يصف هذا البروتوكول منهجية تتبع الخلايا التائية غير الغازية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجسم الحي باستخدام منصة متاحة سريريا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الديناميكي للخلايا التائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية مع [18F] التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني رباعي فلوروبورات / التصوير المقطعي المحوسب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أظهرت الخلايا التائية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR) نتائج غير مسبوقة في التجارب السريرية المحورية للمرضى الذين يعانون من أورام الخلايا البائية الخبيثة أو الورم النقوي المتعدد (MM). ومع ذلك ، فإن العديد من العقبات تحد من فعالية وتحظر الاستخدام الواسع النطاق لعلاجات الخلايا التائية CAR بسبب سوء الاتجار والتسلل إلى مواقع الأورام وكذلك عدم الثبات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن السمية التي تهدد الحياة، مثل متلازمة إطلاق السيتوكين أو السمية العصبية، هي الشواغل الرئيسية. يتيح التصوير الفعال والحساس وتتبع الخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها وتوصيف الجسم الحي ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود الحالية للعلاج بالخلايا التائية CAR. تصف هذه الورقة منهجية دمج سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) في الخلايا التائية CAR والتصوير بالخلايا التائية CAR باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار [18F] رباعي فلوروبورات البوزيترون ([18F]TFB-PET) في النماذج قبل السريرية. يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى والجينات المستهدفة بالإضافة إلى تلك المستخدمة في هذه الدراسة.
المقدمة
العلاج بالخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR T) هو نهج سريع الظهور ويحتمل أن يكون علاجيا في الأورام الخبيثة الدموية1،2،3،4،5،6. تم الإبلاغ عن نتائج سريرية غير عادية بعد العلاج بالخلايا التائية CAR T (CART19) الموجه بواسطة CD19 أو مستضد نضج الخلايا البائية (BCMA) 2. أدى ذلك إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على خلايا CART19 لسرطان الغدد الليمفاوية العدواني للخلايا البائية (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (مايو كلينك)، ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في Mayo Clinic.
1. NIS+ BCMA-CAR إنتاج الخلايا التائية
ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (IRB 17-008762) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC Bios00000006.04).
- إنتاج BCMA-CAR ، NIS ، و LUCIFERASE-GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) - المشفرة lentiviruses.
ملاحظة: تم تصنيع بنية BCMA-CAR من الجيل الثاني من جديد (انظر جدول المواد) واستنساخها إلى ناقل فيروسي من الجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمثل الشكل 1 خطوات توليد الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR. في اليوم 0 ، اعزل PBMCs ثم اعزل الخلايا التائية عن طريق الاختيار السلبي. ثم ، قم بتحفيز الخلايا التائية باستخدام حبات مضادة ل CD3 / CD28. في اليوم 1 ، قم بتحويل الخلايا التائية مع كل من NIS و BCMA-CAR lentiviruses. في الأيام 3 و 4 و 5 ، عد الخلايا التائية وتغذيتها بالوسائط لضبط التركيز ليكون 1.0 × 106 / مل. بالنسبة للخلايا التائية المحولة من NIS، أضف 1 ميكروغرام/مل من البيروميسين لتحديد خلايا +NIS. في الي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف هذه الورقة منهجية لدمج NIS في الخلايا التائية CAR وتصوير الخلايا التائية CAR المشبعة في الجسم الحي من خلال [18F]TFB-PET. كدليل على المفهوم ، تم إنشاء الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR عبر النقل المزدوج. لقد أبلغنا مؤخرا أن دمج NIS في الخلايا التائية CAR لا يضعف وظائف الخلايا التائية CAR وفعاليتها في الجسم الحي ويسمح بالاتجار بالخلايا التائية CAR وتوسيعها30. مع استمرار علاجات الخلايا التائية CAR في التوسع إلى ما وراء الأورام الخبيثة الحالية للخلايا البائية إ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
