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Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

STEMCELL Technologies Inc.

&#x5C0F;&#x9F20;&#x80DA;&#x80CE;&#x7B2C;&#x5341;&#x56DB;&#x5929;&#x6216; E14 &#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE; (&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF09;&#xFF0C;&#x9996;&#x6B21;&#x5206;&#x79BB;&#x548C;&#x5B9A;&#x6027;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5728;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x662F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x81EA;&#x6211;&#x66F4;&#x65B0;&#x80FD;&#x529B;&#x7684;&#x552F;&#x4E00;&#x4EBA;&#x53E3;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x4EA7;&#x751F;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x540E;&#x4EE3;&#x80FD;&#x591F;&#x5206;&#x5316;&#x6210;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8868;&#x578B;-&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x3001; &#x661F;&#x5F62;&#x80F6;&#x8D28;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5728;&#x6210;&#x5E74;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF; (CNS) &#x4E2D;&#x53D1;&#x73B0;&#x5C11;&#x7A81;&#x80F6;&#x8D28;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x5B9A;&#x4E49;&#x65E0;&#x8840;&#x6E05;&#x57F9;&#x517B;&#x57FA;&#xFF0C;&#x8F85;&#x4E4B;&#x4EE5;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50; (EGF) &#x7528;&#x4E8E;&#x7EF4;&#x6301;&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x96C6;&#x7FA4;&#x7684;&#x7A97;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A;&#x7403;&#x5185;&#xFF0C;&#x51E0;&#x4E2A;&#x6587;&#x5316;&#x901A;&#x9053;&#x672A;&#x5206;&#x5316;&#x72B6;&#x6001;&#x3002;&#x5F53;&#x5220;&#x9664;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x548C;&#x8840;&#x6E05;&#x6DFB;&#x52A0;&#x5230;&#x4ECB;&#x8D28;&#x65F6;&#xFF0C;&#x5B8C;&#x597D;&#x6216;&#x6E38;&#x79BB;&#x795E;&#x7ECF;&#x7403;&#x5206;&#x5316;&#x4E3A;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8868;&#x578B;&#x3002;&#x672C;&#x7AE0;&#x6982;&#x8FF0;&#x4E86;&#x975E;&#x5E38;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5E76;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E00;&#x4E9B;&#x66F4;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#x7EC6;&#x8282;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6765;&#x5B9E;&#x73B0;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#x7684;&#x6587;&#x5316;&#x3002;

&#x4EE3;&#x548C;&#x7403;&#x4ECE;&#x5C0F;&#x9F20;&#x80DA;&#x80CE;&#x7B2C;&#x5341;&#x56DB;&#x5929;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x7684;&#x5206;&#x5316;&#x3002;

Murine embryonic day 14 or E14 neural stem cells (NSCs), first isolated and characterized as a stem cell in culture, are a unique population of cells capable of self-renewal. In addition, they produce a large number of progeny capable of differentiating into the three primary phenotypes-neurons, astrocytes, and oligodendrocytes-found in the adult mammalian central nervous system (CNS). A defined serum-free medium supplemented with epidermal growth factor (EGF) is used to maintain the NSCs in an undifferentiated state in the form of clusters of cells, called neurospheres, for several culture passages. When EGF is removed and serum added to the medium, the intact or dissociated neurospheres differentiate into the three primary CNS phenotypes. This chapter outlines the simple NSC culture methodology and provides some of the more important details of the assay to achieve reproducible cultures.

Generation and differentiation of neurospheres from murine embryonic day 14 central nervous system tissue.

