مقالة منهجية

تطبيق التصوير بالموجات فوق الصوتية والقص موجة التصوير في نموذج الفئران من NAFLD / ناش

DOI:

10.3791/62403

⸱

أبريل 20, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comparative Medicine, Pfizer Inc., 2Digital Medicine & Translational Imaging, Pfizer Inc., 3Internal Medicine Research Unit, Pfizer Inc., 4Drug Safety Research & Development, Pfizer Inc.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام تقنية الموجات فوق الصوتية المحسنة لمراقبة وقياس تغيرات أنسجة الكبد في نماذج القوارض لأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو حالة ضمن طيف مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والذي يتميز بتراكم الدهون في الكبد (steatosis) والالتهاب المؤدي إلى التليف. نماذج ما قبل السريرية عن كثب تلخيص ناش الإنسان / NAFLD ضرورية في تطوير المخدرات. في حين أن خزعة الكبد هي حاليا المعيار الذهبي لقياس تطور NAFLD / NASH والتشخيص في العيادة ، في الفضاء قبل السريري ، هناك حاجة إما لجمع عينات الكبد الكاملة في نقاط زمنية متعددة أثناء الدراسة أو خزعة من الكبد للتحليل النسيجي لتقييم مرحلة المرض.

إجراء خزعة الكبد في منتصف الدراسة هو إجراء الغازية والعمل الكثيف، وجمع عينات الكبد لتقييم مستوى المرض يزيد من عدد الحيوانات البحثية اللازمة للدراسة. وبالتالي، هناك حاجة إلى علامة بيولوجية للتصوير موثوقة وقابلة للترجمة وغير الغازية للكشف عن NASH/NAFLD في هذه النماذج قبل السريرية. يمكن استخدام صور وضع B غير الغازية المستندة إلى الموجات فوق الصوتية وتصوير القص الموجي (SWE) لقياس الداء النتني وكذلك تليف الكبد. لتقييم فائدة SWE في نماذج القوارض قبل السريرية من ناش ، وضعت الحيوانات على نظام غذائي مؤيد ل NASH وخضعت لتصوير التصوير بالموجات فوق الصوتية غير الغازية B-mode وتصوير تصوير موجة القص لقياس مؤشر الكبد (HR) ومرونة الكبد ، وقياس تطور كل من تراكم الدهون في الكبد وتصلب الأنسجة ، على التوالي ، في نقاط زمنية متعددة على مدار دراسة NAFLD / NASH معينة.

تمت مقارنة مؤشر الموارد البشرية وأرقام المرونة بعلامات الهسهولوجيا للداء النتني والتليف. وأظهرت النتائج وجود علاقة قوية بين مؤشر الموارد البشرية والنسبة المئوية لتلطيخ الزيت الأحمر O (ORO)، وكذلك بين المرونة وتلطيخ بيكرو سيريوس الأحمر (PSR) للكبد. يوفر الارتباط القوي بين طرق الجسم الحي الكلاسيكية ونتائج التصوير في الجسم الحي دليلا على أنه يمكن استخدام التصوير المقطعي /التصوير القائم على الموجات فوق الصوتية لتقييم النمط الظاهري للمرض والتقدم في نموذج ما قبل السريرية ل NAFLD / NASH.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو حالة التمثيل الغذائي تتميز تراكم الدهون المفرط في الكبد وسرعان ما تصبح مرض الكبد الرائدة في جميع أنحاء العالم مع انتشار العالمية التي أبلغ عنها مؤخرا من 25٪1. التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو مرحلة أكثر تقدما من طيف NAFLD ، تتميز بدهون الكبد الزائدة مع تلف خلوي تدريجي ، والتهاب ، وتليف. هذه الأمراض غالبا ما تكون صامتة، لم يتم الكشف عنها عن طريق اختبارات الدم أو الفحوص الروتينية، حتى حدث ضرر كبير بالفعل لكبد المريض. حاليا، المعيار الذهبي لتشخيص ناش في المرضى هو من خلال الفحص النسيجي لعينات خزعة الكبد المشتقة من المريض. وبالمثل ، فإن الباحثين قبل السريرية الذين يعملون على فهم مسببات الأمراض في NASH / NAFLD وكذلك صناعة تطوير الأدوية يعتمدون على خزعة إسفين في الجسم الحي لعينات الكبد أو القتل الرحيم النهائي لأفواج الأقمار الصناعية لعلم النسيج لقياس الداء الستاتي والالتهاب والتليف.

