Method Article

أساليب الثقافة لدراسة التفاعلات Apical محددة باستخدام نماذج الجهاز المعوي

DOI:

10.3791/62330

⸱

March 23rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم اثنين من البروتوكولات التي تسمح النمذجة من التفاعلات المعوية apical محددة. تسهل الطبقات الأحادية المعوية المشتقة من الجهاز وثقافات واجهة الهواء السائل (ALI) توليد الظهارة المتباينة بشكل جيد والتي يمكن الوصول إليها من كلا الجانبين الإنارة والباسولاتيري ، في حين أن الأجهزة المعوية المقلوبة القطبية تعرض جانبها العضي وقابلة للمقاسات عالية الإنتاجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون بطانة ظهارة الأمعاء من طبقة بسيطة من الخلايا الظهارية المتخصصة التي تعرض جانبها القرد للتشحيم وتستجيب للإشارات الخارجية. التحسين الأخير لظروف الثقافة في المختبر يسمح لإعادة إنشاء مكانة الخلايا الجذعية المعوية وتطوير النظم المتقدمة 3 الأبعاد (3D) الثقافة التي تلخص تكوين الخلية وتنظيم الظهارة. يمكن الحفاظ على الأجهزة العضوية المعوية المضمنة في مصفوفة خارج الخلية (ECM) على المدى الطويل والتنظيم الذاتي لتوليد ظهارة مستقطبة محددة جيدا تشمل تجويفا داخليا وجانبا بازليا خارجيا مكشوفا. هذه الطبيعة التقييدية للأجهزة المعوية تطرح تحديات في الوصول إلى السطح apical من الظهارة في المختبر ويحد من التحقيق في الآليات البيولوجية مثل امتصاص المغذيات والتفاعلات المضيفة الميكروبيوتا / المضيف الممرض. هنا، ونحن نصف طريقتين التي تسهل الوصول إلى الجانب apical من ظهارة organoid ودعم التفريق بين أنواع محددة من الخلايا المعوية. أولا، نظهر كيف أن إزالة ECM تحفز على عكس قطبية الخلايا الظهارية وتسمح بتوليد الأجهزة العضوية ثلاثية الأبعاد. ثانيا، نحن نصف كيفية توليد أحاديات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) من تعليق الخلايا المفردة المشتقة من الأعضاء المعوية، والتي تتألف من أنواع خلايا ناضجة ومتمايزة. توفر هذه التقنيات أدوات جديدة لدراسة التفاعلات الخاصة بالظهارة مع الإشارات الخارجية في المختبر وتعزيز استخدام الأجهزة العضوية كمنصة لتسهيل الطب الدقيق.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الظهارة المعوية هي ثاني أكبر ظهارة في جسم الإنسان وتتكون من طبقة خلايا مستقطبة تسهل امتصاص المغذيات وتعمل كحاجز ضد الإهانات البيئية1. يسمح هذا التمييز بين الجانبين القاعدي والباسولاتيري لخلايا الظهارة بتنفيذ وظائفها المتنوعة. تتعرض المقصورة apical للتجويف وتتوسط التفاعلات الظهارية مع المحفزات البيئية والكائنات الحية الدقيقة ، مع تسهيل امتصاص العناصر الغذائية. سطح basolateral يضم تقاطعات بين الخلايا والالتصاقات مصفوفة الخلية، في حين أن التفاعل مع خلايا الجهاز المناعي والأنسجة الأخرى2. هذه التقاطعات توليد أحادية الطبقة منيعة تعلق على غشاء الطابق السفلي، الذي يعمل كحاجز ويسلم المواد الغذائية الممتصة إلى أنسجة الجسم المحيطة بها.

إنشاء نظم الثقافة التي هي قادرة على تلخيص هذه الوظائف المعوية في المختبر كان تحديا3. تستخدم النماذج التقليدية في المختبر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية المتحولة ، مثل Caco-2 ، لتوليد ثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. على الرغم من كونها قادرة على نمذجة وظائف متعددة من المقصورة absorptive، وهذه النماذج لا يمكن تلخيصها تماما تكوين ظهارة الأمعاء ووظيفة، والتي تحد من الخصائص الوظيفية الرئيسية والتطبيقات4،5.

ظهور organoids كنظام متقدم ثقافة 3D ولدت من الخلايا الجذعية التي يمكن تنظيم نفسها وتفرق لأنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء، وكان اختراقا في الدراسة المختبرية للظهارة المعوية6. يتم تضمين الأجهزة العضوية المعوية في مصفوفة خارج الخلية (ECM) تشبه الصفيحة القاعدية وتشكل تقاطعات مصفوفة الخلية التي تسمح لهذه الثقافات بالاحتفاظ بالقطبية اللابيكوبازالية للظهارة. تظهر الأجهزة العضوية بنية مغلقة يتعرض فيها الجانب القردي للمقصورة الإنارة ، وبالتالي تحاكي بنية الأمعاء. على الرغم من أن هذه المنظمة المغلقة توفر الفرصة لدراسة وظائف محددة التوجيه، فإنه يحد من التحقيقات التي تتطلب الوصول إلى الجانب apical من الظهارة. وقد اتخذت نهج مختلفة للتغلب على هذه القيود في كل من 2D و 3D، بما في ذلك تجزئة organoid، microinjection organoid، وتوليد الثقافات أحادية الطبقة7. يسبب تجزئة الجهاز فقدان التنظيم الهيكلي وتدمير تقاطعات الخلايا ، مما يسمح بتعرض السطح الظهاري للظهارة إلى الوسط. هذه التقنية يستفيد من القدرة التجديدية للشظايا لإصلاح organoids عندما بذر في مصفوفة خارج الخلية، وقد استخدمت لنموذج الأمراض المعدية والتفاعلات المضيفةالممرضة 8،9. ومع ذلك، فإن الوصول المتزامن إلى كل من السطح القاعدي والبسالي قد يؤدي أيضا إلى استجابات غير محددة للعدوى.

ويمثل النهج البديل الذي يسمح بالوصول إلى السطح apical ويحافظ على كل من العمارة الهيكلية وتقاطعات الخلايا من خلال التنميق الدقيق للعوامل في تجويف organoids. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة ونموذج آثار Cryptosporidium10، H. بيلوري11، و C. difficile12 على ظهارة الجهاز الهضمي في المختبر. باستخدام تقنيات مماثلة، تم تحديد إمكانات المطفرة من pks+ سلالة من القولونية E. على ظهارة الأمعاء13. على الرغم من فعالية، microinjection organoid مهمة شاقة وغير فعالة بالنظر إلى العدد الكبير من organoids التي يلزم حقنها للحصول على آثار قابلة للقياس، وبالتالي يحد من تطبيقه على المقايسات الإنتاجية العالية.

