هنا نصف بروتوكولا لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يولد هذا البروتوكول عضويات الكلى في غضون أسبوعين. يمكن استزراع عضويات الكلى الناتجة في قوارير دوارة واسعة النطاق أو لوحات تحريك مغناطيسية متعددة الآبار لنهج اختبار الأدوية المتوازية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة مبسطة لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد وفرت المواد العضوية الكلى المتولدة من hPSCs مصدرا غير محدود للأنسجة الكلوية. تعد عضويات الكلى البشرية أداة لا تقدر بثمن لدراسة أمراض الكلى والإصابات ، وتطوير العلاجات القائمة على الخلايا ، واختبار علاجات جديدة. لمثل هذه التطبيقات ، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من المواد العضوية الموحدة والفحوصات القابلة للتكرار للغاية. لقد بنينا على بروتوكول الكلى العضوي المنشور سابقا لتحسين الصحة العامة للعضويات. يتضمن هذا البروتوكول ثلاثي الأبعاد البسيط والقوي تكوين أجسام جنينية موحدة في الحد الأدنى من وسط المكونات الذي يحتوي على الدهون ، وملحق الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين وكحول البولي فينيل مع مثبط GSK3 (CHIR99021) لمدة 3 أيام ، تليها الثقافة في وسط يحتوي على استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR). بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الفحوصات التحريضية بتقليل تكتل الأجسام الجنينية والحفاظ على حجم موحد ، وهو أمر مهم لتقليل التباين بين المواد العضوية. بشكل عام ، يوفر البروتوكول طريقة سريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد كميات كبيرة من المواد العضوية في الكلى.
المقدمة
في السنوات الأخيرة ، تم تطوير عدد من البروتوكولات للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في الكلى العضوية1،2،3،4،5. وقد وفرت عضويات الكلى أداة هامة للمساعدة في البحث في نهج الطب التجديدي الجديدة، والأمراض المرتبطة بالكلى النموذجية، وإجراء دراسات السمية وتطوير الأدوية العلاجية. على الرغم من قابليتها للتطبيق على نطاق واسع ، فإن المواد العضوية الكلوية لها قيود مثل نقص النضج ، وقدرة الثقافة المحدودة على المدى الطويل في المختبر ، وندرة العديد من أنواع الخلايا الموجودة في الكلى البشرية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع التجارب باستخدام مركبات الوقاية البشرية البشرية امتثالا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وأجريت في غطاء للسلامة الأحيائية من الفئة الثانية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. جميع الكواشف هي من الدرجة المستزرعة الخلوية ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم احتضان جميع الثقافات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 الغلاف الجوي الجوي. في جميع مراحل الفحص ، يمكن جمع الأجسام الجنينية أو عضويات الكلى ، وتثبيتها أو إعدادها للتحليل. تم تمييز خطوط hPSC المستخدمة لتوليد هذه البيانات بالكامل ونشرها18.
1. إعداد لوحات الثقافة
ملاحظة: قبل 1 ساعة تقريبا من تقسيم hPSCs ، قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة مقاس 2 ×....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا الإصدار الأحدث من بروتوكولنا ، يبدأ التمايز العضوي للكلية في وسط محدد منخفض البروتين. يتم إجراء الفحوصات بالكامل في تعليق وتعتمد على القدرة الفطرية لتمايز hPSCs وتنظيمها لبدء تكوين الأنبوب. فحص واحد ينشأ من 100 مم ~ 60٪ لوحة ثقافة hPSC متقاربة تنتج بشكل روتيني 500-1000 من عضويات الكلى ، كما هو موضح في منشورنا السابق5. بسبب هذه الأعداد الكبيرة من المواد العضوية المتولدة ، فإن هذا البروتوكول مناسب تماما للاختبار المركب. نحن نستخدم بشكل روتيني تنسيق 6 آبار للاختبار المركب ومع ذلك ، يمكن بسهولة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن خطوات البروتوكول الأولية حاسمة لتمايز الأديم المتوسطالوسيط 5،19،20 ، وبالتالي ، من الضروري تنفيذ تركيبة متوسطة صارمة في هذه المرحلة. قد تساعد إزالة المكونات غير المحددة مثل المصل والألبومين ووسط التهجين الخالي من البروتين II من المرحلة الأولى من البروتوكول على تحسين كفاءة التمايز المتسقة بين المقايسات21.