على سبيل المثال، كانت خزعة إسفين الكبد تقنية قياسية لتقييم التهاب الكبد والتليف أثناء استخدام نموذج GUBRA NASH2. طريقة خزعة إسفين الكبد الغازية وشاقة في الحيوانات الصغيرة3. يمثل استخدام خزعة كبد إسفين في منتصف الدراسة متغيرا تجريبيا إضافيا في نموذج المرض ، والذي غالبا ما يزيد من عدد الحيوانات المطلوبة. مع أخذ هذه العوامل في الاعتبار ، فإن تقنيات التصوير غير الغازية التي يمكن استخدامها لتقييم الداء النتني والتليف بشكل موثوق في نماذج الحيوانات NASH / NAFLD في نقاط زمنية مبكرة تثبت قيمتها. تصوير الموجات القصية (SWE) هو طريقة تعتمد على الموجات فوق الصوتية تستخدم لقياس مرونة الأنسجة الرخوة. تقيس هذه التقنية انتشار موجات القص التي تم إنشاؤها بواسطة نبضات الموجات فوق الصوتية الأسرع من الصوت الموجهة إلى هدف الأنسجة ، ثم تحسب قيمة تسمى معامل E4. سرعة موجة القص تتناسب مع درجة تصلب الأنسجة.

الشكل 1 والشكل 2 إظهار إعداد منطقة التصوير وأداة SWE. أداة SWE هي وحدة واحدة ذات عجلات مع شاشتين ولوحة تحكم موضحة في الشكل 2A. تعمل الشاشة العلوية(الشكل 2B)كشاشة كمبيوتر وتعرض الصور والدلائل المريضة. لوحة التحكم (الشكل 2C) هي مجموعة من الأزرار والأوجه التي تتحكم في الجوانب العامة لالتقاط الصور: شاشة التجميد ، حفظ الصور ، التغيير من وضع إلى آخر. الشاشة السفلية (الشكل 2D) هي شاشة تعمل باللمس مع عناصر تحكم إضافية لتغيير الإعدادات وتعمل كل ولوحة مفاتيح لإدخال البيانات حسب الحاجة. وقد تم تجهيز الصك مع قلم لاستخدامها على الشاشة التي تعمل باللمس إذا رغبت في ذلك. تلتصق المسابير بالموجات فوق الصوتية باللوحة الأمامية السفلية للجهاز. بالنسبة للتصوير بنمط B وSWE في القوارض، تم استخدام محول فائق الخطية من 6 إلى 20 ميغاهرتز. هذه القدرة على قياس صلابة الأنسجة بشكل غير باضع يجعل SWE أداة قيمة لتحديد وتنظيم تليف الكبد 5 فيمرضى ناش ، مما يقلل من الحاجة إلى طرق أكثر الغازية. وقد استخدمت SWE، في الواقع، لقياس تليف الكبد في المرضى، وهي طريقة وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لتسجيل التليف في العيادة6. ومن شأن استخدام SWE لرصد تطور ناش في النماذج الحيوانية للمرض أن يوفر أداة تحويلية لتطوير العلاجات وتحسين رفاهية الحيوان في وقت واحد من خلال الحد من أعداد الحيوانات وصقل الإجراءات في الجسم الحي لتقليل الألم والضيق.

يستخدم التصوير SWE في المرضى البشر محول الموجات فوق الصوتية منخفض التردد4، وهو ليس مثاليا للحيوانات الصغيرة. وتجدر الإشارة إلى أن تقنيات SWE عالية التردد قد استخدمت لتقييم فعالية تثبيط الكربوكسيليس أسيتيل-CoA على الإمراض من NASH في نموذج الفئران7، وقد وصفت فائدة هذه التقنية في نماذج الفئران رباعي كلوريد الكربون من تليف الكبد مع نتائج ناجحة بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتسجيل الهسهس METAVIR8. ومع ذلك ، فإن الأدبيات الموجودة تفتقر إلى تقنية مفصلة ومعلومات منهجية حول تطبيق التصوير SWE في نماذج ما قبل السريرية من ناش. كما هو موضح أعلاه ، يعد داء الكبد أحد السمات الرئيسية لحالة NAFLD / NASH وهو مرحلة مهمة حيث يمكن النظر في التدخل. وبالتالي، تقييم تراكم الدهون في الكبد باستخدام طريقة التصوير لا يقل أهمية عن تقييم تليف الكبد في نماذج ما قبل السريرية من ناش / NAFLD.

