15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

ملخص

هنا، يتم توفير وصف مفصل للبروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على وتحليل ¹⁵N ملامح التشتت الاسترخاء عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل.

الملخص

تلعب الديناميكيات التوافقية للبروتين أدوارا أساسية في تنظيم الحفز الأنزيمي ، وربط الليغند ، والتستوستيرون ، والإشارات ، وهي عمليات بيولوجية مهمة. إن فهم كيفية تحكم التوازن بين البنية والديناميكيات للوظيفة البيولوجية هو حدود جديدة في البيولوجيا الهيكلية الحديثة وأشعل العديد من التطورات التقنية والمنهجية. من بين هذه, CPMG الاسترخاء حل التشتت أساليب NMR توفير فريدة من نوعها, معلومات الدقة الذرية على هيكل, الحركية, والديناميكا الحرارية من البروتين تشكيلية التوازنات التي تحدث على مقياس زمني μs-ms. هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولات مفصلة للحصول على وتحليل تجربة ^{تشتت الاسترخاء 15}N. على سبيل المثال ، يظهر خط أنابيب لتحليل ديناميات μs-ms في المجال C-terminal من البكتيريا Enzyme I.

المقدمة

كار بورسيل ميبوم جيل (CPMG) يتم استخدام تجارب تشتت الاسترخاء (RD) على قاعدة روتينية لتوصيف التوازنات التوافقية التي تحدث على مقياس الوقت μs-ms عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل^{1،2،3،4،5}. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للتحقيق في الديناميات التوافقية ، فإن تقنيات CPMG سهلة التنفيذ نسبيا على مطياف NMR الحديث ، ولا تتطلب خطوات إعداد عينات متخصصة (أي التبلور أو تجميد العينة أو المحاذاة ، و / أو اقتران التكافؤ مع علامة فلورية أو مغناطيسية) ، وتوفر وصفا شاملا للتوازنات التركيبية ال....

البروتوكول

1. إعداد عينة NMR

1. التعبير عن وتنقية ²H،¹⁵N-labled عينة من البروتين من الفائدة.
   ملاحظة: في حين يمكن استخدام عينة بروتين ¹⁵N المسمى للحصول على تجربة CPMG RD، perdeuteration (حيثما أمكن) يزيد بشكل كبير من جودة البيانات التي تم الحصول عليها. بروتوكولات لإنتاج البروتينات perdeuterated متوفرة في الأدب¹³.
2. المخزن المؤقت تبادل عينة البروتين المنقى في مخزن مؤقت NMR degassed.
3. نقل عينة NMR إلى أنبوب NMR.
   ملاحظة: يجب تحسين تركيز عينة NMR بعناية من أجل زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل حدوث التفاعلات بين البروتين والبروتين. بشكل عام، يتراوح نطاق التركيز النموذجي لتجارب CPMG بين 0.1 و1.0....

النتائج

البروتوكول الموصوف هنا يؤدي إلى الحصول على ملامح RD لكل ذروة في ^{الطيف 1}H-¹⁵N TROSY(الشكل 3A). من ملامح RD المكتسبة، فمن الممكن لتقدير مساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي N ¹⁵من كل مجموعة أميد العمود الفقري(الشكل 3A،3B). من خلال رسم_{R السابقين} على هيكل 3D من البروتين قيد التحقيق، فمن الممكن لتحديد المناطق الهيكلية التي تمر تبادل تشكيلي على مقياس الوقت μs-ms(الشكل 3C). إرجاع ال.......

المناقشة

تصف هذه المخطوطة البروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على ¹⁵N RD من البيانات المتعلقة بالبروتينات وتحليلها. وعلى وجه الخصوص، يتم تغطية الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وقياس بيانات NMR، وتحليل ملامح RD. وفيما يلي بعض الجوانب الهامة المتعلقة باقتناء وتحليل تجارب RD. ومع ذلك ، للحصول على وصف أكثر تعمقا للتجربة وتحليل البيانات ، يوصى بشدة بالدراسة الدقيقة للأدب الأصلي^{3و8و11و15و}

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مسبار التبريد Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C / N-D المسبار المبرد	تحسين الحساسية
أكسيد الديوتيريوم	سيجما ألدريتش	756822-1	>99.8٪ نقي ، يستخدم في تحضير عينات الرنين المغناطيسي النووي والثقافات الديوتيريتية أجهزة
الطرد المركزي التي تعمل باليد	CENTFG1 التوريد العلمي المتحدة		تستخدم لإزالة أي فقاعات هواء أو سائل متبقي عالق على جدران أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.
مطياف الرنين المغناطيسي النووي عالي المجال	Bruker	Bruker Avance II 600 ، Bruker Avance 800	الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي
النووي MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	نمذجة بيانات الرنين المغناطيسي
ماصة الرنين المغناطيسي النووي ماصة	Corning Incorporation	7095D-NMR	ماصة زجاجية Pyrex لنقل عينة سائلة في أنبوب الرنين المغناطيسي
أنبوب الرنين المغناطيسي	Willmad Precision	535-PP-7	مم جدار رفيع 7 بوصات أنبوب زجاجي أسطواني
NMRPipe	معهد العلوم البيولوجية وأبحاث التكنولوجيا الحيوية	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	معالجة بيانات الرنين المغناطيسي
SPARKY	جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	تحليل بيانات الرنين المغناطيسي
Tospin 3.2 (أو أحدث)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	برامج الاستحواذ

النووي النووي النووي 5 النووي النووي