مقالة منهجية

التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة من نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

DOI:

10.3791/62219

⸱

يوليو 10, 2021

 ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يصف البروتوكول كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي تربى في نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. أيضا ، يمكن أن تشمل الجسم المضاد الثالث من مضيف مختلف في هذا البروتوكول. يمكن إجراء هذا النهج في أي نوع من الخلايا ومسببات الأمراض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الوقت الحاضر ، من الممكن العثور على مجموعة واسعة من الأدوات الجزيئية المتاحة لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة الطفيلية. ومع ذلك ، توجد بعض القيود للحصول على أجسام مضادة تجارية وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة تتعرف على هياكل وبروتينات خلايا محددة في الطفيليات. إلى جانب ذلك ، هناك عدد قليل من الأجسام المضادة التجارية المتاحة لتسمية المثقبيات. عادة ، يتم تحضير الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد الطفيليات في المنزل ويمكن أن يكون من الصعب استخدامها مع الأجسام المضادة الأخرى المنتجة في نفس النوع. هنا ، يوضح البروتوكول كيفية استخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة وأحادية النسيلة التي تربى في نفس النوع لإجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض. لتحقيق التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات ، من الأهمية بمكان احتضان الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر أولا ثم اتباع الحضانة مع الجسم المضاد للفأر الثانوي IgG المقترن بأي فلوروكروم. بعد ذلك ، من الضروري اتخاذ خطوة حظر إضافية لمنع أي أثر للجسم المضاد الأساسي من التعرف عليه بواسطة الجسم المضاد الثانوي التالي. بعد ذلك ، تتم إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر وجسمه المضاد الثانوي من الفئة الفرعية IgG المقترن بفلوروكروم مختلف إلى العينة في الأوقات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن إجراء التألق المناعي الثلاثي لوضع العلامات باستخدام جسم مضاد ثالث يثار في نوع مختلف. أيضا ، يمكن تلطيخ هياكل مثل النوى والأكتين لاحقا بمركباتها أو ملصقاتها المحددة. وبالتالي ، يمكن تعديل هذه الأساليب المعروضة هنا لأي خلية تكون مصادرها من الأجسام المضادة الأولية محدودة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة تفاعل العامل الممرض مع الخلية المضيفة على المستوى الخلوي يوفر معلومات أساسية عن الأسباب الكامنة وراء المرض لأن مجموعات مختلفة ، مثل الفيروسات والبكتيريا والبروتوزوا ، يمكن أن تصيب معظم أنواع الخلايا المضيفة 1،2،3،4. يمكن أن يساعد أيضا في تطوير وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة التي يمكن أن تبطئ أو تمنع نمو العامل الممرض. في الظروف الحية، تكون الأجسام المضادة المنتجة مسؤولة عن التعرف على المكونات الذاتية، والمستضدات من الفيروسات، والمكونات أو المنتجات البكتيرية، والفطريات، والطفيليات، وغيرها5.

لهذا الغرض ، تستخدم الأجسام المضادة على نطاق واسع ، وذلك أساسا لفهم موقع ووظيفة الهياكل الخلوية والبروتينات. تظهر العديد من الدراسات التي تستخدم علامات متعددة للأجسام المضادة أن خطوات الحجب الإضافية تساهم في خصوصية تحديد الموقع المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الموصوفة أجساما مضادة تجارية وحيدة النسيلة محددة ، بما في ذلك الأجسام المضادة من نفس النوع المضيف6،7،8،9،10،11،12،13،14.