تقنية الموجات فوق الصوتية المعروفة باسم مؤشر الموارد البشرية، وهينسبةمن سطوع الأنسجة في الكبد مقارنة مع تلك الموجودة في قشرة الكلى، وقد استخدمت كعلامة بديلة من steatosis في العيادة 9،10. غير أن هذا النهج لم يستخدم على نطاق واسع في النماذج الحيوانية قبل السريرية في نافلد/ناش. هذه المقالة يصف طريقة لقياس مرونة فضلا عن مؤشر الموارد البشرية كعلامة بديلة للتليف الكبدي و steatosis, على التوالي, في الكولين ناقص, نظام غذائي عالي الدهون (CDAHFD) نموذج الفئران من NAFLD / ناش. هذا النموذج يحفز داء الستاتيوسيس السريع والتهاب الكبد والتليف ، والذي يمكن قياسه في غضون 6 أسابيع في الفئران11. وقد ثبت إضافة الكولسترول (1٪) إلى هذا النظام الغذائي لتعزيز فيبروميجينيسيس في الفئران12،مما يجعل هذا النموذج مرشحا مناسبا لدراسات التحقق من صحة تنطوي على التصوير موجة القص. وعموما ، يمكن أيضا أن تطبق هذه التكنولوجيا التصوير لمجموعة واسعة من نماذج ناش / الوجبات الغذائية حيث steatosis و / أو التليف هو نقطة نهاية الاهتمام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لشركة Pfizer وأجريت في منشأة معتمدة دولية AAALAC (تقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية).

1. تحريض المرض

  1. استخدام الذكور الفئران الوستر هان (150-175 غرام؛ ~ 6-7 أسابيع من العمر؛ مجموع 40 الفئران) التي هي خالية من مسببات الأمراض السبتية الفئران المعروفة. منزل الفئران في أزواج في التشج التهوية بشكل فردي مع الفراش ورقة (انظر جدول المواد)والحفاظ عليها في 22 ± 1 درجة مئوية، 40-70٪ الرطوبة النسبية مع دورة 12:12 ساعة ضوء الظلام.
  2. وضع الفئران وزنها 150-175 غرام (~ 6-7 أسابيع من العمر) على اتباع نظام غذائي الكولين ناقصة، وارتفاع الدهون مع 1٪ الكوليسترول (ن = 20) أو تشاو القوارض مختبر القياسية (ن = 20) اعتمادا على تصميم الدراسة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم تسجيل ما مجموعه 40 فأرا مع 20 حيوانا لكل مجموعة. في نهاية الأسبوعالسادس، تم تشريح نصف الفوج من كل مجموعة للتحليل النسيجي في منتصف الدراسة لعينات الكبد. وهكذا، كان حجم العينة 10 لكل مجموعة ل9 نقاط زمنيةللأسبوعين الثاني عشر.

2. إعداد الصك

  1. إعداد منطقة التصوير على النحو التالي: تشمل سطح دافئ للحفاظ على الحيوان دافئة أثناء التصوير (ج في الشكل 1)،ومخروط الأنف التخدير المضمون لتقديم التخدير المستنشق للحفاظ على مستوى من التخدير طوال العملية (ب في الشكل 1).
  2. استخدام حامل مسبار بالموجات فوق الصوتية لتسهيل نقل مسبار الموجات فوق الصوتية إلى الموقع المطلوب ومنع المسبار من الراحة على الحيوان.
    1. استخدام هلام الموجات فوق الصوتية الدافئة على الجلد حيث يتم الحصول على صورة الموجات فوق الصوتية.
    2. الحفاظ على الإعدادات التالية طوال العملية، والتي يمكن تعديلها على الشاشة التي تعمل باللمس: الطاقة الصوتية 0.0 ديسيبل؛ موالف الأنسجة 1540 م / ث; المدى الديناميكي 60 ديسيبل؛ نطاق مرونة (لوضع SWE) < 30 كيلو باسكال.
  3. إرفاق مسبار الموجات فوق الصوتية إلى نظام السكك الحديدية في حامل المتخصصة (أ في الشكل 1).
  4. قم بتشغيل الأداة والسماح لها بالتمهيد. بمجرد تشغيل الشاشة، لاحظ صورة وضع B مع تفاصيل محول متصل.

