سهولة قطع الأنسجة.
  5. بدء الهزاز، ومشاهدة عندما تبدأ شرائح الخروج من كتل الأنسجة. استخدام ملقط Graefe 10 سم أو فرشاة الطلاء الصغيرة رقم 4 لإزالة بعناية شرائح بمجرد أن تطفو قبالة كتلة، ووضعها في لوحات 10 سم مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز ومثبطات تريبسين. التقاط شرائح عن طريق وضع فرشاة الطلاء أو ملقط تحتها ورفع شرائح بلطف. لا تحتضن أكثر من 15 شريحة معا في طبق واحد.
    ملاحظة: من الطبيعي أن يكون الهزاز بضعة يمر فوق الكتل حيث يتم إجراء أي شرائح، ولكن يجب تقليل هذه للوقت. يكون مقص جاهزة في حالة شرائح لا تنفصل تماما عن كتل الأنسجة. إذا حدث هذا، سيتم تمسك زاوية أو حافة الشريحة إلى الكتلة بعد تمرير شفرة الهزاز. لا تسحب الشريحة أو الكتلة عند إزالة الشريحة العالقة.
  6. وضع لوحات مع شرائح على الروك في درجة حرارة الغرفة وفي 25 دورة في الدقيقة. دع الشرائح ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. إذا كانت ستترك لفترة أطول، ضع الشرائح في 15 مل من شريحة الثقافة المتوسطة (انظر الجدول التكميلي 1) في حاضنة. شرائح الحضانة المعدة للدراسات في نفس اليوم عند 37 درجة مئوية، وشرائح الثقافة التي يتم استزراعها بين عشية وضحاها عند 24 درجة مئوية، ونقلها إلى 37 درجة مئوية على الأقل ساعة واحدة قبل التجارب.
    ملاحظة: على المدى الطويل، شرائح لها قدرة أفضل على البقاء عندما مثقف في 24 درجة مئوية، على الرغم من أن 37 درجة مئوية هو أقرب إلى بيئتها الفسيولوجية الأصلية، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض نشاط إنزيمات البروتيز تفرز في درجة حرارة أقل. يتم استزراع شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية والبشرية في نفس درجة الحرارة وبحد أقصى 15 شريحة لكل طبق. ومع ذلك ، تختلف وصفات الوسائط لشرائح الإنسان والفأر. وترد كلتا الصيغتين في الجدول التكميلي 1. بالإضافة إلى ذلك، الإجراء هو نفسه لتوليد شرائح الماوس والإنسان باستثناء البنكرياس الماوس التي تتطلب الحقن مع agarose لتحقيق الاستقرار. يتم الحصول على شرائح الإنسان من خلال برنامج شريحة البنكرياس nPOD. كل من الماوس وشرائح الإنسان هي 120 ميكرومتر سميكة. ويمكن إجراء مجموعة متنوعة من التجارب على شرائح; اختيار لوحات تلطيخ التي تعمل بشكل أفضل للتجارب المخطط لها.

4. إعداد شرائح لإجراءات تلطيخ

  1. زراعة الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجارب المخطط لها. KRBH دافئ يحتوي على 3 MM D-الجلوكوز في حمام الماء 37 درجة مئوية. نقل 2 مل من KRBH تحتوي على 3mM D-الجلوكوز في طبق 35 ملم، واستخدام فرشاة لوضع بلطف شريحة في الطبق.
  2. إذا تم نقل الشريحة من المتوسط، اغسلها مرتين مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام ماصة نقل أو ماصة باستور، مع الحرص على عدم تعكير صفو الشريحة. احتفظ بالشريحة في الطبق مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز في حين يتم إعداد لوحات تلطيخ.

5. ديثيزون تلطيخ

ملاحظة: على الرغم من أن dithizone يمكن استخدامها لتلطيخ الجزر الحمراء، فإنه سيتم قتل شريحة كما تم العثور على أن تكون سامة للخلايا إلى الجزر17.

