Method Article

تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر تقنيات تسلسل الجيل التالي القوية تحليلا قويا وشاملا للتحقيق في كيفية عمل الشبكات التنظيمية لجينات الشبكية أثناء التطور وفي الحالات المرضية. يسمح لنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتحديد ملامح شاملة لتغيرات التعبير الجيني التي لوحظت في تطور الشبكية والمرض على المستوى الخلوي ، في حين يسمح ATAC-Seq أحادي الخلية بتحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وربط عامل النسخ ليتم توصيفه بدقة مماثلة. هنا يتم وصف استخدام هذه التقنيات في شبكية العين النامية ، ويتم توضيح MULTI-Seq ، حيث يتم تصنيف العينات الفردية بمركب أوليغونوكليوتيد دهني معدل ، مما يمكن الباحثين من زيادة نطاق التجارب الفردية وتقليل التكاليف بشكل كبير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب فهم كيف يمكن للجينات التأثير على مصير الخلية دورا رئيسيا في استجواب العمليات مثل المرض والتطور الجنيني. يمكن تجميع العلاقات المعقدة بين عوامل النسخ والجينات المستهدفة في شبكات تنظيم الجينات. تضع الأدلة المتزايدة هذه الشبكات التنظيمية الجينية في مركز كل من المرض والتطور عبر السلالات التطورية1. في حين أن التقنيات السابقة مثل qRT-PCR ركزت على جين واحد أو مجموعة من الجينات ، فإن تطبيق تقنية التسلسل عالية الإنتاجية يسمح بتنميط النسخ الخلوي الكامل.

يقدم RNA-seq لمحة عن النسخ على نطاق واسع 2,3. يمنح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الباحثين القدرة ليس فقط على تحديد خصائص النسخ ولكن أيضا ربط أنواع معينة من الخلايا بملفات تعريف التعبير الجيني4. يتم تحقيق ذلك من الناحية المعلوماتية الحيوية عن طريق تغذية ملفات تعريف الخلايا الفردية في خوارزميات الفرز باستخدام علامات الجينات المعروفة5. يوفر الإرسال المتعدد باستخدام تسلسل المؤشرات الموسومة بالدهون (MULTI-seq) تنوعا غير مسبوق في عدد ملفات تعريف scRNA-Seq التي يمكن جمعها6. تختلف هذه التقنية القائمة على الدهون عن تقنيات فهرسة العينات الأخرى مثل تجزئة الخلايا التي تعتمد على وجود مستضدات سطحية وأجسام مضادة عالية التقارب بدلا من تكامل غشاء البلازما7. ليس فقط من الممكن الآن تحديد ملامح التعبير الجيني في أنواع الخلايا ولكن يمكن دمج تجارب مختلفة في مكتبة تسلسل واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة تجربة scRNA-seq الفردية6. قد تبدو تكلفة scRNA-seq باهظة للاستخدام في تجارب التنميط الظاهري حيث يتم تحليل العديد من الأنماط الجينية أو الظروف أو عينات المرضى المختلفة ، ولكن تعدد الإرسال يسمح بالجمع بين ما يصل إلى 96 عينة في مكتبة واحدة6.

لم يكن تنميط التعبير الجيني عبر scRNA-seq هو التقنية الوحيدة القائمة على التسلسل عالي الإنتاجية لإحداث ثورة في الفهم الحالي لكيفية إملاء الآليات الجزيئية مصير الخلية. في حين أن فهم النصوص الجينية الموجودة في الخلية يمكن من تحديد نوع الخلية ، إلا أنه من المهم بنفس القدر فهم كيفية تنظيم الجينوم الذي ينظم التطور وتطور المرض. اعتمدت الدراسات المبكرة على الكشف عن الانقسام بوساطة الحمض النووي للتسلسلات غير المرتبطة بالهيستونات، تليها تسلسل شظايا الحمض النووي الناتجة لتحديد مناطق الكروماتين المفتوح. وعلى النقيض من ذلك، فإن فحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من قبل الترانسبوزون (scATAC-seq) يسمح للباحثين بفحص الحمض النووي باستخدام ترانسبوزون مستأنس لتحديد ملامح الكروماتين المفتوح بسهولة على مستوى النيوكليوتيد الواحد8. وقد مر هذا من خلال تحجيم مماثل ل scRNA-seq والآن يمكن للباحثين تحديد أنواع الخلايا الفردية والأنماط الظاهرية الشخصية عبر الآلاف من الجينومات الفردية8.