كما وفرت التطورات الأخيرة مع organoids المعوية أساليب لإنشاء 2D أحادي الطبقة الثقافات organoid، وبالتالي فضح سطحها apical14،15،16،17. هذه الطبقات الأحادية المشتقة من الجهازية تلخص المفتاح في خصائص الجسم الحي للظهارة المعوية. وهي تظهر تكوين خلايا ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، تحتوي على مجموعات الخلايا المتمايزة والخلايا الجذعية على حد سواء ونموذج التنوع عبر محور سرداب فيلوس. كما يتم الاحتفاظ القطبية apicobasal، خصائص أحادية الطبقة المتأصلة تسمح لسهولة الوصول إلى كل من الجانبين apical وbasolateral والتبادلات وسائل الإعلام يمكن أن تحاكي تدفق الأمعاء وإزالة النفايات مما يسمح للثقافة على المدى الطويل. هذه الميزات تجعل أحاديات أحادية مشتقة من الجهاز قابلة للدراسات التي تركز على التفاعلات الإنارة وتوفر نموذجا متفوقا لسلامة الحاجز الظهاري وال نفاذية18،19.

وقد أظهرت الدراسات أن القطبية الخلايا الظهارية وينظم بإحكام من قبل البروتينات ECM في كرويدات MDCK20،21 ومؤخرا في organoids الأمعاء البشرية22. إزالة مكونات ECM أو تثبيط مستقبلات integrin التي تتوسط تقاطعات مصفوفة الخلية يؤدي إلى انعكاس قطبية من الأجهزة المعوية والتعرض للجانب apical من الظهارة إلى المتوسط22. وقد اجتذب هذا النهج اهتمام الباحثين العاملين على الأمراض المعدية لأنه يسمح بسهولة الوصول إلى الجانب apical في 3D ويجعلها قابلة ل المقايسات الإنتاجية العالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول تعديل استنادا إلى العمل الأخير من قبل مختبر أميفا22،الذي يسهل توليد الأجهزة المعوية 3D التي تكشف بسهولة جانبهم apical. كما نحدد البروتوكول الذي يمكن أن يولد بكفاءة واستنساخ أحاديات الأبعاد المعوية المشتقة من الأجهزة العضوية المعوية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ اشتقاق الثقافات العضوية المعوية البشرية كما هو موضح في مكان آخر23. تم الحفاظ على Organoids في الثقافة كما هو موضح في ورقة معلومات المنتج (PIS) لتوسع الجهاز المعوي المتوسط (راجع جدول المواد).

1. انعكاس القطبية الجهازية المعوية

ملاحظة: هذا المقطع سوف يحدد البروتوكول لعكس قطبية الأجهزة العضوية المعوية ثلاثية الأبعاد. يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصلا لإنشاء الأجهزة المستقطبة ذات السطح apical المكشوفة في تعليق في لوحة الثقافة. ويهدف هذا البروتوكول بمثابة اختبار نقطة النهاية، على الرغم من أن organoids يمكن الحفاظ عليها في هذا تشكيل لأكثر من 2 أسابيع والحفاظ على عدد قليل من الخلايا الجذعية التي تسمح لهم لإعادة تأسيس العضيات apical في عند المرور.

  1. طلاء الأواني الثقافية والأنابيب مع حل المضادة للتمسك
    ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من عدد من الأجهزة المعوية apical التدريجي ومنع التعلق غير مرغوب فيه إلى الأواني الثقافية، مطلوب بشكل عام precoating من الأواني الثقافية. يصف القسم المبين أدناه طلاء الثقافة والأدوات البلاستيكية مع محلول مضاد للتمسك.
    1. معطف لوحات الثقافة لاستخدامها في الجزء تعليق من البروتوكول على النحو التالي.
      1. إضافة 0.5 مل من الحل المضادة لأتباع لكل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا.
      2. دوامة لوحة لنشر الحل بالتساوي عبر السطح وجدران الآبار.
      3. طرد مركزي لوحة في 1300 × ز لمدة 10 دقيقة.
      4. إزالة الحل المضادة لأتباع من كل بئر باستخدام الطامح أو ماصة 1 مل.
      5. غسل الآبار مع 1 مل من DMEM/ F-12 مع 15m HEPES (DMEM/F12).
      6. ملء كل غسلها جيدا مع 0.5 مل من DMEM / F-12 وتخزين لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى الاستخدام.
        ملاحظة: إذا لم يتم استخدامها على الفور، يمكن الاحتفاظ بالأطباق المغلفة في الحاضنة لمدة أسبوع واحد على الأقل.
    2. معطف 15 مل أنابيب مخروطية المستخدمة في هذا البروتوكول على النحو التالي.
      1. أضف 4 مل من محلول مضاد للضم إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
      2. دوامة أنبوب لنشر الحل بالتساوي عبر سطح الجدران.
      3. طرد مركزي الأنبوب في 1300 × ز لمدة 10 دقيقة.
      4. إزالة الحل المضادة لأتباع من الأنبوب.
      5. اغسل الأنبوب 1x مع 5 مل من DMEM/F-12 و أسبيرات DMEM/F-12. الأنابيب جاهزة الآن للاستخدام.
        ملاحظة: إذا لم يتم استخدامه على الفور، أضف 5 مل من DMEM/F12 وخزنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن الاحتفاظ بالأنابيب المغلفة عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع على الأقل.
  2. انعكاس القطبية من الأجهزة المعوية عن طريق تعليق الثقافة
    ملاحظة: توضح الخطوات أدناه انعكاس الأجهزة العضوية المعوية التي تم استزراعها سابقا في ظل ظروف قبة ECM القياسية. الإجراءات الموصوفة هنا هي لمحسن واحد من لوحة 24 بئرا. إذا كنت تستخدم أدوات ثقافية أخرى، فضبط وحدات التخزين وفقا لذلك.
    1. إزالة بعناية وتجاهل المتوسطة من كل بئر تحتوي على organoids دون تعطيل غشاء الطابق السفلي قبة مصفوفة خارج الخلية. تأكد من أن حجم organoids هو قطر 150-250 ميكرومتر (عادة في اليوم 3-5) قبل بدء بروتوكول الانعكاس.
    2. إضافة 1 مل من محلول التفكك الجليد البارد في كل بئر.
    3. حضانة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
    4. إضافة ما لا يقل عن 2 مل من الحل المضادة لأتباع أنبوب 15 مل لاستخدامها في طلاء نصائح البلاستيك.
    5. أضف ما لا يقل عن 2 مل من DMEM/F-12 إلى أنبوب 15 مل لاستخدامه لغسل النصائح البلاستيكية المشطفة بمحلول مضاد للتمسك.
    6. معطف تلميح ماصة 1 مل مع حل المضادة للأتباع، pipetting 1 مل من الحل ثلاث مرات في أنبوب مع حل مضادة للتمسك من الخطوة 1.2.4.
    7. غسل طرف في DMEM الباردة / F - 12 ، pipetting 1 مل من الحل ثلاث مرات في أنبوب مع DMEM / F - 12 من الخطوة 1.2.5.
    8. باستخدام طرف المغلفة، إزاحة بعناية القباب عن طريق الأنابيب ببطء. الحرص على عدم تعطيل أو تجزئة organoids.
    9. نقل تعليق organoid إلى لوحة تعامل مع محلول مضاد للأتباع (من الخطوة 1.1.1).
    10. ضع الطبق على شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ويمكن استخدام شاكر جيرو في 70 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: تجنب الاهتزاز القاسي، مثل الدوامة العينة، كما يمكن أن يؤدي إلى تجزئة organoid. تشكيل فقاعات وزبد يمكن أن تشير إلى اهتزاز قاسية.
    11. بعد 30 دقيقة، قم بإزالة اللوحة. باستخدام طرف ماصة 1 مل المغلفة مع حل المضادة للأتباع، ماصة بلطف الحل صعودا وهبوطا.
    12. ضع الطبق على شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ويمكن استخدام شاكر جيرو في 70 دورة في الدقيقة.
    13. إزالة لوحة والسماح لل organoids تسوية بالجاذبية (1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة). مراقبة لوحة تحت المجهر للتحقق من الترسيب العضوي.
      ملاحظة: تجنب التحريض واسعة من لوحة لأنها يمكن أن تسبب organoids استقر لإعادة الإنفاق.
    14. بعد تسوية organoids، وإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الانفصال وغسل بإضافة 1.5 مل من DMEM/F-12.
    15. السماح لل organoids إلى الرواسب وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
      ملاحظة: مراقبة لوحة تحت المجهر للتحقق من الترسيب العضوي قبل تنفيذ أي خطوة الغسيل.
    16. إزالة أكبر قدر ممكن من DMEM /F-12 وإضافة 0.5 مل من الأمعاء Organoid توسيع المتوسطة. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    17. في اليوم التالي، قم بإجراء تغيير متوسط جزئي عن طريق إمالة اللوحة بزاوية 25 إلى 30 درجة، وإزالة متوسطة على طول جدار البئر. إزالة 0.4 مل من متوسطة مع الحرص على عدم إزالة organoids المعلقة.
    18. إضافة 0.4 مل الأمعاء الجهازية توسيع المتوسطة. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: بعد 3 أيام، يجب أن يكون معظم organoids قطبية apical التدريجي، ولكن قد تكون شكلت المجاميع الكبيرة.
    19. إذا تشكلت المجاميع، استخدم ماصة 1 مل مع طرف مغلف بمحلول مضاد للتمسك (كما هو موضح في الخطوتين 1.2.6 و 1.2.7) لقص المجاميع عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 20 مرة أثناء الضغط على نهاية الطرف في الجزء السفلي من اللوحة.
    20. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 وأجر تغييرا متوسطا كاملا في اليوم التالي مع وسيط توسع الجهاز المعوي (كما هو موضح في القسم 1.2.17).
    21. بعد يومين (اليوم 5 في التعليق) ، يمكن استخدام الأجهزة العضوية المعوية في المصب.