عادة ، يستخدم التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات جسمين مضادين تم تربيتهما في أنواع مختلفة لتلطيخ هياكل الخلايا ذات الأهمية أو مسببات الأمراض والخلايا المضيفة لرؤية التفاعل بينهما. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا مشكلة عندما لا تتوفر أجسام مضادة تجارية أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة ببعض مسببات الأمراض لإجراء وضع العلامات المزدوجة. أيضا ، هناك مجموعات اقتران الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ، ومن الممكن إقران الأجسام المضادة الأولية مباشرة بالفلوروفور عن طريق تفاعل إستر سكسينيميديل15. المشكلة هي أن هذه المجموعات غالبا ما تكون باهظة الثمن ، ومن الضروري أن يكون لديك ما يكفي من الأجسام المضادة لتصنيفها. مع العلم بذلك ، نجحنا في تطوير طريقة التألق المناعي المزدوج باستخدام جسمين مضادين مختلفين تم تربيتهما في نفس النوع لدراسة توطين البروتين في Trypanosoma brucei16. ومع ذلك ، بالنسبة للطفيليات داخل الخلايا ، بما في ذلك Trypanosoma cruzi ، لم يتم إثبات هذا النهج. هنا ، نوضح كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة طفيليات T. cruzi داخل الخلايا والخلية المضيفة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في نفس النوع دون تفاعلات متقاطعة. إلى جانب هذه الطريقة ، تم إنشاء علامة التألق المناعي الثلاثي مع إضافة الجسم المضاد الثالث من نوع مختلف. تساعد هذه الأساليب عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا ويمكن استخدامه في أي نوع من الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مزارع الخلايا والطفيليات

  1. قم بزراعة خلايا LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (CCL-7) في قارورة زراعة خلايا 25 سم 2 تحتوي على وسط RPMI مكملة ب 10٪ FBS المعطل للحرارة (مصل الجنين البقري) والمضادات الحيوية (100 U / mL Penicillin و 100 μg / mL Streptomycin) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 17.
  2. إصابة خلايا LLC-MK2 بالمثقبيات الكروزية (سلالة Y) وفقا للبروتوكول السابق 18.
  3. اجمع المادة الفائقة من الخلايا المصابة LLC-MK2 (5 مل) في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق و 22 درجة مئوية لخفض حطام الخلايا. حافظ على الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح للتريبوماستيجوت بالسباحة إلى السوبرناتانت.
  4. اجمع المادة الفائقة في أنبوب مخروطي جديد وجهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات التي تحتوي على الطفيليات في وسط RPMI كامل لتحديد كثافة الخلية عن طريق عد الخلايا في غرفة Neubauer.

2. بروتوكول التحكم في التألق المناعي

ملاحظة: بمجرد إصلاحها ، من الممكن تخزين الألواح التي تحتوي على أغطية عند 4 درجات مئوية في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة أسبوع واحد. ليتم تخزينها ، من المهم ألا تمر الخلايا بخطوة النفاذية.

  1. قم بتسوية خلايا LLC-MK2 (2 × 104) في 24 لوحة بئر تحتوي على أغطية مستديرة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية في وسائط RPMI لمدة 16 ساعة.
  2. بالنسبة للخلايا المصابة، أضف مادة فائقة تحتوي على T. cruzi (البند 1.4) إلى كل بئر بالتناسب (MOI 10: 1) واتركها لمدة 6 ساعات من العدوى. اغسل الأغطية التي تحتوي على خلايا مصابة وغير مصابة خمس مرات بمحلول PBS ومثبتة ب 2٪ من البارافورمالدهيد في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2).
  4. قم باختراق الأغطية بنسبة 0.2٪ IGEPAL CA-630 في 1x PBS (PH 7.2) لمدة 10 دقائق في RT.
  5. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  6. احتضان الأغطية لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام محلول الحجب (2٪ BSA في 1x PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2).
  7. احتضان coverslips لمدة 30 دقيقة في RT إما مع الفئران وحيدة النسيلة المضادة hnRNPA1 (التخفيف 1:200) أو مع الفئران متعددة النسيلة المضادة TcFAZ (التخفيف 1:100) المخففة في محلول الحجب.
  8. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  9. احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة في RT مع الماعز المضاد للفأر IgG F (ab') 2 (H + L) المقترن ب Alexa Fluor 488 (1:600) مع phalloidin المقترن ب Alexa 594 (1:300) لتلطيخ خيوط الأكتين (F-actin) في الخلية المضيفة المخففة في محلول الحظر.
  10. يغسل ثلاث مرات مع 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. ضع كمية صغيرة من كاشف التثبيت المضاد للتلاشي ProLong Gold مع وسط DAPI على سطح الشريحة.
  12. باستخدام الملقط، قم بإمالة زلة الغطاء برفق في وسط التركيب لمنع تشكل الفقاعات. بمجرد أن تجف ، أغلق الغطاء إذا رغبت في ذلك.