Murins embryonnaires jour 14 ou E14 cellules souches neurales (CSN), d&#x26;#39;abord isol&#xE9; et caract&#xE9;ris&#xE9; comme une cellule souche dans la culture, sont une population unique de cellules capables d&#x26;#39;auto-renouvellement. En outre, ils produisent un grand nombre de descendants capables de se diff&#xE9;rencier dans les trois primaires ph&#xE9;notypes des neurones, les astrocytes, oligodendrocytes et retrouv&#xE9;e dans le syst&#xE8;me nerveux des mammif&#xE8;res adultes central (SNC). A d&#xE9;fini un milieu sans s&#xE9;rum compl&#xE9;t&#xE9; avec un facteur de croissance &#xE9;pidermique (EGF) est utilis&#xE9; pour maintenir les CNS dans un &#xE9;tat indiff&#xE9;renci&#xE9; sous la forme d&#x26;#39;amas de cellules, appel&#xE9;es neurosph&#xE8;res, pour plusieurs passages en culture. Lorsque l&#x26;#39;EGF est enlev&#xE9; et le s&#xE9;rum ajout&#xE9; au milieu, des neurosph&#xE8;res intactes ou dissoci&#xE9;e diff&#xE9;rencier en les trois ph&#xE9;notypes SNC primaires. Ce chapitre d&#xE9;crit la m&#xE9;thode de culture simple, NSC et fournit quelques-uns des d&#xE9;tails les plus importants de l&#x26;#39;essai pour atteindre cultures reproductibles.

G&#xE9;n&#xE9;ration et diff&#xE9;renciation des Neurosph&#xE8;res de Murine Jour 14 embryonnaire des tissus du syst&#xE8;me nerveux central

Generierung und Differenzierung von Neurosph&#xE4;ren aus murinen embryonalen Tag 14 Gewebe des zentralen Nervensystems.

Murino embrionale giorno 14 o E14 cellule staminali neurali (NSCs), in primo luogo isolato e caratterizzato come una cellula staminale nella cultura, sono un&#39;unica popolazione di cellule in grado di auto-rinnovamento. Inoltre, essi producono un gran numero di progenie in grado di differenziare in tre principali fenotipi-neuroni, astrociti e oligodendrociti-trovato il nervoso sistema centrale dei mammiferi adulti (CNS). Un definita serum-free medium supplementato con fattore di crescita epidermico (EGF) viene utilizzato per mantenere il NSCs in uno stato indifferenziato in forma di ammassi di cellule, chiamate neurospheres, per diversi passaggi di cultura. Quando EGF &egrave; rimosso e siero aggiunto al medium, la neurospheres intatto o dissociata differenziarsi nelle tre fenotipi CNS primari. Questo capitolo illustra la metodologia di cultura NSC semplice e fornisce alcuni dettagli pi&ugrave; importanti del dosaggio per ottenere colture riproducibile.

Generazione e la differenziazione dei neurospheres dal tessuto del sistema nervoso centrale murino embrionale giorno 14.

&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x80DA;&#x6027;14&#x65E5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;E14&#x795E;&#x7D4C;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#xFF08;NSC&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x5358;&#x96E2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x57F9;&#x990A;&#x4E2D;&#x306E;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x306F;&#x3001;&#x81EA;&#x5DF1;&#x8907;&#x88FD;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x96C6;&#x56E3;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;3&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;-&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x3001;&#x30A2;&#x30B9;&#x30C8;&#x30ED;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x5206;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5B50;&#x5B6B;&#x3092;&#x5927;&#x91CF;&#x306B;&#x751F;&#x7523;&#x3057;&#x3001;&#x6210;&#x4F53;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#xFF08;CNS&#xFF09;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30C7;&#x30F3;&#x30C9;&#x30ED;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;EGF&#xFF09;&#x3092;&#x6DFB;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x7121;&#x8840;&#x6E05;&#x57F9;&#x5730;&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x6587;&#x5316;&#x306E;&#x901A;&#x8DEF;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5F62;&#x3067;&#x3001;&#x672A;&#x5206;&#x5316;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;NSC&#x306E;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; EGF&#x3092;&#x9664;&#x53BB;&#x3057;&#x3001;&#x8840;&#x6E05;&#x3092;&#x57F9;&#x5730;&#x306B;&#x6DFB;&#x52A0;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x3001;&#x7121;&#x50B7;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x89E3;&#x96E2;&#x795E;&#x7D4C;&#x306F;3&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x306B;&#x5206;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7AE0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;NSC&#x57F9;&#x990A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8AD6;&#x3092;&#x6982;&#x8AAC;&#x3057;&#x3001;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x6587;&#x5316;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x8A73;&#x7D30;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x80DA;14&#x65E5;&#x76EE;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#x7D44;&#x7E54;&#x304B;&#x3089;&#x4E16;&#x4EE3;&#x3078;&#x3068;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A2;&#x306E;&#x5206;&#x5316;