  1. قياس 12.5 ملغ من dithizone، إضافته إلى 1.25 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد، واتخاذ هذا الخليط حتى في حقنة 50 مل. املأ المحاقن بحجم 25 مل باستخدام محلول الملح المتوازن Hanks Balanced Salt Solution، وأرفق فلتر بنهاية الحقنة. Aliquot 2 مل من KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز، وإضافة 2 قطرات من محلول dithizone المصفاة من حقنة 50 مل في طبق 35 ملم.
  2. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في طبق بتري 35 ملم. صورة شريحة مع الجزر المشار إليها بواسطة تلطيخ dithizone الأحمر باستخدام مجسم.

6. تلطيخ الجدوى

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية تقييم صلاحية الشريحة باستخدام calcein-AM والأزرق-الفلورسنت SYTOX الأزرق (راجع جدول المواد). يجب استخدام Calcein-AM بتركيز 4 ميكرومتر و SYTOX Blue عند 1 ميكرومتر.

  1. Aliquot 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، وإضافة 2 ميكرولتر من صبغ كالسين-AM والأزرق SYTOX لفصل aliquots. دوامة الخلائط لمدة 5 ق.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز وصبغ calcein-AM إلى كل بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا.
    ملاحظة: يمكن استخدام لوحات بديلة و/أو غرف تصوير غير زجاج تغطية 8 غرف بشكل جيد.
  3. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في كل بئر من الطبق، ونقل لوحة مع شرائح إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. غسل شرائح مرتين مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH باستخدام نقل أو باستور ماصة، مع الحرص على عدم إزعاج الشريحة.
  4. ضع الشريحة في طبق بيتري ذو قاع غطاء 35 مم يحتوي على 2 مل من KRBH مع 3 mM D-glucose و 2 ميكرولتر من SYTOX Blue بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل من المحلول. تغطية شريحة مع مرساة شريحة، وضمان أن الجانب مع القيثارة يواجه إلى أسفل. التقاط صور للشريحة.
    ملاحظة: إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، قم بتبليلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 mM D-glucose لغمرها في المحلول. من المهم الحفاظ دائما على الشرائح في المحاليل التي تحتوي على مثبط البروتيز ، حتى أثناء تحميل الصبغة. يمكن تكييف بقع الجدوى المستخدمة لتجربة محددة أو إعداد المجهر.

7. شريحة Ca2 + مؤشر تلطيخ

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية وصمة عار شرائح التسجيلات Ca2 + باستخدام Oregon الأخضر 488 BAPTA-1، AM و SYTOX الأزرق في شرائح الماوس (انظر جدول المواد). وينبغي استخدام أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، AM بتركيز 5.6 ميكرومتر والأزرق SYTOX في 1 ميكرومتر. في شرائح الإنسان، يجب استخدام فلوو-4-AM بتركيز 6.4 ميكرومتر.

  1. Aliquot 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، إضافة 7 ميكرولتر من الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، AM ودوامة الخليط لمدة 5 ثانية.
    ملاحظة: لشرائح الأنسجة البشرية، استخدم Fluo-4-AM بدلا من OREGON Green 488 BAPTA-1، AM. وFluo-4-AM هو الأفضل لأنه أكثر إشراقا عندما يزيد تركيز Ca2 + داخل الخلية; ومع ذلك, فإنه لا يتم تحميل جيدا في أنسجة البنكرياس الماوس. البروتوكول هو نفسه كما هو موضح أعلاه لFluo-4-AM باستثناء أن Fluo-4-AM يحتاج فقط إلى احتضان لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3mM D-الجلوكوز وصبغ إلى كل بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في كل بئر من زجاج الغطاء المغرغر. نقل زجاج الغطاء المغرض مع شرائح إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  3. غسل شرائح مرتين مع KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام نقل أو باستور ماصة, مع الحرص على عدم تعكير صفو شريحة.
  4. ضع شريحة في لوحة تصوير أو غرفة مع KRBH تحتوي على 3 mM D-الجلوكوز والأزرق SYTOX بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل، وتغطي مع مرساة شريحة، وضمان أن القيثارة يواجه إلى أسفل. التقاط صور للشريحة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، طبق 35 مم مملوءة 2 مل من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز و 2 ميكرولتر من SYTOX الأزرق تم استخدامها. إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، فبلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 MM D-Glucose لغمرها في المحلول.