3. بروتوكول التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومتعددة النسيلة التي أثيرت في نفس المضيف

  1. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.6 الموضحة أعلاه.
  2. احتضان الأغطية التي تحتوي على خلايا مصابة وغير مصابة مع الأجسام المضادة متعددة النسيلة للفئران الداخلية المضادة ل TcFAZ (1:100) المخففة في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  4. احتضان الأغطية لمدة 30 دقيقة في RT مع الماعز المضاد للفأر IgG F (ab') 2 (H + L) المقترن ب Alexa Fluor 647 (1:600) المخفف في محلول الحظر.
  5. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  6. قم بتنفيذ خطوة الحجب الثانية باستخدام AffiniPure Rabbit المضاد للفأر IgG (H + L) المخفف (0.12 مجم / مل) في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في RT.
  7. اغسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منها. ثم احتضن مع الفأر وحيد النسيلة المضادة hnRNP A1 IgG2b الجسم المضاد (1:200) لمدة 30 دقيقة في RT.
  8. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  9. احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع الجسم المضاد للماعز المضاد للفأر IgG2b المقترن ب Alexa Fluor 488 (1:600) ومع phalloidin المقترن ب Alexa 594 (1:300) المخفف في محلول الحظر.
  10. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  11. كرر الخطوات من 2.8 إلى 2.10 الموضحة أعلاه.

4. بروتوكول التألق المناعي الثلاثي مع إضافة الجسم المضاد الثالث متعدد النسيلة من الأنواع المضيفة المختلفة

ملاحظة: للحصول على العلامات الإضافية ، لاحظ الفئات الفرعية IgG ، والأنماط المتساوية للأجسام المضادة ، واتبع ترتيب الأجسام المضادة: 1. الفأر متعدد النسيلة ، 2. الأرنب متعدد النسيلة ، 3. الكتلة الثانية ، و 4. الفأر أحادي النسيلة. ضع في اعتبارك نوع الليزر المتاح في المجهر البؤري لاختيار الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الفلوروفور الصحيح.

  1. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.6 الموضحة أعلاه.
  2. بعد الخطوات من 3.2 إلى 3.5 (خطوة الغسيل) ، ابدأ حضانة جديدة باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. اغسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منها.
  4. احتضان coverslips مع الماعز المضادة للأرانب IgG المقترنة ب Alexa 647 (1:600) في محلول منع لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  6. قم بإجراء خطوة حظر باستخدام AffiniPure rabbit المضاد للفأر IgG (H + L) المخفف (0.12 مجم / مل) في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في RT.
  7. اغسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منها واحتضنها بأي جسم مضاد أحادي النسيلة من الفئة الفرعية IgG مخفف في محلول مانع لمدة 30 دقيقة.
  8. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
  9. احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع زوج معين من الأجسام المضادة من فئة الماعز المضادة للفأر IgG المقترنة ب Alexa 594 (1:600) في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة.
  10. اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.

5. اكتساب التصوير البؤري

  1. تحليل عينات التألق المناعي باستخدام المجهر البؤري ، مع هدف غمر الزيت 63X والكشف عن التألق باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) وكاشف هجين (HyD).
    ملاحظة: استخدمنا الإعداد من مختبر متعدد المستخدمين للمجهر البؤري - LMMC ، كلية طب ريبيراو بريتو ، جامعة ساو باولو.
  2. احصل على جميع الصور البؤرية ذات القنوات المنفصلة. قم بإجراء معالجة الصور باستخدام Adobe Photoshop.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نعرض كيفية دراسة التفاعلات بين الطفيليات المضيفة عن طريق التألق المناعي عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا بسبب عدم توفر الأجسام المضادة التجارية التي تتعرف على هياكل وبروتينات محددة في المثقبيات.

