مقالة منهجية

استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي البالغ

4.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62349

⸱

أبريل 4, 2021

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراء إزالة الفص البطني للكبد في سمك الحمار الوحشي البالغ لتمكين دراسة تجديد الكبد.

الملخص

فشل الكبد هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، والوفيات الناجمة عن أمراض الكبد المزمنة ترتفع بشكل حاد في الولايات المتحدة. الكبد السليم قادر على تجديد من الأضرار السامة، ولكن في أمراض الكبد المتقدمة، وضعف القدرة الطبيعية للكبد لتجديد. وقد برزت حمار وحشي كنظام تجريبي قوي لدراسة التجديد. وهي نموذج مثالي لدراسة تجديد الكبد من استئصال الكبد الجزئي، وهو إجراء له صلة سريرية مباشرة تتم فيه إزالة جزء من الكبد جراحيا، تاركا الباقي سليما. لا يوجد بروتوكول قياسي لاستئصال الهيباتيك الجزئي؛ وقد استخدمت الدراسات السابقة باستخدام هذا النموذج بروتوكولات مختلفة قليلا وأفادت نتائج متباينة. الموصوفة هنا هو كفاءة، بروتوكول استنساخها لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في حمار وحشي الكبار. نحن نستخدم هذه التقنية لإثبات أن حمار وحشي قادر على تجديد غير متبلور للفص المكروب. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمزيد من الاستجواب الآليات اللازمة لتجديد الكبد في حمار وحشي.

المقدمة

من بين الأعضاء الصلبة في البشر ، والكبد هو الجهاز الوحيد القادر على تجديد1. وهذا أمر بالغ الأهمية، كما الكبد هو جهاز أساسي، المسؤولة عن وظائف التمثيل الغذائي الرئيسية، وتخزين الطاقة، وإزالة السموم من الدم، وإفراز بروتينات البلازما، وإنتاج الصفراء2. يتم استبدال خلايا الكبد المفقودة بسبب الأضرار السامة أو الالتهابية في المقام الأول عن طريق تقسيم خلايا الكبد المتبقية1. نموذج تجريبي كلاسيكي واحد لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي ، حيث تتم إزالة الفصوص الفردية للكبد ، وترك الفصوص المتبقية سليمة3. تم تطوير هذا الإجراء في البداية في الفئران ، حيث تتم إزالة ما يقرب من ثلثي كتلة الكبد. بعد استئصال الكبد الجزئي في الثدييات ، يحدث التجديد التعويضي في الفصوص المتبقية حتى يستعيد الكبد كتلته الأولية. وتجدر الإشارة إلى أن كبد الثدييات لا يحل محل الفصوص المفقودة.

Zebrafish (دانيو rerio) تمثل نموذجا قابلة للسحب لدراسة تجديد الأعضاء الكبار4. الكبد حمار وحشي، في حين تختلف هيكليا عن الكبد الثدييات، و تتكون من نفس أنواع الخلايا ويخدم نفس الوظيفة كما هو الحال في الثدييات2. ويتكون من ثلاثة فصوص، مع اثنين من الفصوص الظهرية وفص بطني واحد التي تتسطح على طول الأمعاء. وقد سبق إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي، مع روايات متضاربة حول الطريقة الدقيقة للتجديد. عادة، يتم إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث عن طريق إزالة الفص البطني بأكمله. وأشارت التقارير الأولية إلى أنه بعد إزالة الفص البطني ، تم تجديده بالكامل في غضون أسبوع5،6،7، مما يشير إلى أنه على النقيض من كبد الثدييات ، فإن كبد الحمار الوحشي قادر على التجديد غير المتبلور. أظهرت الدراسات اللاحقة أن إزالة الفص البطني أدت إلى تجديد تعويضي في الفصوص الظهرية ، بدلا من تجديد الفص البطني المفقود ، وفي النهاية استعادة كتلة الكبد في غضون أسبوع8،9. كشف التنميط النسخي للفص الظهري بعد استئصال الفص البطني عن تغييرات كبيرة مرتبطة بالتجديد التعويضي10. وبالنظر إلى أن طريقة تجديد الكبد يمكن أن تختلف مع مدىالإصابة 8، تكهننا بأن التناقضات في النتائج قد تكون بسبب الاختلاف التقني في بروتوكول استئصال الكبد الجزئي بين مجموعات البحث.

يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث على حمار وحشي الكبار عن طريق إزالة الفص البطني. وستكون هذه التقنية قيمة لتقييم آليات تجديد الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأثيرت حمار وحشي وتربية وفقا للإجراءات القياسية. تمت الموافقة على التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغهام والنساء (2016N000405). تم صائم حمار وحشي الكبار لمدة 24 ساعة قبل بدء البروتوكول. مياه النظام يشير إلى المياه في خزانات الإسكان حمار وحشي في المرفق المائي.

