يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكبريتات الجليكوسامينوغليكان (GAGs) مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) موجودة في كل مكان في الكائنات الحية وتلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات البيولوجية الأساسية. كما البوليمرات، GAGs موجودة كخليط متعدد الأضلاع التي تحتوي على سلاسل البوليساكريد التي يمكن أن تتراوح بين 4000 دا إلى أكثر من 40،000 دا. داخل هذه السلاسل توجد مجالات الكبريت، مما يمنح نمطا من الشحنة السلبية التي تسهل التفاعل مع بقايا مشحونة إيجابيا من ليغند البروتين cognate. يجب أن تكون المجالات الكبريتية من GAGs من طول كاف للسماح لهذه التفاعلات الكهربائية. لفهم وظيفة GAGs في الأنسجة البيولوجية ، يجب أن يكون المحقق قادرا على عزل وتنقية وقياس حجم GAGs. يصف هذا التقرير تقنية عملية ومتعددة الاستخدامات تعتمد على جل البولي أكريلاميد تعتمد على الكهروفورسيس والتي يمكن الاستفادة منها لحل الاختلافات الصغيرة نسبيا في الحجم بين GAGs المعزولة عن مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة البيولوجية.
المقدمة
الجليكوسامينوغليكان (GAGs) هي عائلة متنوعة من السكريات الخطية التي هي عنصر في كل مكان في الكائنات الحية وتساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية1. ويمكن كبريتات GAGs مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) في مواقع متميزة على طول سلسلة البوليساكريد ، مما يضفي مجالات جغرافية من الشحنة السلبية. هذه GAGs، عندما المربوطة إلى البروتينات سطح الخلية المعروفة باسم البروتيوغليكان، المشروع في الفضاء خارج الخلية وربط ليغاندس cognate، مما يسمح لتنظيم كل من رابطة الدول المستقلة- (ligand تعلق على نفس الخلية) وعبر -(ligand تعلق على الخلية المجاورة) عمليات الإشارة2. وعلاوة على ذلك، GAGs أيضا أداء الأدوار الحاسمة كعن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على جميع العينات البيولوجية التي تم تحليلها في هذا البروتوكول من الفئران، بموجب بروتوكولات وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كولورادو.
1. عزل كبريتات الهيباران
- تهذي عينات الأنسجة
ملاحظة: Delipidation هو خطوة اختيارية للأنسجة الغنية بالدهون.- جعل خليط 1:1 من الميثانول وديكلوروميثان. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل عينة؛ قد تتطلب قطع أكبر من الأنسجة ما يصل إلى 1 مل.
- ضع كل عينة نسيج في وعاء زجاجي صغير مع غطاء للتهذي.
ملاحظة: قد تختلف كتلة العينة حسب الأنسجة ذات الاهتمام والاحتياجات التجريبية. 50 ملغ أو أقل عادة ما تكون كافية لغلة GAG كافية, ولكن قد تكو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يستخدم الأزرق الألسيان ل وصمة عار GAGs كبريتيد 10; يتم تضخيم هذه الإشارة باستخدام بقعة فضية لاحقة 11. الشكل 1 يوفر عرضا مرئيا لعملية تطوير تلطيخ الفضة. كما هو موضح، يتم تضخيم الإشارة الزرقاء الألسيان تمثل GAGs مفصولة الكهربائي كما وكيل النامية تخترق هلام البولي أكريلاميد. عادة ، فإن عملية تطوير خفض الفضة وGAGs Alcian الأزرق الملطخة بطريقة تعتمد على الكثافة ، مع حواف كل الفرقة الحد أولا في حين أن المناطق الأكثر كثافة تلطيخ في المركز سوف وصمة عار.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تلعب مجموعات GAGs دورا مركزيا في العديد من العمليات البيولوجية المتنوعة. واحدة من الوظائف الرئيسية لغاغات كبريتات (مثل HS و CS) هو التفاعل مع وربط ليغاندس، والتي يمكن أن تغير وظائف الإشارات المصب. محدد مهم لتقارب GAG ملزمة لgnate ligands هو طول سلسلة البوليمر GAG 8،9،14. ولهذا السبب، من المهم للباحثين أن يكونوا قادرين على تحديد حجم سلاسل GAG المعزولة عن العينات البيولوجية ذات الاهتمام بدقة معقولة. وينبغي أن تكون هذه التقنية، لكي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل F31 HL143873-01 (WBL) ، R01 HL125371 (RJL و EPS)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Accuspin Micro17 منضدة الطرد المركزي | الصغير thermoFisher Scientific | 13-100-675 | أي تركيبة من أجهزة الطرد المركزي / الدوار على الطاولة قادرة على 14000 xG مناسبة |