2. إنشاء خلايا معوية أحادية الطبقة 2D والهواء السائل واجهة (ALI) الثقافات المستمدة من الأجهزة المعوية 3D

ملاحظة: هذا المقطع سوف يحدد البروتوكول لتوليد ثقافات أحادية الطبقة 2D من organoids المعوية. توفر هذه التقنية ميزة إنشاء ثقافة أحادية الطبقة التقاء مستقطبة مع سطح apical مكشوف في لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على إدراج غشاء غشاء زراعة الخلية. على الرغم من أن الطبقة الأحادية ستبدأ في التفريق في الشكل المغمور أحادي الطبقة ، إلا أنه يمكن تحقيق تمييز إضافي للطابق الأحادي عن طريق التحول إلى ثقافة ALI بعد أن تصل إلى التقاء. والمقصود كل من monolayer والبروتوكولات ALI اللاحقة بمثابة المقايسات نقطة النهاية وعلى الرغم من أن ثقافة أحادية الطبقة يحافظ على عدد قليل من الخلايا الجذعية، لا يمكن تقسيم بكفاءة وتمريرها بعد إنشائها.

  1. إعداد الوسائط واللوحات لثقافة الطبقة الأحادية المعوية
    1. إعداد التمايز الجهازي المعوي المتوسطة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة لثقافة أحادية الطبقة (انظر قائمة المواد). أضف Y-27632 فقط إلى حجم متوسط سيتم استخدامه في غضون أسبوع بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر. إذا لم يتم استخدامه على الفور، قم بتخزينه عند 4 °C.
    2. قبل الحارة تريبسين EDTA (0.05٪) إلى 37 درجة مئوية.
    3. على الأقل 2 ساعة قبل البذر الثقافات أحادية الطبقة، وإعداد حل طلاء ECM 2٪ على النحو التالي.
      1. تذوب ECM على الجليد وإضافة 1:50 إلى برنامج تلفزيوني بارد ومعقم لإعداد حل 2٪. إعداد كميات كافية لإضافة 100 ميكرولتر إلى البئر العلوي من كل 6.5 مم (0.33 سم2)إدراج غشاء زراعة الخلية لاستخدامها. ضبط وحدة التخزين بشكل مناسب للثقافات الكبيرة أو الأصغر.
    4. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر واحتضن كل طبق عند 37 درجة مئوية و5٪ثاني أكسيد الكربون حتى الحاجة (على الأقل 2 ساعة قبل البذر).
  2. فصل الأجهزة العضوية المعوية لتوليد أحادي الطبقة والثقافة
    1. إزالة عدد مناسب من آبار الثقافة العضوية من الحاضنة. راجع الجدول 1 للاطلاع على العدد الموصى به من الآبار التي يمكن حصادها لمختلف الأواني الثقافية.
    2. يستنشق كل وسيلة من الثقافات organoid دون إزعاج قبة ECM.
    3. إضافة 1 مل من حل الانفصال لكل بئر.
    4. حضانة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة على الأقل.
    5. باستخدام ماصة 1 مل، ماصة بقوة صعودا وهبوطا لتعطيل القبة والإفراج عن organoids.
    6. تجمع organoids المعلقة من كل بئر في أنبوب مخروطي 15 مل. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف أو هزاز. يمكن تجميع الأجهزة العضوية لزرع آبار متعددة في هذه الخطوة ، حتى 10 مل في كل أنبوب.
    7. جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. إزالة وتجاهل supernatant. إضافة 5 مل الجليد الباردة DMEM/F-12 إلى organoids resuspend.
    9. اخلط جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. يستنشق supernatant، وإزالة قدر الإمكان، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
      ملاحظة: قد تبقى بعض ECM المتبقية في بيليه; ومع ذلك ، لا ينبغي أن يؤثر هذا بشكل كبير على تفكك الأعضاء.
    11. أضف 1 مل من الأجهزة العضوية التي تم تسخينها مسبقا (37 درجة مئوية) تريبسين-إدتا (0.05٪) تخلط جيدا لضمان تعليق حتى. إضافة ما يصل إلى 1 مل إضافية من تريبسين-EDTA لعدد كبير من الخلايا، أو إذا كان لا يزال هناك كمية كبيرة من ECM.
    12. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
    13. تخلط جيدا مع ماصة 1 مل لتعطيل organoids قدر الإمكان. يجب فصل الأعضاء العضوية تماما إلى خلايا مفردة أو شظايا صغيرة. إذا كانت شظايا أكبر أو العضويات كلها لا تزال بعد pipetting تماما، ومواصلة الحضانة مع تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق أخرى.
      ملاحظة: لا تحتضن مع تريبسين-EDTA لأكثر من 20 دقيقة، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان زيادة صلاحية الخلية.
    14. بمجرد فصل الأجهزة العضوية بما فيه الكفاية ، أضف حجما متساويا من DMEM / F-12 (على سبيل المثال ، 1 مل DMEM / F -12 لكل مل تريبسين - EDTA) وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. تعطيل تريبسين-EDTA بإضافة 10٪ FBS إلى DMEM/F-12 في هذه الخطوة.
    15. شظايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية.