الحالة الأيضية لخلايا الكلى أمر بالغ الأهمية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK069403 و UC2 DK126122 و P30-DK079307 ومؤسسة ASN لأبحاث الكلى برنامج زمالة بن ج. ليبس البحثي إلى AP.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| محلول شطف مضاد للالتصاق | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | مخزون 10 ملي مولار في DMSO |
| Corning قوارير دوارة يمكن التخلص منها | فيشر ساينتفيك | 07-201-152 | |
| Corning مرفق منخفض للغاية 6 ألواح | آبار فيشر ساينتفيك | 07-200-601 | |
| أدوات التقليب البطيئة السرعة من كورنينج | فيشر ساينتفيك | 11-495-03 | محرك مغناطيسي متعدد الألواح لثقافة قارورة الدوار |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot والتجميد |
| DMEM ، منخفض الجلوكوز ، البيروفات ، بدون جلوتامين ، بدون فينول أحمر | ثيرمو فيشر | 11054020 | |
| DPBS 1x ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | ثيرمو فيشر | 14-190-250 | |
| قضبان تحريك بيضة / بيضاوية | 2mag | PI20106 | |
| ملاقط للأغراض | Excelta Fisher Scientific | 17-456-103 | حافظ على معقمة في غطاء مزرعة الخلية |
| زجاجة وسائط للاستخدام الفردي EZBio ، 250 مل | فوكس علوم الحياة | 138-3211-FLS | تستخدم لصنع أطباق زراعة الأنسجة القياسية PVA 10٪ |
| Falcon (100 مم) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand ماصة شفط معقمة 2 مل | فيشر ساینتفيك | 14-955-135 | |
| فيشربراند ؛ رافعات الخلايا - رافع الخلايا | فيشر Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand متعددة الوظائف 3D الدوارات | فيشر Scientific | 88-861-047 | شاكر المداري |
| Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المخفضة مصفوفة الغشاء الأساسي | Thermo Fisher | A1413302< | strong>BME< / strong>. Aliquot على الجليد وتجميد. بديل مصفوفة آخر مناسب هو Matrigel أو Cultrex. |
| كاشف تفكك الخلايا اللطيف | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR< / strong> |
| GlutaMAX مكمل | Thermo Fisher | 35-050-061 | مكمل L-glutamine. |
| هيبس (1 م) ثيرمو | فيشر | 15-630-080 | |
| الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين | ثيرمو فيشر | 51-500-056 | < قوي > ITSE < / قوي > |
| KnockOut ؛ استبدال المصل - متعدد الأنواع | ثيرمو فيشر | A3181502 | KOSR. Aliquot |
| وتجميد خليط الدهون 1 ، معرف كيميائيا | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP نظام الترشيح الفراغي المعقم 500 مل | فيشر S2GPU05RE | ||
| MilliporeSigma & nbsp ؛ نظام الترشيح بالفراغ المعقم Stericup Quick Release-GP 250 مل | فيشر Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP وحدة التحكم | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP | Drive 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X محلول التنظيف | فيشر العلمي | MP0976670A4 | <قوي>منظف مناسب لزراعة الأنسجة.< / قوي> اصنع حلا بنسبة 5٪ في الماء |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8 و NutriStem XF و mTeSR Plus تم اختبارها أيضا وهي بدائل مناسبة. |
| Nunc 50 مل مخروطي ، أنابيب طرد مركزي معقمة | فيشر Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقمة | فيشر Scientific | 12-565-268 | |
| البنسلين الستربتومايسين | الحرارية فيشر | 15-140-122 | Aliquot وتجميد |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | anti-mycoplasma recode.< / strong> Aliquot و تجميد |
| pluriStrainer® 200 & micro; م | فيشر NC0776417 | مصفاة الخلية | |
| العلمية pluriStrainer ® 500 & micro; م | مصفاة خلية | NC0822591 فيشر العلمية | |
| بولي (كحول فينيل) 87-90٪ متحلل ؛ (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10٪ في DPBS مع التحريك عند 98 درجة مئوية حتى يذوب ، اصنع 138-3211-FLS |
| ROCK مثبط Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 ملي مولار في DPBS |
| ماصات مصلية معقمة يمكن التخلص منها ؛ - 10 مل | فيشر ساينتفيك | 13-678-11E | |
| ماصات مصلية معقمة يمكن التخلص منها - 25 مل | فيشر ساینتفيك | 13-678-11 | |
| ماصة مصلية معقمة يمكن التخلص منها - 5 مل | فيشر سيانتيفيك | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | وسيط قاعدة منخفض البروتين وخالي من المصل ل <قوي>E5-ILP< / قوي> |
| Variomag distriBOX 2 | موزع 2mag | VMF 90512 | إذا كنت تستخدم أكثر من محرك MIXdrive |
المراجع
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