Murine &#xBC30;&#xC544; &#xD558;&#xB8E8; 14 &#xB610;&#xB294; E14 &#xC2E0;&#xACBD; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; (NSCs) &#xBA3C;&#xC800; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418; &#xACE0; &#xBB38;&#xD654;, &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC;&#xB85C; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC740; &#xC140; &#xC790;&#xAE30; &#xAC31;&#xC2E0;&#xC758; &#xC218;&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xC778;&#xAD6C;. &#xB610;&#xD55C;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xB9CE;&#xC740; &#xC790;&#xC190;&#xC5D0;&#xB294; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xAE30;&#xBCF8; &#xACE0;&#xAE30;-&#xB274;&#xB7F0; &#xC774;&#xB2E4;, &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xBC0F; oligodendrocytes &#xC131;&#xC778; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC911;&#xC559; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; (CNS)&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; (EGF)&#xC640; &#xBCF4;&#xCDA9; &#xC815;&#xC758; &#xB41C; &#xD608; &#xCCAD; &#xBB34;&#xB8CC; &#xB9E4;&#xCCB4;&#xB294; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; undifferentiated &#xAD6D;&#xAC00;&#xC758; &#xC140;, neurospheres, &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBB38;&#xD654; &#xD1B5;&#xB85C; &#xB77C;&#xB294; Nscs&#xB97C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. EGF &#xC81C;&#xAC70; &#xD558; &#xACE0; &#xD608; &#xCCAD; &#xB9E4;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xCD94;&#xAC00;, &#xADF8;&#xB300;&#xB85C; &#xB610;&#xB294; &#xCC9C;&#xC5F0; neurospheres 3 &#xC8FC; CNS &#xACE0;&#xAE30;&#xB85C; &#xBD84;&#xD654;. &#xC774; &#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; NSC &#xBB38;&#xD654; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860;&#xC5D0; &#xAC04;&#xB7B5;&#xD558;&#xAC8C; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xC7AC;&#xD604;&#xD560; &#xC218; &#xBB38;&#xD654;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xB354; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB0B4;&#xC6A9;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC138;&#xB300;&#xC640; murine &#xBC30;&#xC544; &#xD558;&#xB8E8; 14 &#xC911;&#xC559; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; neurospheres&#xC758; &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654;.

Murinas embrionarias d&#xED;a 14 o E14 c&#xE9;lulas madre neurales (NSC), primero aisladas y caracterizadas como c&#xE9;lulas madre en la cultura, son una poblaci&#xF3;n &#xFA;nica de c&#xE9;lulas capaces de auto-renovaci&#xF3;n. Adem&#xE1;s, producen un gran n&#xFA;mero de progenie capaz de diferenciarse en los tres fenotipos primarios de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos-encontrado en el adulto de mam&#xED;feros sistema nervioso central (SNC). A definida medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epid&#xE9;rmico (EGF) se utiliza para mantener las NSCs en un estado indiferenciado en forma de racimos de c&#xE9;lulas, llamadas neuroesferas, por pasajes de cultivo varios. Cuando EGF se elimina y el suero a&#xF1;adido al medio, las neuroesferas intactas o disociado se diferencian en los tres fenotipos primarios del SNC. En este cap&#xED;tulo se describe la metodolog&#xED;a sencilla NSC cultura y ofrece algunos de los detalles m&#xE1;s importantes de la prueba para alcanzar las culturas reproducibles.

Generaci&#xF3;n y diferenciaci&#xF3;n de las neuroesferas del d&#xED;a embrionario 14 murino tejido del sistema nervioso central

Advancement in our understanding of the biology of adult stem cells and their therapeutic potential relies heavily on meaningful functional assays that can identify and measure stem cell activity in vivo and in vitro. In the mammalian nervous system, neural stem cells (NSCs) are often studied using a culture system referred to as the neurosphere assay. We previously challenged a central tenet of this assay, that all neurospheres are derived from a NSC, and provided evidence that it overestimates NSC frequency, rendering it inappropriate for quantitation of NSC frequency in relation to NSC regulation. Here we report the development and validation of the neural colony-forming cell assay (NCFCA), which discriminates stem from progenitor cells on the basis of their proliferative potential. We anticipate that the NCFCA will provide additional clarity in discerning the regulation of NSCs, thereby facilitating further advances in the promising application of NSCs for therapeutic use.

Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.

&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x7684;&#x6210;&#x4EBA;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x6CBB;&#x7597;&#x6F5C;&#x80FD;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x8FDB;&#x5C55;&#x4E25;&#x91CD;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x6709;&#x610F;&#x4E49;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x6027;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x548C;&#x8861;&#x91CF;&#x4F53;&#x5185;&#x548C;&#x4F53;&#x5916;&#x7684;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x4E2D;&#x67A2;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3001; &#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE; (&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;) &#x7ECF;&#x5E38;&#x7814;&#x7A76;&#x4F7F;&#x7528;&#x79F0;&#x4E3A;&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7684;&#x6587;&#x5316;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5148;&#x524D;&#x8D28;&#x7591;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x6240;&#x6709;&#x7403;&#x5185;&#x662F;&#x6765;&#x81EA;&#x56FD;&#x5BB6;&#x5B89;&#x5168;&#x59D4;&#x5458;&#x4F1A;&#x548C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x8BC1;&#x636E;&#xFF0C;&#x5B83;&#x9AD8;&#x4F30; NSC &#x9891;&#x7387;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#x5B97;&#x65E8;&#x5448;&#x73B0;&#x5B83;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5B9A; NSC &#x9891;&#x7387; NSC &#x7BA1;&#x5236;&#x4E0D;&#x5F53;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x548C;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x96C6;&#x843D;&#x5F62;&#x6210;&#x7EC6;&#x80DE;&#x68C0;&#x6D4B; (NCFCA)&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5E72;&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x589E;&#x6B96;&#x6F5C;&#x80FD;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x4E0A;&#x7684;&#x6B67;&#x89C6;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9884;&#x8BA1; NCFCA &#x5C06;&#x63D0;&#x4F9B;&#x989D;&#x5916;&#x6E05;&#x6670;&#x8FA8;&#x8BC6;&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x89C4;&#x7BA1;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8FDB;&#x5C55;&#x6709;&#x524D;&#x9014;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6CBB;&#x7597;&#x4F7F;&#x7528;&#x7533;&#x8BF7;&#x3002;

&#x795E;&#x7ECF;&#x5E72;&#x548C;&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x795E;&#x7ECF;&#x7684;&#x96C6;&#x843D;&#x5F62;&#x6210;&#x7EC6;&#x80DE;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x679A;&#x4E3E;&#x3002;

Progr&#xE8;s dans notre compr&#xE9;hension de la biologie des cellules souches adultes et leur potentiel th&#xE9;rapeutique repose largement sur des analyses fonctionnelles significatives qui permettent d&#x26;#39;identifier et de mesurer l&#x26;#39;activit&#xE9; sur les cellules souches in vivo et in vitro. Dans le syst&#xE8;me nerveux chez les mammif&#xE8;res, les cellules souches neurales (NNC) sont souvent &#xE9;tudi&#xE9;s en utilisant un syst&#xE8;me de culture d&#xE9;nomm&#xE9; dosage neurosph&#xE8;res. Nous avons d&#xE9;j&#xE0; contest&#xE9; un principe central de cet essai, que tous les neurosph&#xE8;res sont issus d&#x26;#39;un NSC, et fourni des preuves qu&#x26;#39;elle surestime la fr&#xE9;quence NSC, le rendant inappropri&#xE9; pour la quantification de la fr&#xE9;quence par rapport &#xE0; NSC NSC r&#xE9;glementation. Nous rapportons ici le d&#xE9;veloppement et la validation du test sur des cellules formant des colonies de neurones (NCFCA), qui est discriminatoire &#xE0; partir de cellules prog&#xE9;nitrices souches sur la base de leur potentiel prolif&#xE9;ratif. Nous pr&#xE9;voyons que le NCFCA fournira plus de clart&#xE9; dans le discernement de la r&#xE9;glementation de la CSN, facilitant ainsi de nouveaux progr&#xE8;s dans l&#x26;#39;application prometteuse de NNC pour une utilisation th&#xE9;rapeutique.