وقد سمح الاقتران بين scRNA-seq و scATAC-seq للباحثين بالقدرة على تحديد ملامح الآلاف من الخلايا لتحديد مجموعات الخلايا والتنظيم الجيني والشبكات التنظيمية الجينية في نماذج الأمراض والعمليات التنموية9،10،11،12. هنا يحدد المؤلفون كيفية استخدام MULTI-seq لأول مرة لتكثيف التنميط الظاهري لعدد لا يحصى من النماذج الحيوانية واستخدام scRNA-seq و scATAC-seq المقترنين للحصول على فهم أفضل لمشهد الكروماتين والشبكات التنظيمية في هذه النماذج الحيوانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الحيوانات في هذه الدراسات باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوانات ، وفقا لإرشادات REACH ، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.

1. متعدد المقاييس

  1. الإعداد الإعلامي
    1. تحضير وموازنة مثبط البويضات ، 10 ملغ من مثبط البويضات و 10 ملغ من الألبومين لكل مل من محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) ، لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام13. التوازن مع 95٪ O 2: 5٪ CO2 في حاضنة.
      1. تحضير محلول التفكك غراء ، 20 وحدة / مل غراء و 0.005 ٪ DNase في EBSS ، خلال خطوة الحضانة هذه13.
        ملاحظة: قارورة واحدة من محلول DNase ستكون كافية ل 5 عينات. قد تحتاج قوارير إضافية إلى إعادة تشكيلها في حالة إجراء MULTI-seq على أكثر من 5 عينات.
    2. إعداد حلول الترميز الباركود أوليغو المعدلة الدهون.
      1. قم بإجراء تخفيف فريد للباركود لكل عينة من خلال الجمع بين 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون الباركود 100 ميكرومتر مع 4.5 ميكرولتر من محلول ملحي مخزنة مؤقتا بالفوسفات (PBS).
      2. لإعداد محلول المرساة: الباركود بنسبة مولية 1: 1 ، اجمع 4.4 ميكرولتر من تخفيف الباركود 10 ميكرومتر ، و 0.9 ميكرولتر من محلول مرساة 50 ميكرومتر ، و 16.7 ميكرولتر من PBS وضعه على الجليد. يجب أن يكون التركيز النهائي لكل من خيوط الباركود وخيوط المرساة 2 ميكرومتر.
      3. لإعداد محلول الإرساء المشترك ، اجمع بين 0.88 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك 50 ميكرومتر و 21.12 ميكرولتر من PBS وضعه على الجليد. يجب أن يكون التركيز النهائي للمرساة المشتركة 2 ميكرومتر.
    3. لجعل 1٪ BSA في PBS ، قم بإذابة 0.1 غرام من ألبومين مصل البقر (BSA) في 10 مل من PBS وضعه على الجليد.
    4. لصنع PBS مع مثبط RNase ، اجمع 2.5 ميكرولتر من مثبط 40 U / μL RNase مع 197.5 ميكرولتر من PBS وخزنه على الجليد. اضرب وحدات التخزين في هذه الخطوة في 1.1x عدد العينات.
  2. تفكك العينة
    1. القتل الرحيم للحيوانات من خلال خلع عنق الرحم و / أو اختناق CO2 وفقا لمتطلبات IACUC المؤسسية. تعتمد طريقة القتل الرحيم على المتطلبات المؤسسية ونموذج الكائن الحي المستخدم.
    2. تشريح شبكية العين من كلتا العينين في PBS الباردة تحت مجهر تشريح ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل باستخدام ماصة نقل.
