مقالة منهجية

طريقة مبسطة لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

DOI:

10.3791/62452

⸱

أبريل 13, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, School of Medicine, 2Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 3Center for Critical Care Nephrology, University of Pittsburgh, School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف بروتوكولا لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يولد هذا البروتوكول عضويات الكلى في غضون أسبوعين. يمكن استزراع عضويات الكلى الناتجة في قوارير دوارة واسعة النطاق أو لوحات تحريك مغناطيسية متعددة الآبار لنهج اختبار الأدوية المتوازية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفرت المواد العضوية الكلى المتولدة من hPSCs مصدرا غير محدود للأنسجة الكلوية. تعد عضويات الكلى البشرية أداة لا تقدر بثمن لدراسة أمراض الكلى والإصابات ، وتطوير العلاجات القائمة على الخلايا ، واختبار علاجات جديدة. لمثل هذه التطبيقات ، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من المواد العضوية الموحدة والفحوصات القابلة للتكرار للغاية. لقد بنينا على بروتوكول الكلى العضوي المنشور سابقا لتحسين الصحة العامة للعضويات. يتضمن هذا البروتوكول ثلاثي الأبعاد البسيط والقوي تكوين أجسام جنينية موحدة في الحد الأدنى من وسط المكونات الذي يحتوي على الدهون ، وملحق الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين وكحول البولي فينيل مع مثبط GSK3 (CHIR99021) لمدة 3 أيام ، تليها الثقافة في وسط يحتوي على استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR). بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الفحوصات التحريضية بتقليل تكتل الأجسام الجنينية والحفاظ على حجم موحد ، وهو أمر مهم لتقليل التباين بين المواد العضوية. بشكل عام ، يوفر البروتوكول طريقة سريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد كميات كبيرة من المواد العضوية في الكلى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير عدد من البروتوكولات للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في الكلى العضوية1،2،3،4،5. وقد وفرت عضويات الكلى أداة هامة للمساعدة في البحث في نهج الطب التجديدي الجديدة، والأمراض المرتبطة بالكلى النموذجية، وإجراء دراسات السمية وتطوير الأدوية العلاجية. على الرغم من قابليتها للتطبيق على نطاق واسع ، فإن المواد العضوية الكلوية لها قيود مثل نقص النضج ، وقدرة الثقافة المحدودة على المدى الطويل في المختبر ، وندرة العديد من أنواع الخلايا الموجودة في الكلى البشرية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع التجارب باستخدام مركبات الوقاية البشرية البشرية امتثالا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وأجريت في غطاء للسلامة الأحيائية من الفئة الثانية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. جميع الكواشف هي من الدرجة المستزرعة الخلوية ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم احتضان جميع الثقافات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 الغلاف الجوي الجوي. في جميع مراحل الفحص ، يمكن جمع الأجسام الجنينية أو عضويات الكلى ، وتثبيتها أو إعدادها للتحليل. تم تمييز خطوط hPSC المستخدمة لتوليد هذه البيانات بالكامل ونشرها18.

1. إعداد لوحات الثقافة

ملاحظة: قبل 1 ساعة تقريبا من تقسيم hPSCs ، قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة مقاس 2 ×....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الإصدار الأحدث من بروتوكولنا ، يبدأ التمايز العضوي للكلية في وسط محدد منخفض البروتين. يتم إجراء الفحوصات بالكامل في تعليق وتعتمد على القدرة الفطرية لتمايز hPSCs وتنظيمها لبدء تكوين الأنبوب. فحص واحد ينشأ من 100 مم ~ 60٪ لوحة ثقافة hPSC متقاربة تنتج بشكل روتيني 500-1000 من عضويات الكلى ، كما هو موضح في منشورنا السابق5. بسبب هذه الأعداد الكبيرة من المواد العضوية المتولدة ، فإن هذا البروتوكول مناسب تماما للاختبار المركب. نحن نستخدم بشكل روتيني تنسيق 6 آبار للاختبار المركب ومع ذلك ، يمكن بسهولة.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن خطوات البروتوكول الأولية حاسمة لتمايز الأديم المتوسطالوسيط 5،19،20 ، وبالتالي ، من الضروري تنفيذ تركيبة متوسطة صارمة في هذه المرحلة. قد تساعد إزالة المكونات غير المحددة مثل المصل والألبومين ووسط التهجين الخالي من البروتين II من المرحلة الأولى من البروتوكول على تحسين كفاءة التمايز المتسقة بين المقايسات21.