8. الماوس شريحة Ca2 + التسجيلات

ملاحظات: يصف القسم التالي كيفية تنفيذ تسجيلات Ca2+ على شرائح أنسجة البنكرياس الماوس باستخدام الأخضر أوريغون 488 BAPTA-1, AM والأزرق SYTOX. تم إجراء التصوير على مجهر مسح ليزر كونفوج (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). وكانت أشعة الليزر المستخدمة 405 نانومتر للأزرق SYTOX, 488 نانومتر لولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1, AM, و 638 نانومتر للعكس. تم استخدام كاشف هايد لولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1، صباحا. تم استخدام كاشفات أنبوب التمائم الضوئي (PMT) للعكس والأزرق SYTOX. بروتوكول التصوير Ca2 + هو نفسه بالنسبة لشرائح أنسجة البنكرياس البشرية إلا أن Fluo-4-AM تم استخدامه كمؤشر. يجب تعديل مستويات الطاقة بالليزر، والكسب، وحجم الثقب استنادا إلى العينة والخريلية المعينة المصورة. عادة، ثقب من 1.5 وحدات متجدد الهواء وقوة الليزر من 1٪ هي نقاط انطلاق جيدة.

  1. على الأقل 1 ساعة قبل التسجيل، قم بتشغيل المجهر وتوازن الحاضنة على شكل خشبة المسرح أو القفص إلى 37 درجة مئوية. ضع طبق بيتري ذو القاع الزجاجي مقاس 35 مم الذي يحتوي على الشريحة على المسرح بعد إزالة الغطاء. التركيز عن طريق وضع المجهر إلى الهدف 10x ووضع brightfield. حدد موقع الجزر باستخدام brightfield من خلال البحث عن البيضاوي البرتقالي والبني داخل الشريحة.
  2. بمجرد تحديد موقع جزيرة محتملة، قم بتبديل المجهر إلى وضع التصوير البؤري. لتأكيد الجزر عن طريق العاكسة، قم بتشغيل ليزر 638 نانومتر، وحدد قوة الليزر بين 1٪ و 2٪، واطفأ مرشح 638 نانومتر من شأنه أن يزيل عادة الضوء المكثر. تعيين حدود الكشف على كاشف PMT لعرض نطاق ترددي يبلغ حوالي 20 نانومتر متمركز حول 638 نانومتر.
    ملاحظة: توخي الحذر كما تشغيل المجهر في وضع انعكاس يمكن أن تلحق الضرر كاشف. نظرا لارتفاع حبيبة أنسجة الغدد الصماء ، يمكن الآن استخدام الضوء المنعكس لتحديد موقع الجزر. ستظهر الجزر كجماعات من الخلايا الحبيبية المترنحة بشكل مشرق على قناة الانعكاس هذه.
  3. لعرض SYTOX Blue، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر وكاشف PMT، وحدد طاقة الليزر بين 1٪ و 2٪. مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. مرة واحدة يقع جزيرة من الاهتمام وأكد من قبل backscatter، والتحول إلى الهدف 20x، والتكبير في ذلك الجزيرة يستغرق معظم الإطار.
  4. خذ كومة z من الجزيرة بحجم z-step يبلغ 1.5 ميكرومتر. العثور على أفضل قسم البصرية من الجزيرة حيث معظم الخلايا على قيد الحياة (سلبية للأزرق SYTOX) ومحملة بشكل جيد مع الأخضر ولاية أوريغون 488 BAPTA-1، صباحا أو فلو-4-AM.
    ملاحظة: ليس من غير المألوف أن نرى الخلايا التي هي مثقلة كمية كبيرة من الصبغة التي هي مشرقة جدا. قد تكون هذه خلايا البنكرياس الموت التي Ca2 + التخزين في الشبكية endoplasmic قد يكون أفرج عنه, مما أدى إلى مستويات عالية من التحميل; هذه ليست خلايا مثالية للتسجيل. ابحث عن الخلايا التي حملت الصبغة بوضوح ، ولكنها لا تفرط في تشبع الكاشف بحيث تكون الزيادة في السطوع التي تحدث عندما تتقلب مستويات Ca2 + السيتوسوليك مرئية. تحميل صبغ الجزر داخل شرائح متغير; ومع ذلك ، فإن الصبغة عادة ما تحمل بشكل جيد من خلال ~ 10-15 ميكرومتر من الجزيرة. ومع ذلك، يمكن تحميل صبغ يكون من الصعب تصور إذا كانت الخلايا عميقة في الأنسجة.
  5. لمنع تلاشي الصبغة أثناء التسجيل، تأكد من أن طاقة الليزر على قناة 488 نانومتر لا تتجاوز 2٪. زيادة الثقب إلى 2 وحدات متجدد الهواء لجمع المزيد من الإشارة مع انخفاض قوة الإثارة.
  6. تعيين المجهر لتسجيل في وضع XYZT. تحسين الإعدادات لتقليل معدل الإطار إلى 2 s أو أقل لكل إطار.
    ملاحظة: تتضمن تعديلات الإعدادات التي يمكن إجراؤها للمساعدة في تقليل معدل الإطار تشغيل المسح ثنائي الاتجاه، وتقليل متوسط الخط أو إيقاف تشغيله، وزيادة سرعة المسح الضوئي.
  7. بمجرد تحسين الإعدادات، سجل عدة دقائق من النشاط القاعدي.
    ملاحظة: مؤشر جيد آخر على صلاحية الأنسجة هو إذا كانت الخلايا تبدو نشطة وتومض بشكل واضح أثناء هذا التسجيل للنشاط القاعدي.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من الجلوكوز المركز 20x وKCl في KRBH إلى لوحة باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر في نقاط زمنية معينة لتحقيق تركيز النهائي من الجلوكوز 16.7 mM أو 30 MCL.
    ملاحظات: أضف الحلول بعناية، مع الحرص على عدم إزعاج الشريحة أثناء التسجيل. تأكد من عدم عثرة لوحة مع micropipette. ومن المعتاد أن نرى العقد الأنسجة استجابة لهذه التحفيزات. تمت معالجة تسجيلات التدفق Ca2+ وقياسها كميا في ImageJ18. باستخدام برنامج ImageJ ، وكثافة تلطيخ ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA - 1 ، تم قياس AM في الخلايا عن طريق اختيار المناطق ذات الاهتمام يدويا (ROIs). تم حساب كثافة الفلورسينس من هذه ال ROIs بقسمة قيم الفلورسينس في النقاط الزمنية اللاحقة على قيم الفلورسينس الأولية للخلايا (F/F0). ويمكن استخدام نظام التشويش جنبا إلى جنب مع غرفة التصوير المتخصصة لإدارة الحلول لشرائح ديناميكيا بدلا من إضافتها يدويا. يمكن العثور على نظام التغلغل وتوصيات غرفة التصوير في جدول المواد.