    3. انقل 500 ميكرولتر من محلول غراء إلى أنبوب 1.5 مل لكل عينة.
    4. ضع عينات في محلول غراء وقم بتغطية الأنابيب على الفور.
    5. احتضان الأنابيب التي تحتوي على العينات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة. عكس القوارير 3 مرات كل 10 دقائق. يجب أن تنفصل العينات تدريجيا مع كل جولة من الانقلابات.
    6. أعد القوارير إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتقطيع كل عينة 3-4 مرات باستخدام ماصة 1 مل مضبوطة على 300 ميكرولتر.
    7. اسمح لأي قطع من الأنسجة غير المنفصلة المتبقية بعد التثليث أن تستقر.
    8. قم بإزالة تعليق الخلايا الغائم مع تجنب أي قطع من الأنسجة غير المنفصلة ووضع تعليق خلية كل عينة في أنبوب جديد معقم بمحلول لولبي بسعة 15 مل.
    9. جهاز الطرد المركزي يعلق الخلية عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    10. أثناء خطوة الطرد المركزي ، قم بإعداد وسائط إعادة تعليق الخلية.
      1. امزج 857 ميكرولتر من EBSS (قارورة 1) مع 95 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين والبويضات المعاد تشكيله في أنبوب معقم مغطى بالمسمار 1.5 مل. أضف 48 ميكرولتر من حل DNase المحفوظ من 1.1.1. اضرب وحدات التخزين في هذه الخطوة في 1.1x عدد العينات.
    11. تخلص من السوبرناتانت ، واحرص على الاحتفاظ بكريات الخلايا ، وأعد تعليق كريات الخلايا على الفور في محلول إعادة تعليق خلية 1 مل تم إعداده في الخطوة 1.2.10.
    12. إعداد تدرج الكثافة المتقطعة.
      1. لكل عينة، أضف 1.6 مل من محلول مثبط البويضات إلى أنبوب جديد معقم بغطاء لولبي بسعة 15 مل وقم بطبقة تعليق الخلية بعناية في الأعلى. يجب أن تكون الواجهة بين طبقتي التدرج مرئية ولكن بعض الخلط لا يؤثر على النتائج.
    13. جهاز طرد مركزي لتدرجات الكثافة المتقطعة عند 70 × g لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تضرب الخلايا المنفصلة في الجزء السفلي من الأنابيب بينما تبقى شظايا الغشاء في الواجهة.
    14. تخلص من السوبرناتانت وأضف 200 ميكرولتر من PBS لغسل الخلايا الحبيبية. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    15. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الخلايا في 180 ميكرولتر من PBS باستخدام مثبط RNase. مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.
  3. الترميز الشريطي للخلية
    1. أضف 20 ميكرولتر من محلول المرساة: الباركود إلى كل عينة وماصة بلطف للخلط. تأكد من أن كل عينة تتلقى مرساة فريدة من نوعها : حل الباركود واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
      1. قم بإعداد المواد اللازمة لتوليد حبة الجل في المستحلب (GEM) والترميز الشريطي خلال هذه الحضانة14.
    2. أضف 20 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك إلى كل عينة وماصة بلطف للخلط. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 1 مل من BSA المثلج بنسبة 1٪ في PBS إلى كل عينة وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية وإضافة 400 ميكرولتر الجليد البارد 1٪ BSA في PBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      1. كرر الخطوة 1.3.4 لما مجموعه 2 غسلة. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 400 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA في PBS.
    5. تحديد تركيز الخلايا لكل عينة باستخدام مقياس مفاصل.
      1. حدد العدد الإجمالي للخلايا المراد تحميلها لكل عينة. عادة ما يكون هذا هو العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة مقسوما على عدد العينات. ومع ذلك ، إذا فقدت نسخة بيولوجية لحالة واحدة ، يمكن تقسيم حصتها بين النسخ المتماثلة البيولوجية الأخرى من تلك الحالة.
      2. اقسم عدد الخلايا المطلوبة لكل عينة على تركيز خلية تلك العينة المحسوبة في الخطوة 3.5 لتحديد الحجم المطلوب لتحميل العدد المطلوب من الخلايا.