    16. إذا فشلت الأجهزة العضوية المفككة في الكريات ، فهذا أمر شائع وقد يكون بسبب تراكم المخاط الذي تطلقه الخلايا المفككة. في هذه الحالة، خلط الخلايا جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا والطرد المركزي لهم مرة أخرى في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية.
    17. إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من supernatant، وترك فقط بيليه الخلية.
    18. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسط (مع 10 ميكرومتر Y-27632) لكل بئر أن تكون المصنف. ضبط مستوى الصوت بشكل مناسب لأحجام الآبار الكبيرة أو الأصغر.
    19. إزالة لوحات المغلفة من الحاضنة (أعدت في الخطوة 3.1.4) وإزالة ECM الزائدة من كل بئر.
    20. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى البئر العلوي من كل إدراج ثقافة الخلية.
    21. إضافة 500 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسطة إلى البئر السفلي من كل إدراج ثقافة الخلية.
    22. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    23. استبدل الوسط في كل من الآبار العليا والسفلى كل يومين إلى ثلاثة أيام. يجب أن تصل ثقافات الطبقة الأحادية إلى الالتقاء في غضون 7 أيام ، وغالبا ما تصل إلى الالتقاء في غضون 2-3 أيام.
  3. تأسيس ثقافة واجهة الهواء السائل (ALI)
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن تحقيق مزيد من التمايز من ثقافة أحادية الطبقة المعوية المغمورة عن طريق نقل ثقافة أحادية الطبقة المغمورة إلى ثقافة ALI. ستسمح طريقة الثقافة هذه بزيادة عدد أنواع الخلايا المتمايزة ، وخاصة خلايا النسب الإفراري ، مثل الكؤوس وخلايا الغدد الصماء المعوية.
    1. إنشاء ثقافة أحادية الطبقة في إدراج ثقافة الخلية كما هو موضح أعلاه في الخطوات 2.2.1-2.2.23 والحفاظ على هذه الثقافة في التقاء 100٪ لمدة 4 أيام على الأقل.
    2. لإنشاء ثقافة ALI، قم بإزالة الوسط من الآبار العليا والسفلى. إضافة التمايز الجهازي المعوي الطازج المتوسط (مع Y-27632) إلى البئر السفلي، وترك العلوي فارغة جيدا.
    3. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. استبدال المتوسطة في البئر السفلي كل 2-3 أيام والسماح لooolayer للتمييز لمدة أسبوع واحد على الأقل.
    5. شطف البئر العلوي مع برنامج تلفزيوني معقم لإزالة تراكم المخاط الزائد، إذا لزم الأمر.
      في ظل هذه الظروف، يمكن الحفاظ على ثقافة ALI لمدة 2-3 أسابيع على الأقل.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء Organoids من عينات الخزعة بعد البروتوكول الموصوف سابقا23 وفي PIS للأمعاء Organoid توسيع المتوسطة (انظر جدول المواد). الشكل 1A، لوحة اليسار، ويبين النمط الظاهري من organoids المعوية المستزرعة في قبة مع توسيع الجهاز المعوي المتوسطة. في هذه الظروف الثقافية ، تظهر organoids مورفولوجيا كيسية محددة بظهارة رقيقة (10-25 ميكرومتر) تحيط بالتجويف(الشكل 1A، لوحة اليمين). في هذه المرحلة ، يواجه الجانب apical من ظهارة الأمعاء التجويف ، في حين أن الجانب القاعدي يتصل بالمصفوفة خارج الخلية المحيطة. عندما وصلت غالبية organoids الحجم المطلوب، تمت إزالة مصفوفة خارج الخلية، ثم تم استزراع organoids في التعليق. فقدان الربط الخلوي إلى مصفوفة خارج الخلية يؤدي إلى عملية انقلاب في organoids، مما أدى إلى عكس قطبية ظهارة الجهازية، وتعريض الجانب apical من الظهارة إلى متوسط النمو واستيعاب الجانب القاعدي.

في بعض الثقافات، organoids في تعليق المجمع والصمامات، وهو تأثير الذي هو أكثر عمقا خلال الأيام ال 3 الأولى(الشكل 1B،لوحة اليسار). تطبيق تقنية القص يسمح مفرزة من organoids واستمرار الثقافات لأيام مع الحد الأدنى من التجميع (الشكل 1B، لوحة الحق).

organoids المعوية المستزرعة في القباب ECM الاستمرار في التوسع (الشكل 1C، لوحة اليسار) ، وتظهر تشكيل عفوية من الهياكل الناشئة الثانوية ، تشبه سرداب صغيرة ، على الجانب القاعدي من الظهارة المحيطة التجويف(الشكل 1C، لوحة الحق). في نفس الوقت النقطة، organoids الحفاظ على 5 أيام في غياب مصفوفة خارج الخلية الاستمرار في تطوير في تعليق (الشكل 1D، لوحة اليسار). يتميز انعكاس القطبية يثخن (30-40 ميكرومتر) من الظهارة التي تحيط جوهر organoids وظهور مجموعة متنوعة من morphologies: ممدود (الشكل 1D، لوحة الحق والشكل التكميلي 1A)، الكيسي ( الشكلالتكميلي 1B)، وغير منتظمة ( الشكلالتكميلي 1C). وغالبا ما يقترن هذا مع تقلص المساحة الإنارة داخل الجهاز، مما يؤثر على حجمها الإجمالي.

