Method Article

تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر تقنيات تسلسل الجيل التالي القوية تحليلا قويا وشاملا للتحقيق في كيفية عمل الشبكات التنظيمية لجينات الشبكية أثناء التطور وفي الحالات المرضية. يسمح لنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتحديد ملامح شاملة لتغيرات التعبير الجيني التي لوحظت في تطور الشبكية والمرض على المستوى الخلوي ، في حين يسمح ATAC-Seq أحادي الخلية بتحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وربط عامل النسخ ليتم توصيفه بدقة مماثلة. هنا يتم وصف استخدام هذه التقنيات في شبكية العين النامية ، ويتم توضيح MULTI-Seq ، حيث يتم تصنيف العينات الفردية بمركب أوليغونوكليوتيد دهني معدل ، مما يمكن الباحثين من زيادة نطاق التجارب الفردية وتقليل التكاليف بشكل كبير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب فهم كيف يمكن للجينات التأثير على مصير الخلية دورا رئيسيا في استجواب العمليات مثل المرض والتطور الجنيني. يمكن تجميع العلاقات المعقدة بين عوامل النسخ والجينات المستهدفة في شبكات تنظيم الجينات. تضع الأدلة المتزايدة هذه الشبكات التنظيمية الجينية في مركز كل من المرض والتطور عبر السلالات التطورية1. في حين أن التقنيات السابقة مثل qRT-PCR ركزت على جين واحد أو مجموعة من الجينات ، فإن تطبيق تقنية التسلسل عالية الإنتاجية يسمح بتنميط النسخ الخلوي الكامل.

يقدم RNA-seq لمحة عن النسخ على نطاق واسع 2,3. يمنح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الباحثين ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الحيوانات في هذه الدراسات باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوانات ، وفقا لإرشادات REACH ، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.

1. متعدد المقاييس

  1. الإعداد الإعلامي
    1. تحضير وموازنة مثبط البويضات ، 10 ملغ من مثبط البويضات و 10 ملغ من الألبومين لكل مل من محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) ، لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام13. التوازن مع 95٪ O 2: 5٪ CO2 في حاضنة.
      1. تحضير محلول التفكك غراء ، 20 وحدة / مل غراء و 0.005 ٪ DNase في EBSS ، خلال خطوة الحضانة هذه13.
        ملاحظة: قارورة وا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يضع سير العمل هذا استراتيجية للتحقيق في الأنماط الظاهرية التنموية والعمليات التنظيمية باستخدام تسلسل الخلية الواحدة. يتيح تعدد الإرسال المتعدد للعينات MULTI-seq إجراء فحص أولي منخفض التكلفة للتنميط الظاهري بينما يسمح الجمع المقترن وتثبيت العينات ل scRNA-seq و scATAC-seq بإجراء تحقيق أكثر تعمقا (الشكل 1).

يتيح الترميز الشريطي متعدد التسلسلات للعينات المتعددة وفك الالتفاف الحسابي اللاحق. يمكن تحديد عينة المنشأ لكل خلية بناء على تعبير الباركود الخاص بها (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبع قوة MULTI-seq من التكامل السلس للبيانات من ظروف أو نماذج تجريبية متعددة والفائدة الهائلة من حيث التكلفة والحد من تأثيرات الدفعات. يوفر استخدام MULTI-seq عمقا غير مسبوق للتنميط الظاهري في المختبر. طرق الإرسال المتعدد غير الجينية مثل تجزئة الخلايا أو تجزئة النوى فتحت الباب أمام عينات متعددة الإرسال من خلال استخدام الأجسام المضادة المشفرة7،19،20. ومع ذلك ، يعتمد هذا على توافر الأجسام المضادة عالية التقارب التي تتعرف على البروت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شيء للإفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ليندا أورزوليك من مركز جونز هوبكنز للنسخ و Deep Sequencing Core للمساعدة في تسلسل المكتبات المنتجة و Lizhi Jiang على أداء عمليات استئصال الشبكية خارج الجسم الحي .

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 وميكرو ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ L ، 1000 & L ماصة نصائح
فلتر 10٪ توين 20بيوراد 1662404
100 & ميكرو; طلب حل الباركود Mمن مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= حقيقي
100٪ إيثانولMillipore SigmaE7023-500ML
100٪ ميثانولMillipore Sigma322415-100ML
حامل رقاقة 10x10x الجينوم1000195
10x تحكم الكروم & طقم الملحقات10x الجينومPN-120263
15 مل أنبوب الطرد المركزيجودة بيولوجيP886-229411
40 & micro ؛ م مصفاة خلية فلوميبيل آرتH13680-0040
50 & مايكرو; M Anchor SolutionSigma أو طلب من مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w / viewform?ts = 5c47a897& edit_requested
= true
50 & micro ؛ M Co-Anchor SolutionSigma أو طلب من مختبر Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w / viewform?ts = 5c47a897& edit_requested
= صحيح
5200 نظام محلل الشظاياAgilentM5310AA
70 um مصفاة خلية FlowMiBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R جهاز طردمركزي VWRBK392302
مصل الأبقار الألبومينSigma-AldrichA9647
الكروم التالي GEM Chip G10x الجينومPN-1000120
الكروم التالي GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
الكروم التالي Gem أحادي الخلية ATAC Kit v1.110x الجينومPN-1000175
الكروم خلية واحدة 3 'GEM ، مكتبة & مجموعة حبة جل v3.110x الجينومPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
مجهر تشريحLeica
DNA LoBind Tubes ، 1.5 ملEppendorf22431021
الجاف
EVA رغوة مقلاة الثلجTequipment04393-54
FA 12-Capillary صفيف قصير ، 33 سمAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp حمام مائيفيشر Scientific15-460-20Q
Forma CO2 حاضنة مغلفة بالماءThermoFisher Scientific3110
Glycerol 50٪ محلول مائيشركة Ricca ChemicalCompany 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq أو NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
LowBuffer Quality Biological351-324-721
محلول كلوريد المغنيسيوم 1 MSigma-AldrichM1028
رف فاصل مغناطيسي لأنابيب 1.5 ملMillipore Sigma20-400
رف فاصل مغناطيسي ل 200 & مايكرو ؛ أنابيب L10x علم الجينومNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma أو IDTانظر قائمة
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
مياه خالية من Nucleaseفيشر ScientificAM9937
P2 ، P10 ، P20 ، P200 ، P1000Eppendorf
Papainشركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةLK003150
PBS درجة الحموضة 7.4 (1X)فيشر ساينتفيك10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
أجهزة الطرد المركزي المبردة 5424 REppendorf2231000655
RNaseبدسات بيليه يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك12-141-368
RNasin Plus RNase InhibitorPromegaN2615
RPI التمهيديSigma أو IDTانظر قائمة
الفهرس الفردي N ، مجموعة A10x الجينومPN-1000212
مجموعة الفهرس الفردي مجموعة T A10x الجينومPN-1000213
محلول كلوريد الصوديوم 5 مسيجما ألدريتش59222C
SPRIselect Reagent KitBeckman CoulterB23318
ماصات النقل القياسية التي يمكن التخلص منهافيشر Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube شريطالولايات المتحدة الأمريكية Scientific1402-4700
تريزما هيدروكلوريد ، درجة الحموضة 7.4Sigma-AldrichT2194
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ (وزن / حجم)Corning25-900-CI
Universal I5 التمهيديSigma أو IDTانظر قائمة
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
: الثلج TE التسلسل نظام تفكك خالية من التسلسل مجموعة محلول التسلسل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles