تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.
المقدمة
مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظات: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا (201808642). تم الحصول على أقسام البنكرياس البشري من المتبرعين بالأنسجة من كلا الجنسين عن طريق شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD) بنك الأنسجة، جامعة فلوريدا. تم حصاد pancreata الإنسان من المتبرعين بالأعضاء الجثث من قبل منظمات شراء الأعضاء المعتمدة الشراكة مع nPOD وفقا لقوانين وأنظمة التبرع بالأعضاء وتصنيفها على أنها "مواضيع غير بشرية" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فلوريدا (IRB No. 392-2008) ، مع التنازل عن الحاجة إلى الموافقة. تمت الموافقة على أنسجة nPOD المستخدمة خصيصا لهذا المشروع على أنها غير بشرية من قبل جامعة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول سوف تسفر شرائح أنسجة البنكرياس الحية مناسبة لكل من الدراسات وظائف وتسجيلات الخلايا المناعية. تظهر شريحة المظهر في كل من brightfield وتحت الضوء المنعكس في الشكل 1A، B. كما نوقش، يمكن العثور على الجزر في شرائح باستخدام الضوء المنعكس بسبب زيادة الحبيبية التي تحدث بسبب محتواها من الأنسولين (الشكل 1C) ويلاحظ بوضوح بالمقارنة مع أنسجة الخلفية عند استخدام الضوء المنعكس. وينبغي تقييم الجدوى بعد توليد الشرائح، ولا ينبغي تسجيل الجزر إذا كان .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التجربة الموصوفة. ومن الضروري العمل بسرعة. وينبغي تقليل طول الفترة الزمنية بين حقن البنكرياس وتوليد شرائح على الهزاز للحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما يتم تحسين الجدوى عن طريق الحفاظ على البنكرياس في ECS الباردة قبل تشريح بدلا من ECS درجة حرارة الغ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 3 مقبض مشرط نمط | فيشربراند | 12-000-163 | |
| 1 م هيبس | فيشر Scientific | BP299-100 | عازلة HEPES ، محلول 1 متر |
| 10 سم طبق ثقافة غير معالج | كورنينج | 430591 | |
| 10 مل حقنة Luer-Lok | BD | 301029 | BD مع أطراف Luer-Lok |
| 27 جرام إبرة | BD | BD 305109 | BD الاستخدام العام والدقة Glide الإبر تحت الجلد |
| 35 مم غطاء زجاجي القاع طبق بتري | Ibidi | 81156 | & micro ؛ طبق 35 مم ، حقنة |
| عالية 50 مل | BD | 309653 | |
| غطاء 8 غرف بئر | Ibidi | 80826 | & micro ؛ -Slide 8 Well |
| APC المضادة للفأر CD8a الجسم المضاد | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher 199898 | ||
| كلوريد الكالسيوم | Sigma | C5670 | CaCl 2< / sub> |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | Sigma | C7902 | CaCl 2< / sub> (ثنائي هيدرات) |
| الروك الرقمي | المضغوط Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Leica | SP8 | الثقب &thinsp ؛ = 1.5-2 وحدات جيدة التهوية ؛ تم الحصول عليها بفتحة عددية 10x / 0.40 HC PL APO CS2 جافة و 20x / 0.75 فتحة عددية HC PL APO CS2 أهداف جافة عند 512 & thinsp ؛ & مرات; دقة 512 بكسل |
| D- (+) - الجلوكوز | سيجما | G7021 | C6< / sub>H12< / sub>O6< / sub> |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | ثنائي ميثيل سلفوكسيد |
| مختبرات | الإيثانول | ديكون 2805 | |
| طبق ثقافة الأنسجة Falcon 35 مم | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Tالأطباق |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather رقم 10 علوم المجهر الإلكتروني للشفرة الجراحية | 7204410 | ||
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | 2 + < / sup> مؤشر |
| في الهلام Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Fallps | أدوات العلوم الدقيقة | 11049-10 | |
| أدوات العلوم الدقيقة المقوى | 14090-09 | ||
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks محلول الملح المتوازن |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8< / sub>H18< / sub>N2< / sub>O4< / sub>S |
| دلو الثلج | فيشربراند | 03-395-150 | |
| إيزوفلوران | باترسون البيطري | NDC 14043-704-05 | |
| جونز هوبكنز بولدوج المشبك | روبوز المتجر الجراحي | RS-7440 | ؛ مستقيم; 500-900 غرام الضغط ؛ 1.5 "طول |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science & Trade; Kimwipes™ مساحات المهام الحساسة ، 2-Ply |
| LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | تحتوي هذه المجموعة على صبغة الخلايا الحية calcein-AM. |
| منخفض الجلوكوز DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | Sigma | M9272 | MgCl2< / sub> (سداسي هيدرات) |
| كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات | Sigma | M2773 | MgSO4< / sub> (سباعي الهيدرات) منصة |
| مغناطيسية ساخنة | Warner Instruments | PM-1 | منصة لغرفة التصوير للتحفيز الديناميكي تسجيلات |
| الميكروويف | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene حقنة مرشح | ثيرمو فيشر العلمي | 726-2520 | |
| رقم 4 فرشاة الرسم | مايكلز | 10269140 | |
| غرفة تصوير حمام الماس المفتوحة | Warner | Instruments RC-26 | غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي |
| أوريغون جرين 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | مؤشر Ca 2 + < / sup> |
| منفذ خلية غرفة التصوير بين عشية وضحاها | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | لصنع agarose لتوليد شريحة |
| من الأنسولين الرباعي المسمى PE | Emory Tetramer Research | التسلسل الأساسي YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Sigma | P5405 | KCl |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Sigma | P5655 | KH2< / sub>PO4< / sub> |
| شفرات الحلاقة | علوم المجهر الإلكتروني | 71998 | للاهتزاز ؛ الفولاذ المقاوم للصدأ ذو الحواف المزدوجة ، غير المطلي |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque نقطة انصهار منخفضة الاغاروز | Lonza | 50101 | لصنع agarose لتوليد الشرائح |
| مرساة الشريحة | Warner Instruments | 64-1421 | |
| مرساة الشريحة (التصوير الديناميكي) | Warner Instruments | 640253 | مرساة الشريحة لغرفة |
| التصوير الديناميكيبيكربونات الصوديوم | Sigma | S5761 | NaHCO3< / sub> |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S5886 | كلوريد الصوديوم |
| فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات | Sigma | S9638 | NaH 2< / sub>PO4 < / sub> (monohydrate) مثبط |
| التربسين فول الصويا | Sigma | T6522-1G | مثبط التربسين من Glycine max (فول الصويا) |
| المرحلة محول | Warner Instruments | SA-20MW-AL | لتناسب غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي على مرحلة المجهر |
| حاضنة المسرح | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | بقعة الحمض النووي الأزرق الفلورسنت |
| نقل Pipet | Falcon | 357575 | فالكون & تجارة; نظام التحكم في صمام ماصات النقل البلاستيكية القابل للتصرف |
| نظام Warner Instruments | VCS-8 | لتسجيلات التحفيز الديناميكي | |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| حمام مائي | فيشر FSGPD02 علمي | فيشربراند Isotemp حمام مائي فاخر للأغراض العامة GPD 02 |
المراجع
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