1. التحضير والتخدير

  1. إعداد 0.016٪ Tricaine الحل في مياه النظام.
    تنبيه: Tricaine هو مهيج إذا كان يأتي في اتصال مع العينين والجلد، أو الجهاز التنفسي.
  2. إعداد اسفنجة لعقد حمار وحشي مخدر خلال بروتوكول تشريح. قطع اسفنجة كاملة إلى أرباع. باستخدام شفرة حلاقة، قم بإزالة إسفين رقيقة من الإسفنج الذي يمتد بالتوازي مع المحور الطويل من الربع الإسفنج.
    1. يجب أن يكون الشق طويلا بما يكفي لاستيعاب سمكة بالغة (وهذا يختلف بين أحجام مختلفة من الأسماك). على سبيل المثال، بالنسبة للأسماك البالغة 35 ملم في الطول، يجب أن يكون طول الشق 20 ملم. يتم عقد الرأس والجسم بشكل مريح في الاسفنج، ولكن الذيل يمتد الماضي حافة الاسفنج(الشكل 1B).
  3. نقع الاسفنج في حل Tricaine 0.016٪.
  4. وضع حمار وحشي الكبار (سواء ذكر أو أنثى) في 625 مل من محلول Tricaine 0.016٪.
  5. حضانة لمدة 6 دقائق أو حتى الأسماك لا تستجيب للمس.
  6. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية الأسماك من خزان Tricaine ووضع الجانب البطيني السمك حتى في الأخدود من الاسفنج (الشكل 1A - B).
  7. ضع الإسفنج تحت مجهر تشريح مع إضاءة من أعلى إلى أسفل.

2. الجراحة

  1. باستخدام ملقط ناعم، قرصة الجلد ومقاييس medially، فقط الخلفي إلى القلب(الشكل 1B).
  2. باستخدام مقص الربيع محملة، وجعل خفض تحت ملقط لخلق ثقب في تجويف الجسم (الشكل 1C - D). الحرص على عدم إصابة القلب أو الأوعية الدموية الرئيسية، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
  3. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق 3-4 ملم على طول البطن، ومعالجة الخلفي حتى الشق يصل في زعانف الحوض(الشكل 1D - E). عند هذه النقطة، قد يكون الفص البطني للكبد مرئيا من خلال الشق.
  4. اضغط على جانبي الاسفنج بيد واحدة لإجبار الأعضاء الحشوية على الخروج من تجويف الجسم. الفص البطني للكبد سوف تكون مرئية على رأس الأمعاء (الأرقام 1F, 2A-B). سيظهر الكبد كبنية وردية أو برتقالية منتشرة على الأمعاء الذهبية البنية. يتم استرداد الحيوانات المعينة كضوابط صورية في هذه المرحلة.
  5. الضغط على ملقط غرامة بحيث اثنين من tines لمس. مع الحفاظ على الضغط على الاسفنج ، الشريحة من علب ملقط غرامة في ما بين الكبد والأمعاء(الشكل 1G). الحرص على عدم ثقب الأمعاء، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
  6. تخفيف الضغط ببطء على ملقط بحيث الطنين الابتعاد عن بعضها البعض (الشكل 1H). هذا العمل انزلاق يقطع العديد من المرفقات الوريد البوابة بين الفص البطني والأمعاء (الشكل 2B)، وضروري لإزالة الفص البطني نظيفة. كرر هذه العملية حتى يتم قطع جميع اتصالات البوابة بين الكبد والأمعاء.
  7. قشر الفص البطني من الأمعاء باستخدام ملقط ناعم وقطع الفص البطني خالية من بقية الكبد (الشكل 1I).
  8. ينتج عن هذا الإجراء استئصال جزء من الهيباتيكومي ثلث(الشكل 1J).

3. الانتعاش

  1. إزالة بعناية الأسماك من الإسفنج ووضعها في خزان من مياه النظام.
  2. ماصة نظام المياه على الخياشيم لبضع دقائق حتى الأسماك تسبح من تلقاء نفسها(الشكل 1K).
  3. مراقبة الأسماك لمدة 2-4 ساعات قبل وضعها مرة أخرى على النظام. لا تطعم السمك لمدة 24 ساعة كاملة بعد الجراحة.
  4. مراقبة الأسماك يوميا طوال مدة التجربة.
  5. مع مرور الوقت، شق في جدار الجسم سوف تلتئم بشكل طبيعي دون الحاجة إلى الغرز (الشكل 1L،2C).