D&#xE9;nombrement des souches neurales et cellules prog&#xE9;nitrices dans le test cellulaire de neurones formant colonie

Fortschritt im Verst&auml;ndnis der Biologie der adulten Stammzellen und ihr therapeutisches Potential beruht stark auf sinnvolle funktionale Assays, die identifizieren und Stammzell-Aktivit&auml;t in vivo und in vitro zu messen k&ouml;nnen. S&auml;ugetier-Nervensystems studierte neuraler Stammzellen (NSCs) sind oft mit einem Kultursystem als Neurosphere Assays bezeichnet. Wir herausgefordert zuvor eine zentrale Lehre dieser Probe, dass alle Neurospheres von einem NSC abgeleitet, und legte Beweise daf&uuml;r vor, dass es &uuml;bersch&auml;tzt NSC-Frequenz, was es f&uuml;r die quantitative Bestimmung der NSC-Frequenz bei NSC Verordnung ungeeignet. Hier berichten wir die Entwicklung und Validierung von der neuronalen kolonienbildende Zellenprobe (NCFCA), die Stammzellen aus Vorl&auml;uferzellen auf der Grundlage ihrer proliferative Potential benachteiligt werden. Wir erwarten, dass die NCFCA bieten zus&auml;tzliche Klarheit in die Regulierung der NSCs anspruchsvolle, und erleichtert so weiter Fortschritte in die vielversprechende Anwendung der NSCs f&uuml;r therapeutische Zwecke.

Enumeration von Stamm- und Vorl&auml;uferzellen von Nervenzellen in der neuronalen kolonienbildende Zellenprobe.

Progresso nella nostra comprensione della biologia delle cellule staminali adulte e loro potenziale terapeutico si basa pesantemente su significativi saggi funzionali che possono identificare e misurare l&#39;attivit&agrave; delle cellule staminali in vitro e in vivo. Nel sistema nervoso dei mammiferi, le cellule staminali neurali (NSCs) sono spesso studiate utilizzando un sistema di cultura come il saggio neurosphere. Precedentemente abbiamo sfidato un principio centrale di questo saggio, neurospheres tutti sono derivati da un NSC che ha fornito prove che sopravvaluta frequenza NSC, rendendo inadeguato per la quantificazione della frequenza NSC in relazione al regolamento NSC. Qui riportiamo lo sviluppo e la convalida del neural formanti cella dosaggio (NCFCA), che discrimina le staminali da cellule progenitrici sulla base del loro potenziale proliferativo. Possiamo anticipare che il NCFCA fornir&agrave; ulteriore chiarezza nel discernimento del regolamento di NSCs, facilitando in tal modo ulteriori progressi nell&#39;applicazione promettente di NSCs per uso terapeutico.

Enumerazione delle cellule neurali staminali e progenitrici neurali test delle cellule formanti.

&#x6210;&#x4F53;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x306E;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x306E;&#x9032;&#x6B69;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x6CD5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x306F;&#x3001;in vivo&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vitro&#x3067;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x3001;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x6709;&#x610F;&#x7FA9;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x5927;&#x304D;&#x304F;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x795E;&#x7D4C;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#xFF08;NSC&#x306E;&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x3070;&#x3057;&#x3070;&#x795E;&#x7D4C;&#x7403;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x57F9;&#x990A;&#x7CFB;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x7814;&#x7A76;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4EE5;&#x524D;&#x306B;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x304C;NSC&#x306B;&#x7531;&#x6765;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x7684;&#x306A;&#x6559;&#x7FA9;&#x306B;&#x6311;&#x6226;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x304C;NSC&#x898F;&#x5236;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x3066;NSC&#x306E;&#x983B;&#x5EA6;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x4E0D;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C0;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;NSC&#x306E;&#x983B;&#x5EA6;&#x3092;&#x904E;&#x5927;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5897;&#x6B96;&#x80FD;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x304B;&#x3089;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5224;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x795E;&#x7D4C;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x5F62;&#x6210;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#xFF08;NCFCA&#xFF09;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3068;&#x691C;&#x8A3C;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;NCFCA&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6CBB;&#x7642;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;NSC&#x306E;&#x6709;&#x671B;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x3055;&#x3089;&#x306A;&#x308B;&#x9032;&#x6B69;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x3001;NSC&#x306E;&#x76EE;&#x306E;&#x80A5;&#x3048;&#x305F;&#x898F;&#x5236;&#x306B;&#x8FFD;&#x52A0;&#x660E;&#x5FEB;&#x3055;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x671F;&#x5F85;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x795E;&#x7D4C;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x5F62;&#x6210;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x795E;&#x7D4C;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3084;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5217;&#x6319;