    6. اجمع الأحجام المحسوبة في الخطوة 3.5.2 من كل عينة في أنبوب طرد مركزي جديد معقم بسعة 1.5 مل. من الحكمة مضاعفة الحجم المأخوذ من كل عينة في حالة فشل توليد GEM.
      1. تحديد تركيز الخلايا "النهائي" للعينات المدمجة باستخدام مقياس الدم.
  4. توليد GEM والترميز الشريطي
    1. استخدم العينات المدمجة لإنشاء والباركود GEMs14.
  5. تنظيف ما بعد GEM-RT وتضخيم cDNA
    1. قم بإعداد مواد لتنظيف النسخ العكسي بعد GEM وتضخيم cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات التالية14. قم بإجراء تنظيف GEM-RT بعد ذلك حسب تحديد الحجم14.
      1. زيادة حجم 80 ٪ من الإيثانول المحضر بمقدار 2 مل.
      2. تحضير مزيج تضخيم cDNA على الجليد14. أضف 1 ميكرولتر من التمهيدي MULTI-seq 2.5 ميكرومتر إلى مزيج تضخيم cDNA. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 ثوان في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
    2. أداء تضخيم cDNA14. يمكن تخزين cDNA في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة في هذه المرحلة.
    3. قم بإجراء تنظيف cDNA حسب اختيار الحجم14. يمكن تخزين cDNA النسخ الداخلي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع في هذه المرحلة.
      1. لا تتخلص من supernatant من الجولة الأولى من اختيار الحجم . يحتوي هذا الكسر على نماذج الباركود. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 مل.
      2. تخزين supernatant على الجليد.
    4. دوامة لإعادة تعليق كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز شبه المغناطيسي وإضافة كاشف اختيار الحجم القائم على الخرزة البارامغناطيسية 260 ميكرولتر (النهائي 3.2x) و 180 ميكرولتر من 100٪ isopropanol (1.8x) إلى supernatant. ماصة المزيج 10 مرات وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    5. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يمسح الحل. ثم قم بإزالة وتجاهل supernatant.
    6. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الخرز واتركه لمدة 30 ثانية. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
      1. كرر ما مجموعه 2 غسل.
    7. لفترة وجيزة الطرد المركزي الخرز والعودة إلى الرف المغناطيسي. بدء تشغيل مؤقت لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P10 وجفف الخرز في الهواء على الرف المغناطيسي لبقية دقيقتين. لا تتجاوز 2 دقيقة.
    9. قم بإزالة الخرز من الحامل المغناطيسي وأعد تعليقه في مخزن مؤقت للإزالة 100 ميكرولتر (EB). ماصة تماما لإنعاش.
    10. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    11. ارجع إلى الرف المغناطيسي وانتظر حتى يتم مسح الحل.
    12. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    13. كرر الخطوات من 1.5.4 إلى 1.5.12. خفض حجم EB المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 1.5.9 إلى النصف.
    14. تحديد تركيز الحمض النووي الباركود وتوزيع الحجم باستخدام مجموعة فحص dsDNA عالية الحساسية ومقياس الفلورومتر ومحلل الشظايا15,16. يمكن تخزين الباركود cDNA في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع في هذه المرحلة.
  6. بناء مكتبة الباركود
    1. تحضير 1 مل من 80 ٪ من الإيثانول.
    2. قم بإعداد المزيج الرئيسي لمكتبة الباركود PCR في أنبوب شريط PCR معقم: اجمع بين 26.25 ميكرولتر من 2x مزيج جاهز لبدء تشغيل PCR الساخن ، و 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر Universal i5 التمهيدي ، و 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر RPI التمهيدي ، و 3.5 نانوغرام من الباركود cDNA (الحجم الذي يحدده التركيز من الخطوة 5.14) ، وما يكفي من الماء الخالي من النوكليز للوصول بالحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر.