من بين المثقبيات ، لدى T. cruzi واحدة من أكثر دورات الحياة تعقيدا التي تنطوي على مراحل تطور مختلفة بين الفقاريات واللافقاريات المضيفة 19. خلال دورة حياة T. cruzi ، في مرحلة مبكرة من عدوى الثدييات ، تغزو trypomastigotes metacyclic الخلايا من خلال عمل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء وضع العلامات المناعية المزدوجة في الخلايا المصابة بالمجربة الكروزية باستخدام جسمين مضادين مختلفين من نفس النوع المضيف. لدراسة ، بمزيد من التفصيل ، الآثار المترتبة على العدوى ، يمكن تسمية الهياكل في الخلية المضيفة مثل النواة أو العضيات الخلوية باستخدام هذا البروتوكول. أيضا ، يمكن استخدامه في طريقة وضع العلامات المناعية للقسم الرقيق بعد التضمين. يساعد هذا النهج على التغلب على عقبة وجود عدد قليل من الأجسام المضادة المتاحة لدراسة المثقبيات والطفيليات الأخرى.

با...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة أو مالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة أمبارو في ولاية ساو باولو (FAPESP 2010/19547-1؛ 2018/03677-5) إلى MMAB، ومن مؤسسة Apoio ao Ensino، ومن Pesquisa e Assistência- FAEPA إلى MMAB، ومن قبل منسقة العلاقات العامة في نيفيل سوبيريور - البرازيل (CAPES) - الرمز المالي 001. حصلت CG-C على زمالة الماجستير والدكتوراه من CAPES وحصلت LAMT-S على زمالة الدكتوراه من CNPq. نشكر إليزابيتي ر. ميلاني على المساعدة في الفحص المجهري البؤري والدكتور داريو زامبوني على توفير خلايا LLC-MK2 (كلية ريبيراو بريتو الطبية ، USP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 488 - IgG2b الأجسام المضادةتقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةA21141الماعز المضاد للفأر
AffiniPure Rabbit المضاد للفأر IgG (H + L) JacksonImmunoresearch ، الولايات المتحدة الأمريكية315-005-003الأجسام المضادة للفأر
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab') 2 (H + L) تقنيات الأجسام المضادةالحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةA11017الماعز المضاد للفأر
Alexa Fluor 594 IgG1 الأجسام المضادةتقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةA21125الماعز المضاد للفأر
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab') 2 (H + L)الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةA21237الماعز المضاد للفأر
المضاد للجسم المضاد hnRNPA1 IgG2bسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةR4528الجسم المضاد للفأر
المضاد ل TcFAZ (بروتين T. cruzi FAZ) الأجسام المضادةمختبرناالأجسام المضادة للفأر
الألبومين المصل البقري (BSA)سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةA2153-10Gمنظف بروتين الألبومين
Igepal CA-630Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةI3021منظف غير أيوني
مصل بقري للجنين (FBS)Gibco ، ثيرمو فيشر علمي ، الولايات المتحدة الأمريكية12657-029مصل
البنسلين ستربتومايسينجيبكو ، ثيرمو فيشر علمي ، الولايات المتحدة الأمريكية15140-122المضاد الحيوي
الفالودين أليكسا فلور 594تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةA12381علامة أكتين
ProLong Gold Antifade مع تقنيات DAPILife ، الولايات المتحدة الأمريكيةP36935كاشف وسائط التركيب
RPMI 1640 1X مع L-glutamineCorning ، الولايات المتحدة الأمريكية10-040-CVوسائط زراعة الخلايا
محلول Trypsin-EDTASigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةT4049-100MLكاشف حيوي
تقنيات في

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243(2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47(1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Trypanosoma Cruzi DAPI

مقالات ذات صلة