لقد طورنا طريقة تثري وتعزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية عن الأنسجة المجمدة الطازجة لاستخدامها في التحليلات الجزيئية النهائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية البالغة عن القشرة الطازجة المجمدة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا يزال تعقيد الخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة البشرية الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها الجزيئي. يمكن استخدام فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) لعزل ودراسة مجموعات النوى العصبية البشرية (NeuN+) بنجاح من الأنسجة الأرشيفية المجمدة ، وبالتالي تجنب المشاكل المرتبطة بالتعامل مع الأنسجة الطازجة. ومع ذلك ، لا توجد جهود لعزل الخلايا الدبقية النجمية بالمثل عن العنصر غير العصبي (NeuN-). تستخدم استراتيجية وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها مؤخرا والتي تم التحقق منها ثلاثة أجسام مضادة لعامل النسخ لعزل مجموعات النوى العصبية المخصبة (NeuN+) في وقت واحد من الخلايا النجمية (بروتين الصندوق المقترن 6 (PAX6) + NeuN-) ، وسلف الخلايا قليلة التغصن (OLIG2 + NeuN-) من أنسجة القشرة المخية الجديدة البشرية الصدغية غير المريضة والطازجة (غير الثابتة) المجمدة بعد الوفاة.
وقد تبين أن هذه التقنية مفيدة لتوصيف التغييرات في النسخ الخاصة بنوع الخلية في القشرة المخية الجديدة للصرع المرضي الأساسي. أكدت التحليلات النسخية أن المجموعات المصنفة من PAX6 + NeuN يتم تخصيبها بقوة لعلامات الخلايا النجمية الشاملة والتقاط الخلايا النجمية في كل من ظروف الراحة والتفاعل. تصف هذه الورقة منهجية FANS لعزل مجموعات النوى الغنية بالخلايا النجمية عن القشرة البشرية المجمدة الطازجة ، بما في ذلك تفكك الأنسجة إلى تعليق أحادي النواة (sn) ؛ وضع علامات مناعية على النوى بالأجسام المضادة المضادة ل NeuN و PAX6 المترافقة بالفلورسنت ؛ استراتيجيات بوابات المراوح ومقاييس مراقبة الجودة لتحسين الحساسية والخصوصية أثناء الفرز وتأكيد إثراء الخلايا النجمية ؛ وأوصت بالشراء لتسلسل إمكانية الوصول إلى النسخ النهائي والكروماتين بدقة مجمعة أو sn. ينطبق هذا البروتوكول على العينات القشرية البشرية غير الميتة والمجمدة حديثا مع أمراض مختلفة وجمع الأنسجة الموصى بها بعد الوفاة في غضون 24 ساعة.
المقدمة
لا يزال التعقيد الجزيئي للخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها بدقة عالية ، سواء في الصحة أو المرض. لقد ثبت أن فصل الخلايا العصبية البشرية السليمة والدبقية عن مكانتها أمر صعب بسبب محدودية الوصول إلى عينات أنسجة المخ الجديدة ، والطبيعة المترابطة بشدة للعمليات الدبقية والعصبية ، والتنشيط الخلوي الحتمي أثناء المعالجة ، وكلها تحد من التوصيف الجزيئي لهذه الأنواع من الخلايا خارج الجسم الحي1 . ظهر فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) كبديل لفرز الخلايا الحية ، مما مكن من التفكك ووضع العلامات المناعية لمجموعات النوى من الأنسجة المجمدة. في العقد الماضي ، أصبحت FANS تستخدم على نطاق واسع لع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يضمن برنامج حماية المواد البشرية في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي (ISMMS) ومجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لها السلوك الأخلاقي للبحث والامتثال للوائح الفيدرالية والولائية والمؤسسية. في هذه الدراسة ، تم إلغاء تحديد جميع عينات ما بعد الوفاة المستخدمة ، وتم الحصول عليها بموجب الموافقة المناسبة من خلال المستودع الحيوي ، وتم إعفاؤها من تسمية "البحث البشري" من قبل IRB التابع ل ISMMS (HS#14-01007).