الحالة الأيضية لخلايا الكلى أمر بالغ الأهمية.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK069403 و UC2 DK126122 و P30-DK079307 ومؤسسة ASN لأبحاث الكلى برنامج زمالة بن ج. ليبس البحثي إلى AP.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-MercaptoethanolThermo Fisher21-985-023
محلول شطف مضاد للالتصاقSTEMCELL Technologies7010
CHIR99021STEMCELL Technologies72054مخزون 10 ملي مولار في DMSO
Corning  قوارير دوارة يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك07-201-152
Corning مرفق منخفض للغاية 6 ألواحآبار فيشر ساينتفيك07-200-601
أدوات التقليب البطيئة السرعة من كورنينجفيشر ساينتفيك11-495-03محرك مغناطيسي متعدد الألواح لثقافة قارورة الدوار
DispaseSTEMCELL Technologies7923Aliquot والتجميد
DMEM ، منخفض الجلوكوز ، البيروفات ، بدون جلوتامين ، بدون فينول أحمرثيرمو فيشر11054020
DPBS 1x ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومثيرمو فيشر14-190-250
قضبان تحريك بيضة / بيضاوية2magPI20106
ملاقط للأغراضExcelta Fisher Scientific17-456-103حافظ على معقمة في غطاء مزرعة الخلية
زجاجة وسائط للاستخدام الفردي EZBio ، 250 ملفوكس علوم الحياة138-3211-FLSتستخدم لصنع أطباق زراعة الأنسجة القياسية PVA 10٪
Falcon (100 مم)Thermo Fisher08-772E
Fisherbrand  ماصة شفط معقمة 2 ملفيشر ساینتفيك14-955-135
فيشربراند   ؛ رافعات الخلايا - رافع الخلايافيشر Scientific08-100-240
Fisherbrand  متعددة الوظائف 3D الدواراتفيشر Scientific88-861-047شاكر المداري
Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المخفضة مصفوفة الغشاء الأساسيThermo FisherA1413302<strong>BME< / strong>. Aliquot على الجليد وتجميد. بديل مصفوفة آخر مناسب هو Matrigel أو Cultrex.
كاشف تفكك الخلايا اللطيفSTEMCELL Technologies7174GCDR< / strong>
GlutaMAX مكملThermo Fisher35-050-061مكمل L-glutamine.
هيبس (1 م) ثيرموفيشر15-630-080
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامينثيرمو فيشر51-500-056< قوي > ITSE < / قوي >
KnockOut   ؛ استبدال المصل - متعدد الأنواعثيرمو فيشرA3181502KOSR. Aliquot
وتجميد خليط الدهون 1 ، معرف كيميائياMillipore-SigmaL0288-100ML
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةThermo Fisher11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP نظام الترشيح الفراغي المعقم 500 ملفيشر S2GPU05RE
MilliporeSigma & nbsp ؛ نظام الترشيح بالفراغ المعقم Stericup Quick Release-GP 250 ملفيشر ScientificS2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP وحدة التحكم2magVMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTPDrive 2magVMF 406006MSP
MP Biomedicals  7X محلول التنظيففيشر العلميMP0976670A4<قوي>منظف مناسب لزراعة الأنسجة.< / قوي> اصنع حلا بنسبة 5٪ في الماء
mTeSR1STEMCELL Technologies85850hPSC medium.TeSR-E8 و NutriStem XF و mTeSR Plus تم اختبارها أيضا وهي بدائل مناسبة.
Nunc 50 مل مخروطي ، أنابيب طرد مركزي معقمةفيشر Scientific12-565-270
Nunc 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقمةفيشر Scientific12-565-268
البنسلين الستربتومايسينالحرارية فيشر15-140-122Aliquot وتجميد
PlasmocinInvivogenant-mpt anti-mycoplasma recode.< / strong> Aliquot و تجميد
pluriStrainer® 200 & micro; مفيشر NC0776417مصفاة الخلية
العلمية pluriStrainer ® 500 & micro; ممصفاة خليةNC0822591 فيشر العلمية
بولي (كحول فينيل) 87-90٪ متحلل   ؛ (PVA)Millipore-SigmaP8136-250G10٪ في DPBS مع التحريك عند 98 درجة مئوية حتى يذوب ، اصنع 138-3211-FLS
ROCK مثبط Y-27632 (ROCKi)STEMCELL Technologies7230410 ملي مولار في DPBS
ماصات مصلية معقمة يمكن التخلص منها   ؛ - 10 ملفيشر ساينتفيك13-678-11E
ماصات مصلية معقمة يمكن التخلص منها - 25 ملفيشر ساینتفيك13-678-11
ماصة مصلية معقمة يمكن التخلص منها - 5 ملفيشر سيانتيفيك13-678-12D
TeSR-E5STEMCELL Technologies5916وسيط قاعدة منخفض البروتين وخالي من المصل ل <قوي>E5-ILP< / قوي>
Variomag distriBOX 2موزع 2magVMF 90512إذا كنت تستخدم أكثر من محرك MIXdrive
العامة : العلمي Microplate Stir

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Kidney OrganoidsHuman Pluripotent Stem CellsEmbryoid BodiesOrganoid DifferentiationSpinner Flask CultureMagnetic Stir PlateRenal TubulesPodocyte ClustersImmunofluorescence StainingEndothelial Cell Expansion

مقالات ذات صلة