      1. استخدم تمهيدي RPI فريدا لكل مكتبة باركود إذا تم تسلسل مكتبات MULTI-seq متعددة معا.
    3. إخضاع المزيج الرئيسي لمكتبة الباركود لإعداد مكتبة PCR: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 10 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ ثم عقد عند 4 درجات مئوية.
    4. دوامة لإعادة تعليق كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز البارامغناطيسي.
    5. قم بإزالة منتج PCR من جهاز التدوير الحراري وأضف 80 ميكرولتر (1.6x) من كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز البارامغناطيسي. ماصة بدقة.
    6. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع على فاصل المغناطيس في الموضع العالي وانتظر حتى يمسح الحل.
    7. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
    8. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الخرز واتركه لمدة 30 ثانية. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
      1. كرر الخطوة 1.6.8 لما مجموعه 2 غسلة.
    9. الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنبوب ووضعها على الفاصل المغناطيسي في الموضع المنخفض. بدء تشغيل مؤقت لمدة 2 دقيقة.
    10. قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P20 وجفف الخرز في الهواء على الفاصل المغناطيسي لبقية الدقيقتين. لا تتجاوز 2 دقيقة.
    11. قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. تخلط الماصة جيدا لإعادة تعليق الخرز.
    12. حضانة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    13. ارجع إلى الفاصل المغناطيسي في الموضع المنخفض وانتظر حتى يتم مسح الحل. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب شريط PCR جديد.
    14. تحديد تركيز مكتبة التعبير ومكتبة الباركود وتوزيع حجم الشظايا باستخدام مجموعة مقايسة adsDNA عالية الحساسية ومقياس الفلورومتر ومحلل الشظايا.
  7. 3' بناء مكتبة التعبير الجيني
    1. قم بإجراء بناء مكتبة التعبير الجيني 3 'وفقا لتعليمات الشركة المصنعة14.
  8. التسلسل
    1. بالإضافة إلى مكتبة cDNA الذاتية المنشأ التي تم تضخيمها في الخطوة 7، أرسل مكتبة الباركود المضخمة في الخطوة 6. من أجل البساطة ، أرسل هذه المكتبات بشكل منفصل ، أو كإجراء فعال من حيث التكلفة ، قم بتضمين اقتباس من عينة من مواد الترميز الشريطي مع مكتبة cDNA الذاتية. استهدف ما بين 20,000-50,000 cDNA و 3,000-5,000 قراءة الباركود لكل خلية.
    2. قم بتحويل ملفات bcl الناتجة عن التسلسل إلى ملفات fastq بواسطة cellranger mkfastq وعدد المصفوفات التي تم إنشاؤها من هذه بواسطة عدد cellranger.
    3. تقوم عينات Deconvolute بعد تحليل Cellranger باستخدام حزمة deMULTIplex r المتوفرة في مستودع GitHub MULTI-seq (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. المقترنة scRNA-seq و scATAC-seq

  1. تجميد فلاش الأنسجة ل scATAC-seq وتثبيت الميثانول من خلايا الشبكية ل scRNA-seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. لإعداد حلول لانفصال الشبكية، كرر الخطوتين 1.1.1 و 1.1.4.
      2. تحضير حمام الثلج الجاف الإيثانول في دلو ثلج صغير.
      3. تحضير 15 مل من الإيثانول 70٪ عن طريق إضافة 10.5 مل من الإيثانول إلى 4.5 مل من الماء الخالي من النوكلياز.
      4. أضف ما يكفي من الثلج الجاف إلى دلو الثلج (يفضل أن يكون في شكل حبيبات) بحيث يرتفع 15 مل من السائل لتغطية الجليد فقط. أضف 15 مل من الإيثانول.
      5. ضع PBS على الجليد و 1 مل من الميثانول 100٪ في فريزر مناسب -20 درجة مئوية.
    2. إعداد العينات
      1. اتبع الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 لعزل الشبكية. ومع ذلك ، هذه المرة وضع كل شبكية العين في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل.