9. تلطيخ الخلايا تي الماوس في شرائح البنكرياس الحية

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول كيفية وصمة عار الخلايا المناعية داخل شرائح الماوس. سلالة الماوس المستخدمة هي NOD. Rag1-/-. AI4 α/β كما يتطور هذا النموذج باستمرار المرض مع التهاب الأمعاء كبيرة. تستهدف خلايا CD8+ T في هذا الماوس جميعا كمية من الأنسولين ، مما يسمح باستخدام فيكوريثرين (PE) المسمى الأنسولين -Db tetramer15. يجب استخدام الأجسام المضادة CD8 بتركيز 1:20 ورابع كلوريد الأنسولين في الساعة 1:50.

  1. Aliquot 100 μL من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز، إضافة 2 ميكرولتر من رباعي الأنسولين PE و 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD8 الفيزيقي (APC)، ودوامة الخليط لمدة 5 ثانية.
  2. أضف 100 ميكرولتر من KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز والتترامر والأجسام المضادة إلى بئر من زجاج تغطية 8 غرف جيدا. باستخدام فرشاة الطلاء، ضع بعناية شريحة في بئر زجاج الغطاء المغرغر. نقل زجاج الغطاء المغرض مع شريحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. غسل شريحة مرتين مع 2 مل KRBH تحتوي على 3 MM D-الجلوكوز. يستنشق بعناية KRBH مع 3 MM D-الجلوكوز باستخدام نقل أو باستور ماصة, مع الحرص على عدم تعكير صفو شريحة.
  4. ضع الشريحة في طبق بيتري ذو قاع غطاء 35 مم يحتوي على KRBH مع 3 mM D-Glucose والأزرق SYTOX بتركيز 1 ميكرولتر لكل 1 مل ، وغطيه بمرساة شريحة ، مع وضع الجانب مع القيثارة التي تواجه لأسفل. التقاط صور للشريحة.
    ملاحظة: إذا استمر مرساة الشريحة في الطفو، قم بتبليلها على كلا الجانبين مع KRBH التي تحتوي على 3 mM D-glucose لغمرها في المحلول. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخففة والتترامر مرة واحدة. بعد تلطيخ شريحتين ، يجب إجراء خليط من الأجسام المضادة الطازجة.