1. إعداد المخزن المؤقت
ملاحظة: في حالة إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي في المراحل النهائية، تعامل بدقة مع جميع مساحات العمل والأدوات باستخدام حل إزالة التلوث RNase لمنع تدهور الحمض النووي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم جمع النوى من أنسجة القشرة المخية الجديدة الصدغية الطازجة (غير الثابتة) المجمدة المفاجئة مع وقت جمع ما بعد الوفاة من 12 ساعة. بعد تفكك الأنسجة إلى تعليق النوى ، تم احتضان العينات بأجسام مضادة ضد NeuN و PAX6 و OLIG2 ، وتم فرزها وفقا للبوابة الموضحة في الشكل 1 والشكل 2. تم جمع النوى من مجموعات NeuN+، و PAX6+NeuN-، و OLIG2+NeuN- تم فرزها (الشكل 1E، F، والشكل 2F). كشفت لوحة qPCR المستهدفة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وينبغي وضع اللمسات الأخيرة على التصميم التجريبي وفقا للبروتوكول المحدد بعد النظر في عدة عوامل بيولوجية وتقنية. يتم تجميد عينات الأنسجة الأولية طازجة ، دون أن يتم إصلاحها ، ويفضل أن يكون لها فاصل زمني قصير لجمع ما بعد الوفاة لتحقيق أقصى قدر من استعادة النوى. استنادا إلى الخبرة ، يسمح مؤشر مديري المشتريات الذي يصل إلى 24 ساعة باستعادة النوى بشكل كاف ؛ ومع ذلك ، فإن PMI من 12 ساعة أو أقل هو الأفضل لتحسين استعادة النوى السليمة. عوامل إضافية بصرف النظر عن PMI ، بما في ذلك درجة حرارة تخزين الجسم ومستويات الأس الهيدروجيني للأنس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الأعضاء في علم الأمراض وجراحة الأعصاب في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي للمساعدة في شراء أنسجة المخ غير المحددة و ISMMS Flow Cytometry CORE للحصول على مشورة الخبراء. تم تمويل الدراسة جزئيا من قبل NIH RF1DA048810 و R01NS106229 و R03NS101581 (إلى N.M.T.) و R61DA048207 (إلى S.A).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10x PBS درجة الحموضة 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| استنساخ الأجسام المضادة المضادة للنيون A60 | Millipore | MAB377A5MI | الفأر المضاد للنيو مقترن بمركب فلوري AF555 (الإثارة ، 553 نانومتر ؛ انبعاث ، 568 نانومتر) |
| استنساخ الجسم المضاد المضاد ل OLIG2 211 | ميليبور | MABN50A4MI | الفأر المضاد ل OLIG2 مترافق مع مركب فلوري AF488 (الإثارة ، 499 نانومتر ؛ انبعاث ، 520 نانومتر) |
| بقري مصل الألبومين | فيشر | BP9704-100 | |
| غرفة عد الخط الساطع | Hausser Scientific | 3110V | |
| كلوريد الكالسيوم اللامائي | فيشر | C614-3 | |
| مصافي الخلايا ، 40 & micro ؛ M | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina ، Nextera | FC-121 & ndash ؛ 1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات | فيشر | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6 / 496) - 100 اختبار | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & amp المكثف | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Depollution Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | وقت التجزئة 2.5 دقيقة ، على النحو الموصى به لقيم RIN RNA المنخفضة. |
| السكروز ، معتمد من الكريستال ، ACS ، 500 مجم | فيشر | S5500 | |
| SW 41 Ti دوار دلو متأرجح | بيكمان كولتر | 331362 | |
| Tris-HCl ، محلول 1M ، درجة الحموضة 8.0 ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، | J22638AE | علمي حراري | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | خافض للتوتر السطحي غير أيوني في محلول التحلل |
| كاشف | TRIzol LSكاشف Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol | كاشف 15596026 | لعزل محلول RNA | |
| Trypan Blue ، 0.4٪ | Gibco | 15250061 | |
| أجهزة الطرد المركزي | الفائقة Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| أنابيب الطرد المركزي الفائق PP 9/16 X 3-1 / 2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure الماء المقطر ( RNAse ، خالي من الحمض النووي) يشار | إلى Invitrog | 10977023 | باسم الماء المقطر |
| Ultra Pure EDTA | Technologies | 15576-028 |
المراجع
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolati....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