      2. بالنسبة للعينات الموجهة إلى scATAC-seq ، قم بإزالة أي سائل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة P200 وقم على الفور بتغطية الأنبوب ووضعه في حمام ثلج جاف بالإيثانول لتجميد العينة.
      3. بالنسبة للعينات الموجهة إلى scRNA-seq ، لفصل الخلايا ، كرر الخطوات من 1.2.3 إلى 1.2.15 على شبكية العين المشوهة.
      4. جهاز طرد مركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      5. قم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية.
      6. أضف 1 مل من PBS المبرد وامزج الماصة بلطف 10 مرات أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
      7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
        1. كرر الخطوات من 2.1.2.5 إلى 2.1.2.7 لما مجموعه غسلتان.
      8. قم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية.
      9. أضف 100 ميكرولتر من PBS المبرد واخلط بلطف 10x أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
      10. ابدأ في دوامة الأنبوب بأقل إعداد للسرعة. أضف 900 ميكرولتر من الميثانول المبرد (-20 درجة مئوية) قطرة قطرة مع الاستمرار في دوامة الأنبوب بلطف لمنع الخلايا من التكتل.
      11. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.
      12. أوجد تركيز الخلايا الثابتة باستخدام مقياس الدم.
      13. تقييم فعالية خطوة التثبيت باستخدام التربان الأزرق. يشير جزء كبير من الخلايا القابلة للحياة إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من وقت التثبيت.
      14. تخزين الأنسجة المجمدة والخلايا الثابتة في -80 درجة مئوية.
  2. عزل النوى عن الأنسجة المجمدة الفلاش ل scATAC-seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف التحلل عن طريق الجمع بين 9.77 مل من الماء الخالي من النوكليز ، و 100 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 100 ميكرولتر من 1 M NaCl ، و 30 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 0.1 g من BSA.
      2. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف التحلل أمامك ، كما هو الحال في اليوم السابق ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. في يوم البروتوكول ، ضع على الجليد.
      3. توازن 20x نواة المخزن المؤقت التي تقدمها الشركة المصنعة لمجموعة scATAC من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
      4. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل 1x عن طريق احتضان محلول Digitonin بنسبة 5٪ في حمام مائي 65 درجة مئوية حتى يتم إذابة الراسب. ثم الجمع بين 2 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل ، 20 ميكرولتر من 10 ٪ Tween-20 ، 20 ميكرولتر من Nonidet P40 Replacement (قد يطلق عليه بدلا من ذلك IGEPAL) ، و 4 ميكرولتر من Digitonin.
      5. قم بتخزين مخزن التحلل المؤقت 1x على الجليد.
      6. لإعداد المخزن المؤقت للتحلل 0.1x ، اجمع 1.8 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1x وخزنه على الجليد.
      7. لتحضير المخزن المؤقت للغسيل، امزج بين 2 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل و20 ميكرولتر من 10٪ Tween-20 وخزنه على الجليد.
      8. لتحضير المخزن المؤقت للنوى المخففة، امزج 950 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى (20x) وخزنه على الجليد.
    2. عزل النوى
      1. لا تذوب العينة قبل التحلل. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد 0.1x للتحلل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على العينة المجمدة. تجانس على الفور 15x باستخدام مدقة بيليه.
      2. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. قم بإعداد المواد اللازمة لنقل scATAC خلال خطوة الحضانة17 هذه.
      3. تخلط الماصة 10x مع ماصة 1 مل وتحضن لمدة 10 دقائق على الجليد. الإعداد الكامل للمواد اللازمة لنقل scATAC خلال خطوة الحضانة هذه إذا لم تكن قد اكتملت بالفعل. من غير الضروري إعداد المزيد من النوى المخففة العازلة.
      4. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المبرد إلى الخلايا المحللة. مزيج ماصة 5x.
      5. مرر التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. تصفية ~ 300 ميكرولتر في المرة الواحدة باستخدام مصفاة خلية جديدة 70 ميكرومتر في كل مرة.
      6. مرر التدفق الذي تم جمعه من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وخزنه على الجليد.