3. إعداد الموضوع

  1. تأكد من صيام الحيوانات على الأقل 4 ساعات قبل إجراء التصوير لمنع محتوى الأمعاء من التداخل مع الحصول على الصورة.
    1. بعد 4 ح على الأقل من الصيام، ضع فأرا في غرفة تحريض مخدر isoflurane حتى يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التخدير، وأكد من قبل أي استجابة لقرصة إصبع القدم. تعريض الحيوانات ل3-5٪ isoflurane لمدة 3-5 دقائق للحث على التخدير.
    2. لصيانة التخدير، والحفاظ على الحيوانات تحت 2-3٪ isoflurane أثناء الحصول على الصورة. ضعي مرهم العيون لحماية العين من التجفيف أثناء التخدير.
  2. بمجرد تحقيق التخدير ، قم بإزالة من غرفة التعريفي ووضعه على بطانية ساخنة دافئة. ضع مخروط أنف مخدر فوق خطم، وحلق الحيوان على جانبه الأيمن، من القفص الصدري إلى الحوض. استخدام كريم إزالة الشعر الكيميائية لإزالة جميع الشعر المتبقي في هذا المجال.
  3. مرة واحدة وقد تم إزالة الشعر، ووضع في شغل الجانب الأيسر مع الكفوف العلوية مسجلة فوق الرأس على منصة التصوير الدافئ(الشكل 3A).
  4. اضغط على مفتاح المريض على لوحة التحكم في الجهاز، وحدد الموضوع وفقا لتصميم الدراسة.
    1. افتح وظيفة لوحة المفاتيح على الجهاز عن طريق النقر على الرمز على شاشة اللمس. اكتب الأسماء كما هو مطلوب.
    2. انقر فوق إنهاء للخروج من شاشة اسم المريض. لاحظ أن B-وضع reopens على جهاز العرض.

4. الحصول على صورة لقياس مؤشر hepato-renal (HR)

  1. تطبيق كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية الدافئة على منطقة الجلد إزالة البيلة على الحيوان.
  2. نقل مسبار الموجات فوق الصوتية للمس المنطقة المغطاة بالجل من الموضوع (الشكل 3B). بمجرد ظهور صورة حية ب-واسطة للأعضاء الداخلية للموضوع على الشاشة، نقل التحقيق بالموجات فوق الصوتية إلى المنطقة أعلى قليلا من الورك، بالتوازي فقط مع الفقرات القطنية (الطائرة القوس).
  3. باستخدام عرض وضع B على الشاشة، حدد موقع الكلى اليمنى عن طريق تحديد الشريان الكلوي الكبير وفصل القشرة / النخاع(الشكل 4A). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظ جزءا من الكبد في مستوى واحد من الصورة.
    1. تأكد من وجود القليل من القطع الأثرية للصورة مثل الظلال وفقاعات الهواء.
  4. قياس نسبة وضع B للحصول على فهرس الموارد البشرية.
    1. تأكد من أن كل من قشرة الكلى والكبد parenchyma هي في نفس المستوى من التركيز. إذا لزم الأمر، ضبط التركيز والتحكم للحصول على صورة واضحة.
      1. ضبط التركيز عن طريق تحويل مقبض التركيز على لوحة التحكم. ضبط الربح بالضغط على زر TGC التلقائي مرة واحدة.
    2. اضغط على مفتاح التجميد على لوحة التحكم. تأكد من أن الحيوان بين الأنفاس عند تجميد الشاشة لتجنب الصور الضبابية.
    3. بمجرد تجميد الشاشة، انقر على أدوات القياس على الشاشة التي تعمل باللمس. حدد نسبة الوضع B، وهي أداة مدمجة تقيس السطوع النسبي للأنسجة من منطقة اهتمام محددة. إنشاء دائرة 2 مم لتحديد منطقة الاهتمام (ROI). ضبط حجم الدائرة عن طريق تحريك إصبع على طول الحافة الخارجية من trackball على لوحة التحكم.
    4. ضع دائرة 2 مم على ROI صورة الكبد، والتي ينبغي أن تكون موجودة على يمين الكلية. تحديد أنسجة الكبد على أساس صدى متجانسة وكفاف سلس.
    5. بمجرد أن تكون الدائرة في مكانها، اضغط على الزر تحديد على لوحة التحكم، ولاحظ الدائرة الجديدة التي تظهر.
    6. ضبط حجم الدائرة الجديدة إلى 2 مم، ووضعها على صورة قشرة الكلى. تأكد من الحفاظ على عمق الدوائر على قشرة الكبد والكلى نفسه. بمجرد وضعها في مكانها، اضغط على الزر تحديد على لوحة التحكم. مراقبة أداة النظام المضمنة يعرض فهرس الموارد البشرية كنسبة وضع B.
    7. اضغط على حفظ الصورة لحفظ الصورة، ولاحظ الصور المحفوظة التي تظهر كصور مصغرة على الجانب الأيمن من الشاشة.
    8. اضغط على زر التجميد الموجود على لوحة التحكم لإلغاء تجميد الصورة والعودة إلى صورة وضع B المباشرة.
  5. كرر قياس نسبة وضع B 3 مرات في أعماق مختلفة وطائرات من الأنسجة. حساب متوسط هذه النسب الثلاثة وضع B لكل ونقطة زمنية.