10. تسجيل الخلايا المناعية الماوس

ملاحظة: يصف القسم التالي كيفية إجراء تسجيلات الخلايا المناعية على شرائح أنسجة البنكرياس الماوس باستخدام الأجسام المضادة CD8، PE الأنسولين tetramer، والأزرق SYTOX. إعداد التصوير كما هو موضح في القسم 8. تم إجراء التسجيلات بدقة 800 × 800 بكسل. وكانت أشعة الليزر المستخدمة 405 نانومتر للأزرق SYTOX، 488 نانومتر لرباعي الأنسولين، و 638 نانومتر للأجسام المضادة CD8 وانعكاس. واستخدمت أجهزة الكشف عن الهيد للأجسام المضادة CD8 وPE رباعي الأنسولين. واستخدمت أجهزة الكشف PMT لعكس والأزرق SYTOX. بروتوكول تصوير الخلايا المناعية هو نفسه بالنسبة لشرائح أنسجة البنكرياس البشرية باستثناء استخدام الأجسام المضادة المختلفة ومضادات متعددة HLA المعقدة للأنسجة البشرية. لكل من رباعي الانسولين تلطيخ في أنسجة الماوس وHLA-multimer تلطيخ في الأنسجة البشرية, وينبغي استخدام خلية المناعة شارك وصمة عار للتحقق من وجود خلايا تي مستضد رد الفعل محددة. هنا، تم استخدام مضاد CD8. كما يمكن استخدام الأجسام المضادة، مثل مكافحة CD3 أو مكافحة CD4، اعتمادا على عدد الخلايا المستهدفة.