      7. أوجد تركيز النوى باستخدام مقياس الدم. استنادا إلى تركيز النوى والحجم الكلي لتعليق الخلية ، احسب العدد الإجمالي للنوى المنفصلة.
      8. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant دون تعطيل حبيبات النوى.
      9. لإنشاء مخزون النوى استنادا إلى إجمالي عدد النوى المحدد في الخطوة 2.2.2.7.، أعد تعليق النوى في مخزن مؤقت للنوى المخففة بما يكفي للوصول إلى تركيز النوى المطلوب.
        ملاحظة: يعتمد تركيز النوى المطلوب على استرداد النوى المستهدفة لتجربة scATAC-seq ويتم تحديده من إرشادات تركيز النوى الموجودة في بروتوكول الشركة المصنعةرقم 17. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة في نهاية المطاف إلى 10,000 نواة، فإن تركيز النوى المطلوب لمخزون النوى يتراوح بين 3,080 و7,700 نواة/ميكرولتر. قد يكون من الأفضل استهداف منتصف النطاق في التركيز.
      10. أوجد تركيز النوى باستخدام مقياس الدم.
      11. انتقل فورا إلى نقل scATAC باستخدام مخزون النوى المحضر17.
  3. إماهة الخلايا الثابتة للميثانول لاستخدامها في scRNA-Seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. لتحضير المخزن المؤقت للغسيل / التخفيف ، قم بإذابة 0.01 جم من BSA في 1 مل من PBS. ثم أضف 12.5 ميكرولتر من مثبط 40 U / μL RNase واخلطه بلطف. يخزن على الجليد.
    2. إماهة الخلايا
      1. خلايا مثبتة من الميثانول في جهاز طرد مركزي 1.5 مل عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة السوبرناتانت.
      2. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد للغسيل / التخفيف إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. كرر ما مجموعه 2 غسل.
        ملاحظة: قم بإعداد المواد المطلوبة لتوليد GEM والترميز الشريطي خلال الخطوتين السابقتين14.
      3. لإعداد مخزون الخلايا، استنادا إلى إجمالي عدد الخلايا المحسوب في 2.1.2.12.، أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت كاف للغسل/التخفيف لتحقيق تركيز الخلية المطلوب. تركيزات الخلايا المفضلة هي بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر.
      4. تحديد تركيز الخلية من مخزون الخلية باستخدام مقياس الدم.
      5. انتقل على الفور إلى توليد GEM والترميز الشريطي باستخدام مخزون الخلايا14.
    3. التسلسل
      1. عند إجراء تحليل دورة زمنية (كما هو الحال في التطوير أو المرض) ، قم بتسلسل عينات متعددة في تشغيل متعدد الإرسال (أي مكتبات متعددة على خلية تدفق واحدة) لتقليل التباين التقني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يضع سير العمل هذا استراتيجية للتحقيق في الأنماط الظاهرية التنموية والعمليات التنظيمية باستخدام تسلسل الخلية الواحدة. يتيح تعدد الإرسال المتعدد للعينات MULTI-seq إجراء فحص أولي منخفض التكلفة للتنميط الظاهري بينما يسمح الجمع المقترن وتثبيت العينات ل scRNA-seq و scATAC-seq بإجراء تحقيق أكثر تعمقا (الشكل 1).