ويمكن أيضا تأكيد عكس كفاءة من خلال تحليل التعبير عن علامات القطبية المعوية محددة. تظهر الأجهزة العضوية المعوية Apical-out ترجمة متميزة للنوى نحو تجويف الجهاز ، كما هو مبين في إشارة 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). يتم الكشف عن التعبير عن علامات apical، مثل VILLIN (الشكل 2A) وZO-1 (الشكل 2B)، في الجانب الخارجي من الظهارة التي تتعرض للوسط. هذا التعريب هو في تناقض صارخ مع تلك التي لوحظت في الأجهزة المعوية المستزرعة في ECM. مصفوفة خارج الخلية جزءا لا يتجزأ من organoids ملطخة للنوى (DAPI) ، VILLIN (الشكل 2C)، وZO - 1 (الشكل 2D) تثبت قطبية apicobasal حيث الجانب apical تواجه التجويف من organoid.

مطلوب إزالة كاملة من ECM للحصول على عكس القطبية كفاءة من organoids المعوية. أحيانا، جزء من organoids وجدت في الثقافات تعليق محاطة مخلفات ECM، يظهر مورفولوجيا الكيسية التي تشير إلى فشل في انعكاس القطبية من الظهارة (الشكل التكميلي 2A). تحليل تلطيخ immunofluorescent ، التي أجريت على هذه organoids ، ويقدم دليلا على موقف القاعدية من النوى (DAPI) على طول الظهارة والتعبير عن ZO - 1 في الجانب apical التي تواجه تجويف الجهازية (الشكل التكميلي 2B) مما يؤكد أن إزالة ECM غير مكتملة يسبب الاحتفاظ القطبية apicobasal بطريقة مماثلة لأجهزة الجهاز المدمجة ECM.

البروتوكول لإنشاء الثقافات أحادية الطبقة المعوية النتائج في ثقافة أحادية الطبقة التقاء في غضون 7 أيام من البذر والثقافة سوف تصل في كثير من الأحيان التقاء في غضون أقل من 2-3 أيام. أحد المحددات الرئيسية للنجاح هو عدد ونوعية الخلايا المستخدمة لزرع أحادي الطبقة. الشكل 3A، لوحة اليسار يقدم مثالا على كثافة البذر المثالي من حوالي 150،000 الخلايا في إدراج غشاء غشاء خلية 6.5 ملم. هذا الرقم غير ثابت ويمكن أن يكون متغيرا للغاية استنادا إلى المتبرع وجودة ثقافة المصدر العضوي؛ لذلك، يجب تحسين رقم الخلية استنادا إلى هذه المتغيرات. إذا كانت كثافة البذر منخفضة جدا، أو ذات جودة رديئة(الشكل 3A،لوحة الحق)، قد لا يكون هناك ما يكفي من المرفقات لتشكيل ثقافة أحادية الطبقة التقاء.

مرة واحدة يتم تأسيس monolayer (الشكل 3B)، تشكل الخلايا تقاطعات ضيقة، وخلق مظهر المرصوفة بالحصى (الشكل 3B، لوحة اليسار). إذا فشلوا في تشكيل monolayerالتقاء ( الشكل 3B، لوحة الحق) ، فإن مظهر monolayer غالبا ما يكون "غير مكتمل" ، مع مناطق ذات نوعية جيدة مرفق الخلية ، ولكن مع وجود فجوات أكبر بين هذه المناطق. ولا توفر هذه الثقافات حاجزا وظيفيا بين المقصورتين القاعدية والأقفوية ولا تصلح للمقاايسات الموصوفة. يوجه أحادي الطبقة الملتقى حدود الفرشاة المحتوية على VILLIN نحو الجانب apical من الظهارة ، مع نواته المتمركزة نحو القطب القاعدي للخلية(الشكل 4B). بين الخلايا، تتشكل تقاطعات بين الخلايا تتكون من مجمعات متعددة البروتين، بما في ذلك ZO-1 (الشكل 4B). وجودهم هو المفتاح لتوفير وظيفة الحاجز للثقافة الظهارية.

مرة واحدة التقاء، والانتقال إلى ثقافة ALI يحفز مزيد من التفريق بين الثقافة(الشكل 3C). تظهر خلايا صغيرة مستديرة وتبدو الطبقة الأحادية نفسها ذات مظهر أكثر طيا. على الرغم من وجود خلايا الكؤوس داخل ظهارة الثقافة المغمورة (الشكل 4A) ، إلا أنها أكثر بروزا بعد تمايز ALI. خلايا الكؤوس الموجودة داخل المخاط إفراز الظهارة، مما يؤدي إلى ظهور ضبابي على الجزء العلوي من الظهارة. يمكن تصور خلايا الكؤوس والمخاط المفرز عن طريق تلطيخ بروتين الموسين المفرز ، MUC2 (الشكل 4A، C و D) ويمكن قياس الزيادة في عدد خلايا الكؤوس بزيادة في التعبير MUC2 (الشكل التكميلي 3A). ليس من الضروري إزالة هذه الطبقة المخاطية الشبيهة بالجل وسوف تلتصق بسطح الظهارة وتظل تتبع الغسل المتكرر. إذا كان الإزالة ضرورية، فإن غسل الثقافة بمجمع مخاطي، مثل 10 mM N-أسيتيل سيستين أو 50 ميكروغرام/مل DTT يزيل المخاط الزائد. بالإضافة إلى الزيادة في عدد خلايا الكؤوس ، تزيد واجهة ALI أيضا من وجود خلايا الغدد الصماء المعوية (كما هو مبين في تعبير CHGA) (الشكل التكميلي 3B) والخلايا المعوية الناضجة (كما هو مبين في تعبير KRT20) (الشكل التكميلي 3C).