5. الحصول على صورة لموجة القص Elastography

  1. حرك المسبار بشكل عرضي في المنطقة الفرعية اليمنى لتحديد موقع الكبد باستخدام وضع B. حدد موقع منطقة من الكبد معظمها بارينشيما وخالية من الأوعية الدموية الكبيرة مثل الوريد البوابة والشريان الكبدي. بمجرد العثور على منطقة واضحة من الكبد، قم بإنشاء خريطة مرونة القص للأنسجة عن طريق الضغط على زر SWE على لوحة التحكم.
  2. ضبط حجم وموضع مربع SWE أسفل كبسولة الكبد في منطقة خالية من الظلال. تحديد الكبسولة كخط صدى مشرق بالقرب من الجزء العلوي من الكبد.
  3. لاحظ أن مربع SWE الانتقالات إلى خريطة ملونة ضمن 5-10 s. بمجرد أن يصبح الصندوق ممتلئا ومستقرا، اضغط على زر التجميد على لوحة التحكم عندما يكون الحيوان بين الأنفاس.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحد الأدنى من التغطية مربع 60-80٪ لتقييم دقيق لمرونة الكبد.
  4. على الشاشة التي تعمل باللمس، انقر فوق QBox، وهي أداة نظام مدمجة تحسب المرونة من عائد الاستثمار على خريطة مرونة موجة القص. لاحظ الدائرة ومربع البيانات التي تظهر على جهاز العرض. ضبط موضع QBox عن طريق النقر على رمز الموضع على الشاشة التي تعمل باللمس إلى الإعداد المطلوب.
  5. ضبط حجم الدائرة إلى 3 مم عن طريق تحريك إصبع على طول الحافة الخارجية من trackball على لوحة التحكم. باستخدام trackball ، ضع الدائرة في منطقة خالية من الظل مع تلوين موحد(الشكل 5A، B). الحرص على تجنب المناطق المعروفة من تصلب مثل الأوعية الدموية أو كبسولة الكبد، فضلا عن نزيف أسفل من هذه الهياكل.
  6. عند العثور على مساحة كافية، اضغط على حفظ الصورة على لوحة التحكم لحفظ الصورة. كرر هذا الإجراء 3 مرات في مناطق مختلفة من الكبد. حرك المسبار لأعلى ولأعلى أو جانبيا على البطن لجمع صور مرسومة ب SWE من مناطق مختلفة من الكبد.
  7. بمجرد جمع جميع الصور، اضغط على إنهاء الفحص على لوحة التحكم، وأحاط علما بشاشة معلومات المريض التي تظهر على الشاشة.
  8. إزالة الشريط من الكفوف الحيوان، ومسح هلام الزائدة بعيدا، وإزالة الحيوان من مرحلة التصوير. السماح لها بالتعافي من التخدير في قفص دافئ وجاف في حد ذاته حتى يتعافى تماما. مراقبة كل لضمان الشفاء التام من التخدير، وأشار إلى قدرته على الحفاظ على شغل المؤخرة
  9. كرر الخطوات في الأقسام 4-5 لكل في الفوج ليتم تصويرها.

6. استرجاع البيانات وتحليل الصور

  1. عندما يتم جمع الصور لجميع الحيوانات، إيقاف التخدير.
  2. لسحب بيانات الصورة من الجهاز، اضغط على زر المراجعة على لوحة التحكم، ولاحظ جميع عمليات المسح التي أجريت على تلك الأداة التي تظهر على الشاشة. ابحث عن عمليات المسح المطلوبة باستخدام نافذة البحث في الزاوية العليا من الشاشة.
  3. حدد جميع عمليات المسح اللازمة لتحليل البيانات عن طريق تحديد المربع بجوار اسم المريض عبر زر trackball و Select. بمجرد تمييز جميع عمليات المسح المطلوبة، حدد تصدير JPEGs على الشاشة التي تعمل باللمس. تصدير البيانات إلى محرك أقراص شبكة أو محرك أقراص ناقل تسلسلي عالمي محمول (USB). حدد موقع منافذ USB على الجزء الخلفي من الجهاز.
  4. بمجرد تصدير الملفات، افتح ملفات jpg الفردية لكل فحص على كمبيوتر محطة عمل. مراقبة جميع البيانات على الجانب الأيمن من الصورة: B وضع نسبة جمع رقم نسبة B; س مربع جمع متوسط مرونة (kPa) القيمة.
  5. أدخل جميع البيانات في جدول بيانات أو برامج إدارة قواعد البيانات الأخرى، وأجر التحليلات الإحصائية المطلوبة.

7. التحليل النسيجي لعينات الكبد

  1. في نهاية الأسبوعالسادس، قم بإجراء التشريح على نصف الفوج من كل مجموعة لإجراء تحليل الهسطولوجي في منتصف الدراسة لعينات الكبد. وبالمثل، القتل الرحيم بقية الفوج من الحيوانات، وجمع عينات الكبد للتحليل النسيجي في نقطة زمنية الأسبوع12th.
  2. لتلطيخ ORO، إصلاح أقسام الكبد في 10٪ الفورماتين محايدة المخزنة مؤقتا، والتبريد لهم مع السكروز باستخدام محلول السكروز المبردة 30٪ بين عشية وضحاها على الأقل. كريو تضمين المقاطع في مركب درجة حرارة القطع الأمثل، والتبريد المقطع لهم على الشرائح المشحونة للتحضير لتلطيخ ORO.
  3. ضع أقسام التبريد في 100٪ بروبيلين غليكول لمدة 2 دقيقة تليها حضانة بين عشية وضحاها في حل ORO بنسبة 0.5٪. بعد إزالة من محلول ORO، وتفرق بين المقاطع في 85٪ بروبيلين غليكول لمدة 1 دقيقة، وشطف في الماء deionized، و counterstain مع تعديل Hematoxylin-Lillie ماير لمدة 1 دقيقة.
    1. وضع coverlips على الشرائح باستخدام وسط تصاعد مائي وتجفيفها في درجة حرارة الغرفة.
  4. بالنسبة ل PSR، deparaffinize الفورمالين الثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من شرائح قسم الكبد، ووضعها بين عشية وضحاها في السائل بوين، ومن ثم وصمة عار لهم باستخدام البقع الشريحة الآلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع بعض الخطوات الأمثل (1٪ حمض فوسفوليبديك لمدة 5 دقائق؛ 0.1٪ سيريوس الأحمر في حمض البريك المشبعة لمدة 90 دقيقة؛ 2 × 30 s غسل في 0.5٪ حمض الأسيك). يجفف الشرائح تلقائيا ثم يركبها مع وسيط دائم.
  5. التقاط صور من الشرائح ORO- و PSR الملطخة باستخدام الماسح الضوئي المجهر الرقمي في التكبير 20x، وحفظها في شكل .svs، وتخزينها في قاعدة بيانات الصور مدير الشريحة.
  6. تحليل الصور باستخدام خوارزميات مخصصة تم إنشاؤها في برامج علم الأمراض الرقمية. تطبيق تطبيقات برامج علم الأمراض الرقمية بشكل موحد مع معلمات العتبة لتحديد وقياس مساحة أقسام الكبد وكذلك المناطق الملطخة ب ORO و PSR. تصدير القياسات إلى جدول بيانات لحسابات النسبة المئوية للمنطقة.