  1. على الأقل 1 ساعة قبل التسجيل، والتبديل على المجهر، وتتوازن الحاضنة المرحلة الأعلى إلى 37 درجة مئوية. تأمين 35 ملم coverglass القاع طبق بيتري التي تحتوي على شريحة على خشبة المسرح. ركز المجهر عن طريق وضع هدف 10x في وضع brightfield. حدد موقع الجزر باستخدام وضع brightfield من خلال البحث عن بيضاويات برتقالية اللون بنية اللون داخل الشريحة.
  2. قم بتبديل المجهر إلى التصوير البؤري عن طريق الضغط على زر CS على وحدة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس بالمجهر. لعرض الجزر بواسطة العاكسة، قم بتشغيل كاشف الليزر وPMT 638، وحدد طاقة الليزر بين 1٪ و 2٪، وإيقاف تشغيل مرشحات الشق.
    ملاحظة: نظرا لزيادة حبيبة أنسجة الغدد الصماء، يمكن الآن استخدام الضوء المنعكس لتحديد موقع الجزر. ستظهر الجزر كجماعات من الخلايا الحبيبية الساطعة على هذه القناة.
  3. لعرض SYTOX Blue، والأجسام المضادة CD8، ورابع كلوريد الأنسولين، تحقق من أن طاقة الليزر تتراوح بين 1٪ و 2٪. استخدم الإعدادات التالية لعرض كل من الثلاثة: بالنسبة إلى SYTOX Blue، قم بتشغيل جهاز الليزر 405 نانومتر وكاشف PMT؛ للأجسام المضادة CD8، قم بتشغيل كاشف HyD؛ ولعرض رباعي الأنسولين، قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر وكاشف HyD.
  4. مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. بمجرد أن تقع جزيرة ذات أهمية ، قم بالتبديل إلى هدف 20x ، واتكبير بحيث تشغل الجزيرة معظم الإطار. خذ كومة z من الجزيرة بحجم z-step يبلغ 1.5 ميكرومتر. العثور على أفضل المقاطع البصرية (سلسلة من بين 5 إلى 10 أقسام) من الجزيرة حيث معظم الخلايا على قيد الحياة (سلبية للأزرق SYTOX) وأي خلايا المناعة المحيطة بها هي في التركيز.
    ملاحظة: حاول العثور على إطارات حيث توجد خلايا متعددة إيجابية CD8 والأنسولين رباعية الأرجل المحيطة أو التسلل إلى الجزيرة.
  5. تعيين المجهر لتسجيل في وضع XYZT. تحسين الإعدادات لتسجيل Z-كومة من الخطوات المحددة كل 20 دقيقة على مدى عدة ساعات.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، فمن الأفضل القيام بهذه التسجيلات في غرفة التصوير حيث يمكن التحكم في درجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون، لا سيما عند التسجيل لأكثر من أربع ساعات. في حالة التسجيل بين عشية وضحاها ، يمكن إضافة الأجسام المضادة الزائدة إلى وسائل الإعلام للتعويض عن ركوب الدراجات مستقبلات الخلايا التائية وتلاشي الصبغة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الفلوروفوريس المختلفة للأجسام المضادة للخلايا التائية. استنادا إلى الخبرة، تعمل الأجسام المضادة في المدى الأحمر البعيد بشكل أفضل للخلايا التائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول سوف تسفر شرائح أنسجة البنكرياس الحية مناسبة لكل من الدراسات وظائف وتسجيلات الخلايا المناعية. تظهر شريحة المظهر في كل من brightfield وتحت الضوء المنعكس في الشكل 1A، B. كما نوقش، يمكن العثور على الجزر في شرائح باستخدام الضوء المنعكس بسبب زيادة الحبيبية التي تحدث بسبب محتواها من الأنسولين (الشكل 1C) ويلاحظ بوضوح بالمقارنة مع أنسجة الخلفية عند استخدام الضوء المنعكس. وينبغي تقييم الجدوى بعد توليد الشرائح، ولا ينبغي تسجيل الجزر إذا كان ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التجربة الموصوفة. ومن الضروري العمل بسرعة. وينبغي تقليل طول الفترة الزمنية بين حقن البنكرياس وتوليد شرائح على الهزاز للحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما يتم تحسين الجدوى عن طريق الحفاظ على البنكرياس في ECS الباردة قبل تشريح بدلا من ECS درجة حرارة الغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح الماوس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
# 3 مقبض مشرط نمطفيشربراند12-000-163
1 م هيبسفيشر ScientificBP299-100عازلة HEPES ، محلول 1 متر
10 سم طبق ثقافة غير معالجكورنينج430591
10 مل حقنة Luer-LokBD301029BD مع أطراف Luer-Lok
27 جرام إبرةBDBD 305109BD الاستخدام العام والدقة Glide الإبر تحت الجلد
35 مم غطاء زجاجي القاع طبق بتريIbidi81156& micro ؛ طبق 35 مم ، حقنة
عالية 50 ملBD309653
غطاء 8 غرف بئرIbidi80826& micro ؛ -Slide 8 Well
APC المضادة للفأر CD8a الجسم المضادBiolegend100712
BSAFisher 199898
كلوريد الكالسيومSigmaC5670CaCl 2< / sub>
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتSigmaC7902CaCl 2< / sub> (ثنائي هيدرات)
الروك الرقميالمضغوط Thermo Fisher Scientific88880020
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeicaSP8الثقب &thinsp ؛ = 1.5-2 وحدات جيدة التهوية ؛ تم الحصول عليها بفتحة عددية 10x / 0.40 HC PL APO CS2 جافة و 20x / 0.75 فتحة عددية HC PL APO CS2 أهداف جافة عند 512 & thinsp ؛ & مرات;   دقة 512 بكسل
D- (+) - الجلوكوزسيجماG7021C6< / sub>H12< / sub>O6< / sub>
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345ثنائي ميثيل سلفوكسيد
مختبراتالإيثانولديكون 2805
طبق ثقافة الأنسجة Falcon 35 ممCorning353001Falcon Easy-Grip Tissue Culture Tالأطباق
FBSGibco10082147