صورة مجهرية لمجاميع الخلايا والخلايا المفردة ، مما يسلط الضوء على التركيب الخلوي في البحث.
الشكل 1: مراحل من الجيل العضوي المعوي apical التدريجي. (أ) صور تمثيلية لقبة ذات عضويات من الحجم المطلوب في اليوم الرابع (اللوحة اليسرى، شريط المقياس = 500 ميكرومتر). الأجهزة العضوية هي رقيقة الجدران، مع مقصورة مضيئة مفتوحة (لوحة الحق، شريط مقياس = 100 ميكرومتر). (ب) صورة تمثيلية لبخير مع تجميع واسع النطاق بعد 3 أيام في التعليق (لوحة اليسار، شريط مقياس = 200 ميكرومتر). صورة لشظايا الكتلة مباشرة بعد القص (اللوحة اليمنى، شريط المقياس = 200 ميكرومتر). (ج) صورة تمثيلية من organoids المعوية في القبة في اليوم 7. عرض Organoids التجويف الموسعة مع تشكيل براعم صغيرة على الجانب القاعدي من الظهارة (التكبير 20x اليسار، التكبير 100x الحق من المنطقة ملحوظ، شريط مقياس = 200 ميكرومتر). (د) صورة تمثيلية من organoids المعوية بعد إزالة ECM وثقافة التعليق اللاحقة لمدة 5 أيام. تحصل الأجهزة العضوية على مورفولوجيا كثيفة مع ظهارة سميكة وتعرض جانبها القردي للوسط. (التكبير 20x اليسار، التكبير 100x الأيمن للمنطقة ملحوظ، شريط مقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفحص المجهري المناعي الفلوري. الأنسجة الظهارية علامات DAPI و Villin و E-Cadherin و ZO-1 ؛ تقاطعات الخلايا.
الشكل 2: تلطيخ immunofluorescent لعلامات قطبية الخلية في organoids المعوية. Apical التدريجي (A, B), وapical في (C, D) كانت ملطخة organoids المعوية المنحى مع علامات apical ZO-1 وVILLIN, ومع علامة الظهارية E-CADHERIN (أحمر). تم استخدام DAPI (الأزرق) لتصور النوى. تعرض اللوحات اليسرى الصور التي تم التقاطها عند تكبير 25x وتعرض الألواح اليمنى صورا لأجهزة عضوية مختلفة بتكبير 63x (تعرض اللوحة C فقط تكبيرا 25x و63x لنفس الجهاز). (أ)الأجهزة العضوية المعوية Apical التدريجي ملطخة VILLIN (الأخضر) وE-CADHERIN (أحمر) تشير إلى تعرض الجانب apical إلى المتوسط. (ب)الأجهزة المعوية Apical التدريجي ملطخة ZO-1 (الأخضر) وE-CADHERIN (أحمر) تظهر وجود تقاطعات ضيقة وانعكاس القطبية apicobasal. (ج) ماتريجل جزءا لا يتجزأ من الجهازية المعوية ملطخة VILLIN (الأخضر) وE-CADHERIN (أحمر) تظهر الجانب apical التي تواجه التجويف organoid. (د) الأجهزة العضوية المعوية المضمنة في Matrigel الملطخة ب ZO-1 (الأخضر) وE-CADHERIN (الأحمر) مما يشير إلى وجود تقاطعات ضيقة apical تواجه تجويف الجهاز. (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). كانت ملطخة Organoids من قبل immunofluorescence وصورت باستخدام البروتوكولات المنشورة سابقا24،25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صور مجهرية لمزارع الخلايا A و B و C ؛ أنماط نمو الخلايا ، التحليل المورفولوجي.
الشكل 3: إنشاء الثقافات أحادية الطبقة المعوية. (أ) صورة تمثيلية من organoids 3D بعد العلاج مع 0.05٪ تريبسين-EDTA. يتم فصل الأجهزة العضوية إلى خلايا واحدة أو كتل خلايا صغيرة استعدادا لثقافات البذر أحادي الطبقة. اللوحة اليسرى: مثال على كثافة البذر المثلى لثقافة أحادية الطبقة، حوالي 150,000 خلية لكل 100 ميكرولتر في إدراج غشاء زراعة الخلية مقاس 6.5 مم. اللوحة اليمنى: مثال لكثافة البذر دون المستوى الأمثل عند 50,000 < خلية لكل 100 ميكرولتر في إدراج غشاء غشاء زراعة الخلية مقاس 6.5 مم. (ب) صورة مشرقة ممثل ثقافة أحادية الطبقة المغمورة. اللوحة اليسرى: طبقة التقاء 100٪ مع مظهر حصى مميز. لوحة الحق: ما يقرب من 50٪ أحادية التقاء. الفجوات التي شوهدت في طبقة واحدة (المشار إليها بخط متقطع) وثيقة مع مرور الوقت بسبب استمرار انتشار الخلايا الجذعية المعوية. (ج) صورة ممثل brightfield ثقافة علي متباينة في 7 أيام. (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صور المجهر متحد البؤر ؛ علامات الخلايا الظهارية DAPI و MUC2 و VILLIN و ZO-1 و E-Cadherin.
الشكل 4: تلطيخimmunofluorescent لعلامات الخلية المتمايزة في ثقافات أحادية الطبقة. (A)صورة Z-كومة من تلطيخ immunofluorescent لثقافة أحادية الطبقة المغمورة لبروتين الموسين MUC2 ، مما يشير إلى وجود خلايا كؤوس داخل ثقافة أحادية الطبقة (الأخضر = MUC2 ، الأزرق = DAPI). (ب) Z-كومة صورة من تلطيخ immunofluorescent من monolayer المغمورة. VILLIN تلطيخ (الأخضر) على طول نهاية apical من الظهارة يشير إلى وجود حد فرشاة وZO-1 تلطيخ (أحمر) يشير إلى وجود تقاطعات ضيقة بين الخلايا (الأزرق = DAPI). (C) Z-كومة صورة من تلطيخ immunofluorescent من ثقافة أحادية الطبقات علي المتمايزة لبروتين الموسين MUC2، مما يدل على وجود عدد أكبر بكثير من الخلايا الكؤوس داخل ثقافة أحادية الطبقة ALI (الأخضر = MUC2، الأزرق = DAPI). (د)Cryosection من ثقافة أحادية الطبقة علي المتمايزة، ملطخة لوجود MUC2 (الأخضر) وE-CADHERIN (الأحمر) مما يدل على وجود خلايا كؤوس في الظهارة وإفراز المخاط على طول الجانب apical من ثقافة أحادية الطبقة. (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). كانت ملطخة الثقافات أحادية الطبقة من قبل immunofluorescence وصورت باستخدام البروتوكولات المنشورة سابقا26،27. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: طيف من الأنماط الظاهرية للعضوية المعوية apical-out في تعليق الثقافة. (A, B, C) صور تمثيلية إضافية من مورفولوجيا الجهازية المعوية التي تم الحفاظ عليها في التعليق بعد 5 أيام من إزالة ECM. القطبية العضوية قد انقلبت. أصبحت الأجهزة العضوية أكثر كثافة مع ظهارة سميكة والجانب apical من organoids تواجه الخارج. Organoids يمكن أن تظهر مجموعة متنوعة من مورفولوجيا: ممدود (A), الكيسي (ب), وغير منتظم (C). (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تفشل الأجهزة العضوية المعوية في عكس القطبية في وجود مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتبقية المتوسطة في ثقافات التعليق. (أ) صورة تمثيلية لإزالة ECM غير مكتملة وعدم عكس القطبية من organoids. بقايا Matrigel موجودة حول organoids وتساهم في الحفاظ على قطبية الظهارة الموجهة apical في. تظهر الأجهزة العضوية مورفولوجيا كيسية مع ظهارة رقيقة تحيط بالتجويف (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). (ب) صورة تمثيلية لعضو غير مقلوب موجود في ظروف ثقافة التعليق. يتم وضع النوى (الأزرق = DAPI) وE-CADHERIN (الأحمر) إلى الجانب القاعدي ، يتم التعبير عن ZO-1 (الأخضر) إلى الجانب apical الذي يواجه تجويف الجهاز. (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: التعبير الجيني لعلامات الخلايا المتمايزة في ثقافات الطبقة الواحدة. (A, B, C) التعبير عن MUC2، CHGA، و KRT20 في ثقافة أحادية الطبقة المغمورة والمتمايزة ALI ولدت في التمايز العضوي المعوي المتوسط نسبة إلى ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد نمت مع توسيع الجهاز المعوي المتوسطة المنشأة عبر qPCR. إنشاء ثقافة أحادية الطبقة المغمورة يزيد من التعبير عن كل علامة الخلية المتمايزة; ومع ذلك، التمايز كثقافة ALI يزيد التعبير عن كل علامة أضعافا مضاعفة. أشرطة الخطأ = +/- SEM. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