يتيح الترميز الشريطي متعدد التسلسلات للعينات المتعددة وفك الالتفاف الحسابي اللاحق. يمكن تحديد عينة المنشأ لكل خلية بناء على تعبير الباركود الخاص بها (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبع قوة MULTI-seq من التكامل السلس للبيانات من ظروف أو نماذج تجريبية متعددة والفائدة الهائلة من حيث التكلفة والحد من تأثيرات الدفعات. يوفر استخدام MULTI-seq عمقا غير مسبوق للتنميط الظاهري في المختبر. طرق الإرسال المتعدد غير الجينية مثل تجزئة الخلايا أو تجزئة النوى فتحت الباب أمام عينات متعددة الإرسال من خلال استخدام الأجسام المضادة المشفرة7،19،20. ومع ذلك ، يعتمد هذا على توافر الأجسام المضادة عالية التقارب التي تتعرف على البروت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شيء للإفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ليندا أورزوليك من مركز جونز هوبكنز للنسخ و Deep Sequencing Core للمساعدة في تسلسل المكتبات المنتجة و Lizhi Jiang على أداء عمليات استئصال الشبكية خارج الجسم الحي .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 وميكرو ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ L ، 1000 & L ماصة نصائح
فلتر 10٪ توين 20بيوراد 1662404
100 & ميكرو; طلب حل الباركود Mمن مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= حقيقي
100٪ إيثانولMillipore SigmaE7023-500ML
100٪ ميثانولMillipore Sigma322415-100ML
حامل رقاقة 10x10x الجينوم1000195
10x تحكم الكروم & طقم الملحقات10x الجينومPN-120263
15 مل أنبوب الطرد المركزيجودة بيولوجيP886-229411
40 & micro ؛ م مصفاة خلية فلوميبيل آرتH13680-0040
50 & مايكرو; M Anchor SolutionSigma أو طلب من مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w / viewform?ts = 5c47a897& edit_requested
= true
50 & micro ؛ M Co-Anchor SolutionSigma أو طلب من مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w / viewform?ts = 5c47a897& edit_requested
= صحيح
5200 نظام محلل الشظاياAgilentM5310AA
70 um مصفاة خلية FlowMiBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R جهاز طردمركزي VWRBK392302
مصل الأبقار الألبومينSigma-AldrichA9647
الكروم التالي GEM Chip G10x الجينومPN-1000120
الكروم التالي GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
الكروم التالي Gem أحادي الخلية ATAC Kit v1.110x الجينومPN-1000175
الكروم خلية واحدة 3 'GEM ، مكتبة & مجموعة حبة جل v3.110x الجينومPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
مجهر تشريحLeica
DNA LoBind Tubes ، 1.5 ملEppendorf22431021
الجاف
EVA رغوة مقلاة الثلجTequipment04393-54
FA 12-Capillary صفيف قصير ، 33 سمAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp حمام مائيفيشر Scientific15-460-20Q
Forma CO2 حاضنة مغلفة بالماءThermoFisher Scientific3110
Glycerol 50٪ محلول مائيشركة Ricca ChemicalCompany 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq أو NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
LowBuffer Quality Biological351-324-721
محلول كلوريد المغنيسيوم 1 MSigma-AldrichM1028
رف فاصل مغناطيسي لأنابيب 1.5 ملMillipore Sigma20-400
رف فاصل مغناطيسي ل 200 & مايكرو ؛ أنابيب L10x علم الجينومNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma أو IDTانظر قائمة
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
مياه خالية من Nucleaseفيشر ScientificAM9937
P2 ، P10 ، P20 ، P200 ، P1000Eppendorf
Papainشركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةLK003150
PBS درجة الحموضة 7.4 (1X)فيشر ساينتفيك10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
أجهزة الطرد المركزي المبردة 5424 REppendorf2231000655
RNaseبدسات بيليه يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك12-141-368
RNasin Plus RNase InhibitorPromegaN2615
RPI التمهيديSigma أو IDTانظر قائمة
الفهرس الفردي N ، مجموعة A10x الجينومPN-1000212
مجموعة الفهرس الفردي مجموعة T A10x الجينومPN-1000213
محلول كلوريد الصوديوم 5 مسيجما ألدريتش59222C
SPRIselect Reagent KitBeckman CoulterB23318
ماصات النقل القياسية التي يمكن التخلص منهافيشر Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube شريطالولايات المتحدة الأمريكية Scientific1402-4700
تريزما هيدروكلوريد ، درجة الحموضة 7.4Sigma-AldrichT2194
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ (وزن / حجم)Corning25-900-CI
Universal I5 التمهيديSigma أو IDTانظر قائمة
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
: الثلج TE التسلسل نظام تفكك خالية من التسلسل مجموعة محلول التسلسل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224(2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345(2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598(2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907(2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles