Method Article

مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظات: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا (201808642). تم الحصول على أقسام البنكرياس البشري من المتبرعين بالأنسجة من كلا الجنسين عن طريق شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD) بنك الأنسجة، جامعة فلوريدا. تم حصاد pancreata الإنسان من المتبرعين بالأعضاء الجثث من قبل منظمات شراء الأعضاء المعتمدة الشراكة مع nPOD وفقا لقوانين وأنظمة التبرع بالأعضاء وتصنيفها على أنها "مواضيع غير بشرية" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فلوريدا (IRB No. 392-2008) ، مع التنازل عن الحاجة إلى الموافقة. تمت الموافقة على أنسجة nPOD المستخدمة خصيصا لهذا المشروع على أنها غير بشرية من قبل جامعة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول سوف تسفر شرائح أنسجة البنكرياس الحية مناسبة لكل من الدراسات وظائف وتسجيلات الخلايا المناعية. تظهر شريحة المظهر في كل من brightfield وتحت الضوء المنعكس في الشكل 1A، B. كما نوقش، يمكن العثور على الجزر في شرائح باستخدام الضوء المنعكس بسبب زيادة الحبيبية التي تحدث بسبب محتواها من الأنسولين (الشكل 1C) ويلاحظ بوضوح بالمقارنة مع أنسجة الخلفية عند استخدام الضوء المنعكس. وينبغي تقييم الجدوى بعد توليد الشرائح، ولا ينبغي تسجيل الجزر إذا كان .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التجربة الموصوفة. ومن الضروري العمل بسرعة. وينبغي تقليل طول الفترة الزمنية بين حقن البنكرياس وتوليد شرائح على الهزاز للحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما يتم تحسين الجدوى عن طريق الحفاظ على البنكرياس في ECS الباردة قبل تشريح بدلا من ECS درجة حرارة الغ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
# 3 مقبض مشرط نمطفيشربراند12-000-163
1 م هيبسفيشر ScientificBP299-100عازلة HEPES ، محلول 1 متر
10 سم طبق ثقافة غير معالجكورنينج430591
10 مل حقنة Luer-LokBD301029BD مع أطراف Luer-Lok
27 جرام إبرةBDBD 305109BD الاستخدام العام والدقة Glide الإبر تحت الجلد
35 مم غطاء زجاجي القاع طبق بتريIbidi81156& micro ؛ طبق 35 مم ، حقنة
عالية 50 ملBD309653
غطاء 8 غرف بئرIbidi80826& micro ؛ -Slide 8 Well
APC المضادة للفأر CD8a الجسم المضادBiolegend100712
BSAFisher 199898
كلوريد الكالسيومSigmaC5670CaCl 2< / sub>
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتSigmaC7902CaCl 2< / sub> (ثنائي هيدرات)
الروك الرقميالمضغوط Thermo Fisher Scientific88880020
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeicaSP8الثقب &thinsp ؛ = 1.5-2 وحدات جيدة التهوية ؛ تم الحصول عليها بفتحة عددية 10x / 0.40 HC PL APO CS2 جافة و 20x / 0.75 فتحة عددية HC PL APO CS2 أهداف جافة عند 512 & thinsp ؛ & مرات;   دقة 512 بكسل
D- (+) - الجلوكوزسيجماG7021C6< / sub>H12< / sub>O6< / sub>
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345ثنائي ميثيل سلفوكسيد
مختبراتالإيثانولديكون 2805
طبق ثقافة الأنسجة Falcon 35 ممCorning353001Falcon Easy-Grip Tissue Culture Tالأطباق
FBSGibco10082147
Feather رقم 10 علوم المجهر الإلكتروني للشفرة الجراحية7204410
fluo-4-AMInvitrogenF142012 + < / sup> مؤشر
في الهلام Super GlueLoctite45198
Graefe Fallpsأدوات العلوم الدقيقة11049-10
أدوات العلوم الدقيقة المقوى14090-09
HBSSGibco14025092Hanks محلول الملح المتوازن
HEPESSigmaH4034C8< / sub>H18< / sub>N2< / sub>O4< / sub>S
دلو الثلجفيشربراند03-395-150
إيزوفلورانباترسون البيطريNDC 14043-704-05
جونز هوبكنز بولدوج المشبكروبوز المتجر الجراحيRS-7440  ؛ مستقيم; 500-900 غرام الضغط ؛ 1.5 "طول
KimwipesKimberly-Clark Professional34705Kimtech Science & Trade; Kimwipes™ مساحات المهام الحساسة ، 2-Ply
LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity KitInvitrogenL3224تحتوي هذه المجموعة على صبغة الخلايا الحية calcein-AM.
منخفض الجلوكوز DMEMCorning10-014-CV
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigmaM9272MgCl2< / sub> (سداسي هيدرات)
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتSigmaM2773MgSO4< / sub> (سباعي الهيدرات) منصة
مغناطيسية ساخنةWarner InstrumentsPM-1منصة لغرفة التصوير للتحفيز الديناميكي تسجيلات
الميكروويفGEJES1460DSWW
Nalgene حقنة مرشحثيرمو فيشر العلمي726-2520
رقم 4 فرشاة الرسممايكلز10269140
غرفة تصوير حمام الماس المفتوحةWarnerInstruments RC-26غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي
أوريغون جرين 488 BAPTA-1-AMInvitrogenO6807مؤشر Ca 2 + < / sup>
منفذ خلية غرفة التصوير بين عشية وضحاهاOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050لصنع agarose لتوليد شريحة
من الأنسولين الرباعي المسمى PEEmory Tetramer Researchالتسلسل الأساسي YAIENYLEL
Penicillin StreptomycinGibco15140122
كلوريد البوتاسيومSigmaP5405KCl
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةSigmaP5655KH2< / sub>PO4< / sub>
شفرات الحلاقةعلوم المجهر الإلكتروني71998للاهتزاز ؛ الفولاذ المقاوم للصدأ ذو الحواف المزدوجة ، غير المطلي
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque نقطة انصهار منخفضة الاغاروزLonza50101لصنع agarose لتوليد الشرائح
مرساة الشريحةWarner Instruments64-1421
مرساة الشريحة (التصوير الديناميكي)Warner Instruments640253مرساة الشريحة لغرفة
التصوير الديناميكيبيكربونات الصوديومSigmaS5761NaHCO3< / sub>
كلوريد الصوديومSigmaS5886كلوريد الصوديوم
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدراتSigmaS9638NaH 2< / sub>PO4 < / sub> (monohydrate) مثبط
التربسين فول الصوياSigmaT6522-1Gمثبط التربسين من Glycine max (فول الصويا)
المرحلة محولWarner InstrumentsSA-20MW-ALلتناسب غرفة التصوير لتسجيلات التحفيز الديناميكي على مرحلة المجهر
حاضنة المسرحOkolabH201
StereoscopeLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell StainInvitrogenS34857بقعة الحمض النووي الأزرق الفلورسنت
نقل PipetFalcon357575فالكون & تجارة; نظام التحكم في صمام ماصات النقل البلاستيكية القابل للتصرف
نظام Warner InstrumentsVCS-8لتسجيلات التحفيز الديناميكي
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
حمام مائيفيشر FSGPD02 علميفيشربراند Isotemp حمام مائي فاخر للأغراض العامة GPD 02
العلمي Ca التحكم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pancreatic Tissue SlicesIslet FunctionIslet Immune InteractionsConfocal MicroscopyTime Lapse MicroscopyImmune Cell StainingVibratome SlicingType 1 DiabetesInsulin Tetramer StainingCD8 Antibody Detection

Related Articles