أدوات ثقافة أحادية الطبقاتعدد الآبار من الأجهزة العضوية المعوية إلى الحصاد (من قبة 50 ميكرولتر / لكل بئر ليتم بذرها)
إدراج ترانسويل 6.5 مم1 - بئران
إدراج ترانسويل 12 مم3 - 4 آبار
6-لوحة جيدا6 - 8 آبار
24-لوحة جيدا3 - 4 آبار
لوحة 96 جيدا1 - بئران

الجدول 1: عدد آبار الأجهزة العضوية المعوية التي يمكن حصادها لمختلف الأواني الثقافية

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت نماذج الجهازية الظهارية منصات قوية التي يمكن استخدامها لنموذج تنظيم الأنسجة، وتطور المرض، وتحديد العلاجات23،28،29. وقد أضاف الميكرويات العضوية قيمة لقدرة الأجهزة العضوية على نمذجة الأمراض المعدية لأنها تسمح بالتفاعل الممرض مع الجانب apical من الظهارة المضيفة. وقد أدى التقدم الأخير في تقنيات الحقن الدقيق إلى تحسين سرعة الحقن في الأجهزة العضوية وحققت معدلا يصل إلى 90 عضوا عن طريق الحقن في الساعة. تم الحفاظ على وظيفة الحاجز في organoids حقنها ، وتركيز الأكسجين المنخفض داخل التجويف يسمح للبقاء على قيد الحياة من البكتيريا حقن إلزامية اللاهوائية30. ومع ذلك، فقد لاحظت الدراسات وجود التغايرية في السكان organoid داخل نفس البئر. وقد لوحظت هذه الاختلافات في حجم وشكل31، ومستويات التعبير عن الجينات الرئيسية32، فضلا عن معدلات الانتشار33. الاستجابات التفاضلية داخل نفس السكان organoid لمركبات مثل فورسكولين وPGE2، أو لسم الكوليرا، كما وصفت28،33. تسلط هذه النتائج الضوء على الحاجة إلى أعداد كبيرة من الأعضاء العضوية في الدراسات وتحد من استخدام الحقن الإنارة.

تقوم الثقافة العضوية التقليدية على تغليف وانتشار الأجهزة العضوية في الهيدروجيل. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الهيدروجيلات قيودا على الانتشار وإدخال تدرجات التركيز، والتي يمكن أن تزيد من التغايرية34. وعلاوة على ذلك، تم توثيق تباين كبير، ليس فقط بين الثقافات والمانحين ولكن أيضا في إطار ظروف تجريبية فردية. مصدر المانحة، والخصائص الكيميائية الحيوية للهيدروجيل، والتغايرية الجوهرية للعضوية كنظام ثقافة هي عوامل هامة يمكن أن تزيد من التباين التجريبي وتحد من استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها في تطبيقات المصب. توفر كلتا الطريقتين الموصوفتين هنا وسيلة بسيطة لكشف الجانب الظهاري ، مما يسمح بنمذجة المركبات ومسببات الأمراض ذات الاهتمام عن طريق إضافتها مباشرة إلى وسيط الثقافة. ويمكن أن يحد الانخفاض في استخدام الهيدروجيل من التباين التجريبي من المصادر التقنية للخطأ.

تحتفظ الأجهزة العضوية المعوية apical-out بالخصائص الرئيسية لنظام النموذج العضوي وقابليتها للتوسع تجعلها أكثر قابلية للمقاايسات عالية الإنتاجية ، مقارنة بالصفة الأحادية 2D. ومع ذلك ، حيث تحتفظ الأجهزة العضوية بهيكلها ثلاثي الأبعاد ، فإن إمكانية الوصول إلى الجانب القاعدي محدودة وقد تعيق الدراسات التي تتطلب الوصول إلى كلا الجانبين في وقت واحد.

لقد أثبتنا أن انعكاس القطبية من الأجهزة العضوية المعوية يعتمد على إزالة فعالة ومطلقة من ECM، مع الحفاظ أيضا على هيكل سليمة من organoids. ساهم كل من استخدام حل التفكك لإزالة ECM والحل المضاد للتمسك لمنع الأجهزة العضوية في الالتزام بالأدوات البلاستيكية في تحسين الكفاءة الإجمالية للبروتوكول الذي نشرته Co و J. Y.وزملاؤها 22، خاصة فيما يتعلق بعدد الأجهزة العضوية التي يتم إنتاجها لتطبيقات المصب.

وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن بروتوكولنا يدعم عكس أكثر كفاءة من organoids أصغر من 250 ميكرومتر واستخدام الأجهزة العضوية أكبر قد يؤدي إلى انخفاض الناتج organoid، وذلك بسبب التجزئة الناجمة عن pipetting. نصائح واسعة تتحمل، مثل تلك المشار إليها في جدول المواد،قد تسمح باستخدام الأجهزة العضوية أكبر. ومع ذلك، نصائح واسعة تتحمل أقل فعالية في تفكك ECM بالمقارنة مع نصائح القياسية بسبب انخفاض القوة الميكانيكية المطبقة. لذلك، قد يلزم تكرار الخطوات 1.2.9-1.2.11 لتعطيل كاف وإزالة كاملة لجميع بقايا تخطيط القلب عند العمل مع الأجهزة العضوية الكبيرة.

يمكن Organoids في تعليق البقاء على قيد الحياة لمدة 2 أسابيع على الأقل. بعد هذه الفترة الزمنية، لاحظنا تغيرات مورفولوجيا وعدد متزايد من موت الخلايا. وجود الخلايا المنتشرة في organoids apical التدريجي22 يسمح لإعادة تأسيس الثقافات العضوية المعوية في apical. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فصل الأجهزة العضوية apical التدريجي لخلايا واحدة وتضمينها في ECM مع الأمعاء Organoid توسيع المتوسطة.