&#xC131;&#xCCB4; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC758; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC758; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xD574;&#xC758; &#xBC1C;&#xC804;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xACE0; in vivo &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC758;&#xBBF8; &#xC788;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC758;&#xC874; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC2E0; &#xACBD;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; (NSCs) neurosphere &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xB77C;&#xACE0; &#xD558;&#xB294; &#xBB38;&#xD654; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC790;&#xC8FC; &#xACF5;&#xBD80;&#xB294;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xAD6D;&#xAC00; &#xC548;&#xC804; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xD68C;&#xC758; &#xADDC;&#xC815;&#xC5D0; &#xAD00;&#xD558;&#xC5EC; NSC &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD80;&#xC801; &#xC808; &#xD55C; &#xB80C;&#xB354;&#xB9C1; &#xBAA8;&#xB4E0; neurospheres&#xB294; NSC&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xD558; &#xACE0; NSC &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218;&#xB97C;&#xACFC; &#xB300; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC99D;&#xAC70;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294;&#xC774; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xC911;&#xC559; &#xAD50;&#xB9AC; &#xB3C4;&#xC804;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBC0F; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB294; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC2DD;&#xBBFC;&#xC9C0;&#xB97C; &#xD615;&#xC131; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; (NCFCA) &#xC904;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC99D;&#xC2DD; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC5D0; &#xAE30;&#xCD08; &#xD558; &#xC5EC; &#xCC28;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294;&#xC758;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; NCFCA &#xBD84;&#xBCC4; &#xC788;&#xB294; Nscs&#xC758; &#xADDC;&#xC815;&#xC5D0; &#xCD94;&#xAC00; &#xBA85;&#xD655;&#xC131;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5;&#xD560; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;, &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xCD09;&#xC9C4; &#xCD94;&#xAC00; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC6A9;&#xB3C4;&#xB85C; Nscs&#xC758; &#xC720;&#xB9DD;&#xD55C; &#xC751;&#xC6A9; &#xBC1C;&#xC804; &#xC608;&#xC0C1;.

&#xC2E0;&#xACBD; &#xC2DD;&#xBBFC;&#xC9C0;&#xB97C; &#xD615;&#xC131; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC904;&#xAE30;&#xC640; &#xC870;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC5F4;&#xAC70;.

El avance en nuestra comprensi&#xF3;n de la biolog&#xED;a de las c&#xE9;lulas madre adultas y su potencial terap&#xE9;utico se basa en gran medida en los ensayos funcionales significativas que pueden identificar y medir la actividad de las c&#xE9;lulas madre in vivo e in vitro. En el sistema nervioso de los mam&#xED;feros, las c&#xE9;lulas madre neurales (NSC) se han estudiado usando un sistema de cultivo a que se refiere como el ensayo neuroesfera. Anteriormente hemos desafiado un principio central de este ensayo, que todas las neuroesferas se derivan de un Consejo de Seguridad Nacional, y present&#xF3; pruebas de que se sobrestima la frecuencia Consejo de Seguridad Nacional, lo que hace que no era apropiado para la cuantificaci&#xF3;n de la frecuencia de NSC en relaci&#xF3;n con el Consejo de Seguridad Nacional la regulaci&#xF3;n. Aqu&#xED; se presenta el desarrollo y la validaci&#xF3;n de la prueba de las c&#xE9;lulas neuronales formadoras de colonias (NCFCA), que discrimina se derivan de las c&#xE9;lulas progenitoras en la base de su potencial proliferativo. Anticipamos que el NCFCA proporcionar&#xE1; una mayor claridad en el discernimiento de la regulaci&#xF3;n de los comit&#xE9;s directivos nacionales, facilitando as&#xED; mayores avances en la aplicaci&#xF3;n prometedora de NSCs para uso terap&#xE9;utico.