8. التحليل الإحصائي

  1. إجراء تحليل إحصائي لبيانات التصوير باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه باستخدام اختبار المقارنات المتعددة ل Sidak لتقييم الفرق بين المجموعات في نقاط زمنية مختلفة. افترض وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات لقيم الاحتمال p ≤ 0.001. بالإضافة إلى ذلك، قم بإجراء ارتباط بين قراءات التصوير والتحليلات النسيجية.
  2. استخدم الإحصاءات غير البارامترية لتحليل نتائج التحليل النسيجي من هذه الدراسة. الإبلاغ عن قيم المجموعة كمتوسط ± النطاق شبه الوسطي (sIQR). افترض وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات لقيم الاحتمال p ≤ 0.001. استخدام اختبار مان ويتني لمقارنة كمية وصمة عار PSR وORO الهسوتوكيميائية بين مجموعات مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إحدى السمات المميزة للحيوانات التي تتغذى على CDAHFD هي الداء النتن. تراكم الدهون في الكبد يغير خصائص صدى للأنسجة، والتي يمكن قياسها كميا عن طريق قياس سطوع الكبد وتطبيعه إلى سطوع قشرة الكلى من صورة وضع B التي اتخذت في نفس المستوى. يتم التعبير عن القيمة الكمية كمؤشر الموارد البشرية، وهو مقياس غير مباشر للداء النتن. في الشكل 4A، تظهر صورة الكبد التمثيلية من التحكم سطوعا متساويا أو أقل تقريبا (صدى الصوت) مقارنة بالقشرة الكلوية. وبالتالي، فإن مؤشر الموارد البشرية للحيوانات العادية هو <1. في هذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير بالموجات فوق الصوتية، بما في ذلك SWE، يمكن أن يكون أداة لا تقدر بثمن للتقييم الطولي لداء الكبد وتصلب في نماذج ما قبل السريرية من NAFLD / NASH. تصف هذه الورقة منهجيات مفصلة حول كيفية الحصول على وضع B عالي الجودة بالإضافة إلى صور SWE للكبد لقياس مؤشر الموارد البشرية والمرونة باستخدام نموذج الفئران الناجم عن النظام الغذائي CDAHFD من NASH. علاوة على ذلك ، تظهر النتائج ارتباطا ممتازا لمؤشر الموارد البشرية والمرونة مع المعيار الذهبي للتقييم النسيجي لأنسجة الكبد. وفي حين يبدو أن الإجراء نفسه غير معقد، هناك بعض الجوانب ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين هم من موظفي شركة فايزر، وشركة

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا فريق عمليات الطب المقارن في شركة فايزر على عملهم الشاق في رعاية وضمان صحة الدراسة بالإضافة إلى المساعدة في بعض التقنيات. أيضا ، ويرجع الفضل في ذلك إلى دانييل كروويل ، غاري سييتس ، وجنيفر آشلي أولسون لمساعدتهم في معالجة الأنسجة للتحليلات النسيجية. بالإضافة إلى ذلك، يود المؤلفون أن يشكروا جوليتا راميريز على مراجعتها وتقديمها تعليقات قيمة أثناء إعداد هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Aixplorerأسرع من الصوت تخيلموجة القص أداة التصوير المرن
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 محول الطاقةالتخيللمحول الطاقة لموجة القص التصوير المرن
Alpha-driأقفاص الفئران الفراش
Aperio AT2 الماسحLeica Biosystemsعلم الأمراض الرقمي Brightfield الماسح
Compac 6 نظام التخديرVetEquipمبخر التخدير ونظام التوصيل. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي نظام توصيل تخدير.
إدارة قاعدة بيانات ImagerLeica Biosystemsعلم الأمراض الرقمي
Mayer's HematoxilinDako / AgilentH& E تلطيخ / علم الأنسجة
كنيسة ناير& زيت دوايتمزيل الشعر
تلطيخ الشرائح الآلي
VISIOPHARM برنامجVisiopharmبرنامج علم
البحوث الغذائيةA06071309iNASH يحفز النظام الغذائي
Purina5053التحكم في محطة تصوير
VevoFujifilm VisualSonicsتستخدم محطة التصوير Vevo لعقد محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية أثناء التصوير.
مختبراتنهر ويستار هان
الأسرع من الصوت الضوئي الضوئي الأحمر O solution Poly Scientific Lipid Staining / Histology Picrosirius Red Stain (PSR)Rowley Biochemical F-357-2 Collagen Stain / Histology Puralube Opthalmic مرهم Dechra تزييت المنتج البيطري لمنع جفاف العين أثناء التخدير Tissue-Tek Prisma Plus Sakura Finetek الولايات المتحدة الأمريكية الأمراض الرقمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
  2. Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
  3. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
  4. Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
  5. Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
  6. Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
  7. Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
  8. Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
  9. Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
  10. Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
  11. Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
  12. Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
  13. Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1(2018).
  14. Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
  15. Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
  16. Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Oil Red O Picrosirius Red

مقالات ذات صلة