SSK هي مخترعة براءات اختراع في العلاج المناعي CAR مرخصة لشركة Novartis (من خلال اتفاقية بين Mayo Clinic وجامعة بنسلفانيا ونوفارتيس) وMettaforge (من خلال Mayo Clinic). RS و MJC و SSK هم مخترعون على براءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة ل Humanigen. تتلقى SSK تمويلا بحثيا من Kite و Gilead و Juno و Celgene و Novartis و Humanigen و MorphoSys و Tolero و Sunesis و Leahlabs و Lentigen. تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال خط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ومؤسسة بريدولين (RS). تم إنشاء الأشكال 1 و 2 و 4 باستخدام BioRender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 22 إبرة قياس | Covidien | 8881250206 | |
| 28 مقياس حقنة الأنسولين | BD | 329461 | |
| 96 لوحة بئر | Corning | 3595 | |
| مضاد للإنسان (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL يربط الطرف C العصاري الخلوي ل NIS |
| Anti-human BCMA ، استنساخ 19F2 ، PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow الجسم المضاد |
| CD45 مضاد للإنسان ، استنساخ HI30 ، BV421 | BioLegend | 304032 | Flow جسم مضاد |
| مضاد للفأر CD45 ، استنساخ 30-F11 ، APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow الجسم المضاد |
| للأرانب IgG | R & D | F0110 | الجسم المضاد الثانوي لصبغة NIS |
| BCMA-CAR ، الجيل الثاني | IDT ، كورالفيل ، IA | ||
| BD & nbsp ؛ Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution | BD | 554714 | |
| CD3 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (OKT3) ، PE ، eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (أنظمة العلاج بالخلايا) Dynabeads CD3 / CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System ؛ B5-R3-V5 | بيكمان كولتر | C04652 | مقياس التدفق الخلوي |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | ميليبور سيجما | D2650-100ML | |
| محاقن يمكن التخلص منها مع أطراف Luer-Lok | BD | 309646 | |
| D-Luciferin ، ملح البوتاسيوم | والذهب التكنولوجيا الحيوية | LUCK-1G | |
| D-PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's Dulbecco's Saved Fluored Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (مكثف الجسيمات المغناطيسية) | الأنظمة الحيوية التطبيقية | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | الخرز المغناطيسي السلبي ؛ 17951RF يتضمن نصائح و عازلة |
| مصل الأبقار الجنين | Millipore Sigma | F8067 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز المتصاص ، Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon متعدد الطرائق الماسح الضوئي PET / CT | Siemens Medical Solutions USA، Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| سائل الأيزوفلوران | بيرامال للعناية الحرجة | 66794-017-10 | |
| نظام التصوير IVIS Lumina S5 | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS & reg ؛ نظام التصوير الطيف في الجسم الحي | PerkinElmer | 124262 | |
| Lipofectamine 3000 كاشف التعداء | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Spot Kit ، لإثارة 405 نانومتر | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 مل فلتر فراغ ، 0.22 ميكرومتر ، معقم | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| فلتر فراغ Nalgene Rapid-Flow 500 مل ، 0.45 ميكرومتر ، معقم | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid مختبر Il2rgtm1Wjl / SzJ | Jackson | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | خط خلايا الورم النقوي المتعدد |
| pBMN (CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | ناقلات الفيروسات العدسية المشفرة لوسيفيراز-GFP |
| البنسلين والستربتومايسين والجلوتامين (100x) ، سائل | جيبكو | 10378-016 | |
| برنامج PMOD | PMOD | PBAS و P3D | |
| البلازما البشرية المجمعة AB مشتقة | من البحوث المبتكرة | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals، Inc. | 0210055210 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | فاصل الخلايا الآلي |
| بالكامل RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | أنابيب فصل التدرج الكثافة |
| أزيد الصوديوم ، 5٪ (وزن / حجم) | ريكا كيميكال | 7144.8-16 | |
| قارورة T175 | كورنينج | 353112 | |
| تيريل (إيزوفلوران ، USP) | بيرامال للرعاية الحرجة | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 خلية مكونة للدم خالية من المصل متوسطة | لونزا | 04-418Q |
المراجع
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
![التصوير الديناميكي للخلايا التائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية مع [18F] التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني رباعي فلوروبورات / التصوير المقطعي المحوسب](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg&w=3840&q=75)