Enumeraci&#xF3;n de c&#xE9;lulas madre neurales y c&#xE9;lulas progenitoras en el ensayo de c&#xE9;lulas neuronales formadoras de colonias

Recent reports have highlighted several parameters of the neurosphere culture or assay system which render it unreliable as a quantitative in vitro assay for measuring neural stem cell (NSC) frequency. The single-step semi-solid based assay, the Neural Colony Forming Cell (NCFC) assay is an assay which was developed to overcome some of the limitations of the neurospheres assay in terms of accurately measuring NSC numbers. The NCFC assay allows the discrimination between NSCs and progenitors by the size of colonies they produce (i.e. their proliferative potential). The NCFC assay and other improved tissue culture tools offer further advances in the promising application of NSCs for therapeutic use. 

Enumerating stem cell frequency: neural colony forming cell assay.

Although regenerative medicine products are at the forefront of scientific research, technological innovation, and clinical translation, their reproducibility and large-scale production are compromised by automation, monitoring, and standardization issues. To overcome these limitations, new technologies at software (e.g., algorithms and artificial intelligence models, combined with imaging software and machine learning techniques) and hardware (e.g., automated liquid handling, automated cell expansion bioreactor systems, automated colony-forming unit counting and characterization units, and scalable cell culture plates) level are under intense investigation. Automation, monitoring and standardization should be considered at the early stages of the developmental cycle of cell products to deliver more robust and effective therapies and treatment plans to the bedside, reducing healthcare expenditure and improving services and patient care.

Automation, Monitoring, and Standardization of Cell Product Manufacturing.

Research on chronic and acute myeloid leukemia (CML/AML) is focused on the development of novel therapeutic strategies to eliminate leukemic stem/progenitor cells that are responsible for drug resistance and disease relapse. Methods to culture hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from blood or bone marrow samples are indispensable for investigating disease pathogenesis and delineating drug responses in individual patients. A key challenge in this area is that primary leukemic cells grow poorly in culture or rapidly differentiate and lose their hematopoietic potential. Access to patient samples can also be limiting or cell numbers too low to enable large-scale assays and/or to obtain reproducible quantitative data. Here we describe a feeder cell-free and serum-free liquid culture system for the expansion of CD34 HSPCs from CML/AML samples and healthy control tissues. Following 7 or 14 days of culture, CD34 cells are expanded 30- to 65-fold or 400- to 800-fold, yielding a purity of ∼80% and ∼60% CD34 cells, respectively. This system was adapted to a 96-well format to measure the sensitivity of leukemic and normal HSPCs to cytotoxic drugs after only 7 days. The assay requires only 10 cells per well to determine drug IC values and can be performed with uncultured and culture-expanded cells. Importantly, resulting IC values strongly correlate with those obtained in the classic colony-forming unit (CFU) assay. Compared with the CFU assay, this novel 96-well liquid-based assay designed specifically for leukemic and normal HSPCs is faster and simpler, with more flexible readout methods for selecting candidates for further drug development.

Article	Year
Generation and differentiation of neurospheres from murine embryonic day 14 central nervous system tissue. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 15361668	2005
Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem cells (Dayton, Ohio)\| PubMed ID: 18218818	2008
Enumerating stem cell frequency: neural colony forming cell assay. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 23934839	2013
Automation, Monitoring, and Standardization of Cell Product Manufacturing. Frontiers in bioengineering and biotechnology\| PubMed ID: 32766229	2020
Feeder-free and serum-free in vitro assay for measuring the effect of drugs on acute and chronic myeloid leukemia stem/progenitor cells. Experimental hematology\| PubMed ID: 32798646	2020

Sharon Louis

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