Feather رقم 10 علوم المجهر الإلكتروني للشفرة الجراحية7204410
fluo-4-AMInvitrogenF142012 + < / sup> مؤشر
في الهلام Super GlueLoctite45198
Graefe Fallpsأدوات العلوم الدقيقة11049-10
أدوات العلوم الدقيقة المقوى14090-09
HBSSGibco14025092Hanks محلول الملح المتوازن
HEPESSigmaH4034C8< / sub>H18< / sub>N2< / sub>O4< / sub>S
دلو الثلجفيشربراند03-395-150
إيزوفلورانباترسون البيطريNDC 14043-704-05
جونز هوبكنز بولدوج المشبكروبوز المتجر الجراحيRS-7440  ؛ مستقيم; 500-900 غرام الضغط ؛ 1.5 "طول
KimwipesKimberly-Clark Professional34705Kimtech Science & Trade; Kimwipes™ مساحات المهام الحساسة ، 2-Ply
LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity KitInvitrogenL3224تحتوي هذه المجموعة على صبغة الخلايا الحية calcein-AM.
منخفض الجلوكوز DMEMCorning10-014-CV
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigmaM9272MgCl2< / sub> (سداسي هيدرات)
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتSigmaM2773MgSO4< / sub> (سباعي الهيدرات) منصة
مغناطيسية ساخنةWarner InstrumentsPM-1منصة لغرفة التصوير للتحفيز الديناميكي تسجيلات
الميكروويفGEJES1460DSWW
Nalgene حقنة مرشحثيرمو فيشر العلمي726-2520
رقم 4 فرشاة الرسممايكلز10269140
غرفة تصوير حمام الماس المفتوحةWarnerInstruments RC-26غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي
أوريغون جرين 488 BAPTA-1-AMInvitrogenO6807مؤشر Ca 2 + < / sup>
منفذ خلية غرفة التصوير بين عشية وضحاهاOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050لصنع agarose لتوليد شريحة
من الأنسولين الرباعي المسمى PEEmory Tetramer Researchالتسلسل الأساسي YAIENYLEL
Penicillin StreptomycinGibco15140122
كلوريد البوتاسيومSigmaP5405KCl
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةSigmaP5655KH2< / sub>PO4< / sub>
شفرات الحلاقةعلوم المجهر الإلكتروني71998للاهتزاز ؛ الفولاذ المقاوم للصدأ ذو الحواف المزدوجة ، غير المطلي
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque نقطة انصهار منخفضة الاغاروزLonza50101لصنع agarose لتوليد الشرائح
مرساة الشريحةWarner Instruments64-1421
مرساة الشريحة (التصوير الديناميكي)Warner Instruments640253مرساة الشريحة لغرفة
التصوير الديناميكيبيكربونات الصوديومSigmaS5761NaHCO3< / sub>
كلوريد الصوديومSigmaS5886كلوريد الصوديوم
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدراتSigmaS9638NaH 2< / sub>PO4 < / sub> (monohydrate) مثبط
التربسين فول الصوياSigmaT6522-1Gمثبط التربسين من Glycine max (فول الصويا)
المرحلة محولWarner InstrumentsSA-20MW-ALلتناسب غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي على مرحلة المجهر
حاضنة المسرحOkolabH201
StereoscopeLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell StainInvitrogenS34857بقعة الحمض النووي الأزرق الفلورسنت
نقل PipetFalcon357575فالكون & تجارة; نظام التحكم في صمام ماصات النقل البلاستيكية القابل للتصرف
نظام Warner InstrumentsVCS-8لتسجيلات التحفيز الديناميكي
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
حمام مائيفيشر FSGPD02 علميفيشربراند Isotemp حمام مائي فاخر للأغراض العامة GPD 02
العلمي Ca التحكم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
  4. Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
  5. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  6. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  7. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
  8. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).
  9. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  10. Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
  11. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).
  12. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).
  13. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  14. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  15. Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
  16. Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
  17. Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
  20. Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).
  21. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  22. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).
  23. Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136(2021).
  24. Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
  25. Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
  26. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706(2013).
  27. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pancreatic Tissue SlicesIslet FunctionIslet Immune InteractionsConfocal MicroscopyTime Lapse MicroscopyImmune Cell StainingVibratome SlicingType 1 DiabetesInsulin Tetramer StainingCD8 Antibody Detection

Related Articles