نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل أنماط حركية السدادة أثناء وبعد تجديد الجهاز الفموي باستخدام تتبع الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Stentor coeruleus هو كائن حي نموذجي معروف لدراسة التجديد أحادي الخلية. كشف التحليل النسخي للخلايا الفردية عن مئات الجينات - العديد منها غير مرتبط بالجهاز الفموي (OA) - التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي على مراحل طوال عملية التجديد. كان من المفترض أن إعادة التنظيم المنهجي وتعبئة الموارد الخلوية نحو نمو OA جديد سيؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الحركة والسلوك المقابلة في الوقت المناسب لمراحل التعبير الجيني التفاضلي. ومع ذلك ، فإن التعقيد المورفولوجي ل S. coeruleus استلزم تطوير فحص لالتقاط الإحصاءات والجدول الزمني. تم استخدام برنامج نصي مخصص لتتبع الخلايا في مقاطع فيديو قصيرة ، وتم تجميع الإحصاءات على عدد كبير من السكان (N ~ 100). عند فقدان OA ، يفقد S. coeruleus في البداية القدرة على الحركة الموجهة ؛ ثم بدءا من ~ 4 ساعات ، فإنه يظهر انخفاضا كبيرا في السرعة حتى ~ 8 ساعات. يوفر هذا الفحص أداة مفيدة لفحص الأنماط الظاهرية الحركية ويمكن تكييفها للتحقيق في الكائنات الحية الأخرى.
المقدمة
Stentor coeruleus (Stentor) هو كائن حي نموذجي معروف تم استخدامه لدراسة التجديد أحادي الخلية بسبب حجمه الكبير ، وقدرته على تحمل العديد من تقنيات الجراحة المجهرية ، وسهولة الاستزراع في بيئة مختبرية1،2،3. ركزت دراسات التجديد المبكر على أكبر ميزة وأكثرها تميزا من الناحية المورفولوجية في Stentor - OA - التي يتم إلقاؤها بالكامل على الصدمة الكيميائية4،5،6. يبدأ استبدال OA المفقود بظهور نطاق غشائي جديد - مجموعة من الأهداب التي تتحول تدريجيا نحو الجزء الأما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم استزراع مجموعة من حوالي مائة خلية S. coeruleus وفقا لبروتوكول JoVE8 المنشور سابقا.
1. إعداد العينات
- قطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر (جدول المواد) أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر. باستخدام ثقب 5/16 "لكمة ، قم بإنشاء آبار دائرية. ضع في اعتبارك ترك مساحة كافية بين الآبار المجاورة لضمان ختم جيد.
ملاحظة: وجد أن مساحة 3 مم بين الآبار المجاورة كافية. مع الممارسة ، يمكن وضع عشرة آبار على شريحة عينة واحدة. - بدء تجديد OA عن طريق احتضان الخلايا في 10٪ من السكروز أو 2٪ من اليوريا لمدة دقيقتين (الشكل 1A....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الهدف من هذا الفحص هو تحديد التغير التدريجي لأنماط الحركة والزيادة التدريجية في سرعة الحركة من الخلايا داخل مجموعة كبيرة (N ~ 100) من Stentor المجددة. للمساعدة في تفسير النتائج ، يولد الرمز المخصص المضمن في هذا البروتوكول نوعين من المؤامرات: تراكب لجميع آثار حركة الخلية في مجموعة من بيانات الفيديو (الشكل 1C-F والشكل S1) ، ومخطط لسرعة السباحة بالساعة منذ بدء التجديد (الشكل 2C). يجب أن تظهر مجموعة ستي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توجد حاليا العديد من خوارزميات تتبع الجسيمات والخلايا ، بعضها مجاني تماما. غالبا ما تكون التكلفة وسهولة الاستخدام مقايضات تتطلب حلا وسطا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم العديد من برامج تتبع الخلايا الحالية لتتبع حركة الزحف البطيئة لخلايا زراعة الأنسجة ، بدلا من حركة السباحة السريعة ل Stentor ، والتي تدور أثناء السباحة ويمكن أن تخضع لتغييرات مفاجئة في الاتجاه. بعد اختبار العديد من هذه الخيارات ، يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى أن يكون حلا شاملا للانتقال من الحصول على البيانات إلى تصور البيانات باستخدام معدات منخفضة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل زمالة ويتمان للمختبر البيولوجي البحري المبكر (JYS). نحن نقدر إيفان بيرنز وميت باتيل وميلاني ميلو وسكايلار ويدمان للمساعدة في بعض التحليلات الأولية واختبار الشفرات. ونشكر مارك سلابودنيك على المناقشة والاقتراحات. تعترف WFM بالدعم المقدم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لوح سيليكون بسمك 0.25 مم | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 × 50 مم ، # 1.5 غطاء | زجاجي فيشر Scientific | NC1034527 | كما هو مذكور في المناقشة ، يمكن استخدام غطاء زجاجي أصغر إذا تم وضع عدد أقل من آبار العينات على شريحة واحدة. |
| كاميرا | استخدمنا نيكون D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT سلالة | Chlamydomonas مركز موارد | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB أداة معالجة الصور | MATHWORKS | اللازمة ل TrackCells.m و CleanTraces.m |
المراجع
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