وهناك قيود كثيرا ما تواجه في بروتوكولات تصف إنشاء الأجهزة المعوية في الثقافات تعليق هو توليد المجاميع الكبيرة. وهذا يؤثر على عدة متغيرات مثل الكفاءة، وإعادة إنتاج السمات المورفولوجية، وال نفاذية المركبات، وإشارات الباراكورين. على غرار البروتوكول الذي نشرته شركة، J. Y. وزملاؤه، وهنا نؤكد أن حصلت على انعكاس القطبية من ما لا يقل عن 97٪ من جميع organoids المعلقة دون القص بعد 3 أيام في التعليق. ومع ذلك ، على النقيض من المنشور ، قدمنا خطوة تفكك ميكانيكية من أجل تقليل تكوين المجاميع الكبيرة وزيادة الغلة. وبما أن هذا الإجراء قد يضر ظهارة organoids، ونحن تمديد فترة حضانة organoids لمدة 2 أيام إضافية للسماح الانتعاش ظهارة كاملة وضمان ثقافات ذات جودة عالية لتطبيقات المصب. إدخال التحريض المستمر مع استخدام شاكر حاضنة أو قارورة الدوار يمكن أن تقلل من أحداث الانصهار، والحد من التجزئة، وزيادة الأوكسجين. قد تحافظ هذه النهج البديلة على الثقافات لفترات أطول ، وتقلل من موت الخلايا ، وتسمح بمزيد من التفريق بين الأعضاء المعوية.

إنشاء أحادية أحادية الأبعاد مشتقة من الجهازية يوفر العديد من المزايا والعيوب مقارنة بالأعضاء القطبية المقلوبة. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بإنشاء ثقافة أحادية الطبقة التقاء بسرعة ، عادة ، في أقل من 7 أيام وخيار الحفاظ على الثقافات على المدى الطويل لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى 10 أسابيع). البروتوكول والوسائط المستخدمة هنا تسمح أيضا للتمايز كفاءة من أعداد كبيرة من الخلايا، وليس دائما وجدت في غيرها من الثقافات أحادية الطبقة المستمدة من الجهاز16. إنشاء طبقة واحدة على غشاء إدراج ثقافة الخلية يسمح بالوصول المتزامن إلى كلا الجانبين apical وbasolateral من الظهارة مما يجعلها مثالية للدراسات في سلامة الحاجز والنقل الظهاري. وهذا الوصول المبسط يجعلهم أكثر قابلية لدراسات العدوى والعلاج من المخدرات. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه الثقافات على العديد من الخصائص الفريدة للمتبرع، مع الحفاظ على أهميتها للدراسات الخاصة بالمرضى. تسهل طريقة ثقافة ALI أيضا التفريق بين ظهارة أكثر وظيفية تتكون من أنواع الخلايا الإفرارية والابترازية على حد سواء ، مما يجعلها أكثر تمثيلا لظهارة الأمعاء البشرية. كما أن الاستقرار النسبي لهذه الثقافات يسمح بالحفاظ عليها لفترة طويلة من الزمن، مما يتيح إمكانية إجراء دراسات طويلة الأجل. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذا النهج هي العدد الكبير من الخلايا المطلوبة لإنشاء طبقة أحادية التقاء والحاجة إلى الحفاظ على التقاء كامل ليكون فصل وظيفي بين الدوائر apical و basolateral. كما يتم فقدان بنية سرداب مميزة ، والتي يمكن أن تكون على غرار الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد عند إنشاء ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن الشكل الصديق تجريبيا للثقافة وسهولة الوصول إلى الجانبين apical وbasolateral من الظهارة ، يجعلها أداة قوية لدراسة فسيولوجيا الأمعاء.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G. S., W.C, و S. S. هم موظفون في STEMCELL تكنولوجيز المحدودة, كامبريدج (المملكة المتحدة). م. س. و. إ. و س. ل. و أ. إ. و ر. ك.C هم موظفون في شركة STEMCELL Technologies Inc. في فانكوفر (كندا).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من خلال منحة أفق 2020 OrganoVIR 812673 على مشروع Organoids لأبحاث الفيروسات - وهو برنامج مبتكر للتدريب و ITN.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حل الشطف المضاد للالتصاقSTEMCELL Technologies Inc.7010لطلاء الأواني الثقافية. يشار إليه باسم الحل المضاد للالتصاق في النص الرئيسي.
أنابيب مخروطية ، 15 ملSTEMCELL Technologies Inc.38009
مصفوفة كورنينج ماتريجل ، عامل النمو المخفض (GFR) ،كورنينج356231الخلية الخالية من الفينول (ECM) لصيانة وإنشاء الخطوط العضوية.
Costar 6.5 مم أو 12 مم Transwell يدرجSTEMCELL Technologies Inc.38023/38024لثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد.
كوستار 24 Well  صفيحة مسطحة القاع ومعالجة بزراعة الأنسجةSTEMCELL Technologies Inc.38017لصيانة وإنشاء خطوط عضوية.
D-PBS (بدون Ca ++ و Mg ++) STEMCELLTechnologies Inc.37350للغسيل 
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Millipore SigmaD2650إعادة تكوين الجزيئات الصغيرة
DMEM / F-12 مع 15 ملي متر من HEPESSTEMCELL TECHNOLOGIES INC.36254لغسل
كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR)شركة STEMCELL Technologies Inc.7174لإزالة Matrigel. يشار إليه باسم كاشف التفكك في النص الرئيسي.
وسط نمو الوحدات العضوية المعوية (الإنسان)شركة STEMCELL Technologies Inc.6010لتوسيع الخطوط العضوية قبل التمايز. يشار إليه باسم وسيط التمدد العضوي المعوي في النص الرئيسي.
التمايز العضوي المعوي (الإنسان)شركة STEMCELL Technologies Inc.100-0214لإنشاء الطبقات الأحادية والتمايز ثلاثي الأبعاد. يشار إليه باسم وسيط التمايز العضوي المعوي في النص الرئيسي.
التربسين EDTA (0.05٪) شركةSTEMCELL Technologies Inc.7910لتأسيس 2D أحادية الطبقة.
Y-27632شركة STEMCELL Technologies Inc.72302مثبط مسار RHO / ROCK ، يثبط ROCK1 و ROCK2. تستخدم لتأسيس أحادي الطبقة 2D.
نصائح التجويف العريضةCorning#TF-1005-WB-R-Sالتعامل مع العضويات
مصفوفة خارج وسط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888(2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147(2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498(2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479(2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal OrganoidsApical Out OrganoidsOrganoid MonolayersEpithelial PolarityExtracellular Matrix RemovalPolarity InversionAir Liquid InterfaceTight JunctionsNutrient AbsorptionHost Pathogen Interactions

Related Articles