| أكريلاميد (صلب) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | درجة الرحلان الكهربائي |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | مزيج البروتياز من S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (صلب) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| أسيتات الأمونيوم (صلب) | thermoFisher Scientific | A639-500 | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| هيدروكسيد الأمونيوم (سائل) thermoFisher | Scientific | A669S-500 | معتمد ACS |
| بيرسلفات الأمونيوم (صلب) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | درجة الرحلان الكهربائي |
| Barnstead GenPure Pro Water نظام تنقية | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | أي نظام لإزالة الأيونات / تنقية المياه هو بديل مقبول |
| حمض البوريك (صلب) | thermoFisher Scientific | A73-500 | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| برومفينول الأزرق (صلب) thermoFisher | Scientific | B392-5 | |
| أسيتات الكالسيوم (صلب) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | كلوريد الكالسيوم من درجة البيولوجيا الجزيئية |
| (صلب) ThermoFisher | Scientific | AC349610250 | Molecular |
| منظف CHAPS (3- ((3-cholamidopropyl) ثنائي ميثيل أمونيو) -1-بروبان سلفونات) ThermoFisher | Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion كاسيت فارغ ل PAGE (سمك 1.0 مم ، 12 + 2 آبار) | Bio-Rad | 3459901 | أي نظام كاسيت صب PAGE بسمك 1.0 مم يكفي |
| نظام خلية PAGE المعيار (الخلية ومصدر الطاقة) | Bio-Rad | 1656019 | أي نظام PAGE هلام عمودي مماثل سيعمل ) ثنائي |
| كلورو الميثان (سائل) | thermoFisher Scientific | المعتمد من | AC610931000 ACS |
| EDTA ملح ثنائي الصوديوم (صلب) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | الجزيئي حمض الخليك الجليدي من الدرجة الأحيائية |
| (سائل) thermoFisher | Scientific | A35-500 | معتمد ACS |
| Glycine (صلب) | thermoFisher Scientific | G48-500 | درجة الرحلان الكهربائي |
| Heparanase I / III | Sigma Aldrich | H3917 | من Flavobacterium heparinum |
| الهيبارين المشتق دكاساكاريد (dp10) | جالين العلمي | HO10 | |
| سداسي ساكارد مشتق من الهيبارين (dp6) | جالينوس العلمي | HO06 | |
| السكاريد المشتق من الهيبارين (dp20) | جالينوس العلمي | HO20 | |
| حمض الهيدروكلوريك (سائل) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | أي مجفف يمكن أن يحقق -40 درجة مئوية و 0.135 Torr سيعمل ؛ يمكن أيضا استبداله بمكثف فراغ دوراني |
| الميثانول (السائل) | thermoFisher Scientific | A412-500 | معتمد ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | أي نظام تصوير هلامي مماثل هو بديل مقبول |
| N ، N'-methylene-bis-acrylamide (صلب) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | درجة الرحلان الكهربائي |
| الفينول الأحمر (الصلب) | thermoFisher Scientific | P74-10 | الحمض الحر |
| Q Mini H عمود التبادل الأيوني | Vivapure | VS-IX01QH24 | يجب أن يكون لعمود التبادل الأيوني حد أدنى لحجم التحميل 0.4 مل ، ودرجة حموضة العمل من 2-12 ، وانتقائية للمجموعات الأيونية مع pKa من 11 |
| نترات فضة (صلبة) | ThermoFisher Scientific | S181-25 | معتمد من ACS |
| أسيتات الصوديوم (صلب) ThermoFisher | Scientific | S210-500 | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| كلوريد الصوديوم (صلب) | thermoFisher Scientific | S271-500 | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| هيدروكسيد الصوديوم (صلب) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| السكروز (صلب) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| TEMED (N ، N ، N '، N'، N'-tetramethylenediamine) thermoFisher | Scientific | BP150-20 | درجة الرحلان الكهربائي |
| قاعدة تريس (صلبة) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | الفائقة من درجة البيولوجيا الجزيئية |
| ، 0.5 مل ، 3000 Da الوزن الجزيئي قطع | Amicon | UFC500324 | يمكن استخدام وحدات تصفية الحجم الأكبر ، اعتمادا على حجم العينة. |
| اليوريا (الصلبة) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | سيعمل أي مكثف فراغ دوراني ؛ يمكن استبداله بوحدة |
| تصفية فراغ Lyophilizer ، للاستخدام الفردي ، 0.22uM المسام PES ، حجم 500 مل | thermoFisher Scientific | 569-0020 | الأحجام البديلة ومواد الترشيح مقبولة |
المراجع
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