4. الفص البطني إلى تحليل طول الأمعاء

  1. قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
  2. إزالة الأسماك من الماء المثلج ووضعها الجانب البطني حتى في الأخدود من اسفنجة.
  3. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
  4. قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
  5. الحصول على صور ذات مجال مشرق والفلورسنت من الأجهزة الحشوية باستخدام المجهر epifluorescence. وسيشمل مجال الرؤية هذا المنطقة التي أعيد فيها استئصال الفص البطني. ولأن الحيوانات يقتل رميا بالرصاص قبل التحليل، فإن هذا النوع من التحليل يحول دون التصوير طويل الأجل لنفس الأسماك.

5. تحليل نسبة الوزن الكبد إلى الجسم

  1. قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
  2. ضع السمك في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  3. إضافة 25 مل من 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين إلى الأنبوب.
    تنبيه: الفورمالديهايد سام، وينبغي دائما معالجة الحلول التي تحتوي على الفورمالديهايد في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  4. نوتات لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. أداء أربعة يغسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين.
  6. استرداد الأسماك مع ملقط، ولطخة الجافة على منشفة ورقية.
  7. سجل وزن السمك بأكمله.
  8. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم، جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
  9. قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
  10. الحصول على صور ذات مجال مشرق للكبد باستخدام المجهر epifluorescence.
  11. تشريح الكبد، ووضع قطعة من الكبد على قارب الوزن.
  12. سجل وزن الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل دراسة الإمكانات التجديدية لكبد حمار وحشي البالغين ، قمنا بإجراء استئصال الكبد الجزئي (PHX) في سمك الحمار الوحشي البالغ. بشكل عام، تم اختيار كبار البالغين (30-40 ملم في الطول)، تتراوح أعمارهم بين 1.5-2.5 سنة. وفي إطار التجارب الفردية، تم اختيار الحيوانات من نفس الخزان، وكانت مطابقة للعمر والحجم. كتحكم مناسب ، استخدمنا العمليات الجراحية الصورية التي تم فيها تخدير الحيوان وتلقي شقا كبيرا في جدار الجسم البطني ولكن تم استرداده دون إزالة أي أنسجة. وتراوحت معدلات البقاء على قيد الحياة للضوابط صورية من 90٪ إلى 100٪ لكل من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الاختلافات التشريحية بين سمك الحمار الوحشي ونماذج الثدييات لتجديد الكبد تمثل تحديات فريدة من نوعها لاستئصال الكبد. الكبد في حمار وحشي على مقربة من القلب والأمعاء. عن غير قصد إتلاف أي من الأعضاء يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات. لا يتم تغليف كبد حمار وحشي ، مما يجعل من الصعب فصله عن الأمعاء. الكبد يتلقى الدم الغني بالمغذيات من الأمعاء من خلال الأوردة البوابة. في الثدييات ، تتلاقى الأوردة التي تغادر الأمعاء على وريد البوابة الأولية التي تنقسم بعد ذلك عند دخولها الكبد12. في المقابل ، يتلقى كبد حمار وحشي ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

أنا.M.O. معتمد من قبل NIAAA (F32AA027135). W.G. مدعوم من قبل R01DK090311، R01DK105198، R24OD017870، وبرنامج كلوديا آدامز بار للتميز في أبحاث السرطان. دبليو جي هو باحث بيو في العلوم الطبية الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول مائي بارافورمالدهايد 16٪ ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15700
50 مل أنابيب الطرد المركزي فالكون ، مادة البولي بروبيلين ،352098كورنينج
AS 82 / 220.R2 PLUS مقياس التوازن التحليليخليج الدولة & Systems, INC.WL-104-1051
Dumont # 55 أدواتالعلوم الدقيقة11295-51
EMS Kuehne Coverglass / عينة ملقطعلوم المجهر الإلكتروني72997-07
مجهر epifluorescenceZeissDiscovery.V8
Mastertop تنظيف السليلوز تنظيف الإسفنجAmazonB07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4LEMD Millipore6505-4L
مقص دقيق فائق الدقة ، 3 1/4 "أدوات البحث الطبية الحيويةالمستقيمة 11-1020
تريكايين ميثان سولفوناتسيندلTRIC-M-GR-0010
توين 20 ، فيشر الكواشف الحيويةفيشر العلميةBP337-500
من الدرجة معقمة الملقط

المراجع

  1. Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
  2. Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
  3. Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
  4. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  5. Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
  6. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
  7. Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
  8. Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
  9. Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
  10. Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979(2015).
  11. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
  12. Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة