مقالة منهجية

رسم خرائط حلقات R و RNA: هجينة الحمض النووي باستخدام طرق الترسيب المناعي المستندة إلى S9.6

3.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62455

⸱

أغسطس 24, 2021

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

في هذه المقالة

ملخص

تشكل حلقات R فئة سائدة من هياكل الحمض النووي غير B التي تعتمد على النسخ والتي تحدث في جميع الجينومات اعتمادا على كل من تسلسل الحمض النووي والتفضيل الطوبولوجي. في السنوات الأخيرة ، تورطت حلقات R في مجموعة متنوعة من الأدوار التكيفية وغير القادرة على التكيف وتم ربطها بعدم الاستقرار الجيني في سياق الاضطرابات البشرية. نتيجة لذلك ، فإن رسم الخرائط الدقيقة لهذه الهياكل في الجينوم له أهمية كبيرة للعديد من الباحثين. يتم وصف DRIP-seq (DNA: RNA Immunoprecipitation متبوعا بتسلسل عالي الإنتاجية) هنا. إنها تقنية قوية وقابلة للتكرار تسمح برسم خرائط دقيقة وشبه كمية لحلقات R. تم أيضا وصف تكرار حديث للطريقة حيث يتم تحقيق التجزئة باستخدام صوتنة (sDRIP-seq) ، مما يسمح برسم خرائط خاصة بالخيط وعالية الدقة لحلقات R. وبالتالي يعالج sDRIP-seq بعض القيود الشائعة لطريقة DRIP-seq من حيث الدقة والجدل ، مما يجعلها طريقة مفضلة لرسم خرائط حلقة R.

الملخص

تشكل حلقات R فئة سائدة من هياكل الحمض النووي غير B التي تعتمد على النسخ والتي تحدث في جميع الجينومات اعتمادا على كل من تسلسل الحمض النووي والتفضيل الطوبولوجي. في السنوات الأخيرة ، تورطت حلقات R في مجموعة متنوعة من الأدوار التكيفية وغير القادرة على التكيف وتم ربطها بعدم الاستقرار الجيني في سياق الاضطرابات البشرية. نتيجة لذلك ، فإن رسم الخرائط الدقيقة لهذه الهياكل في الجينوم له أهمية كبيرة للعديد من الباحثين. يتم وصف DRIP-seq (DNA: RNA Immunoprecipitation متبوعا بتسلسل عالي الإنتاجية) هنا. إنها تقنية قوية وقابلة للتكرار تسمح برسم خرائط دقيقة وشبه كمية لحلقات R. تم أيضا وصف تكرار حديث للطريقة حيث يتم تحقيق التجزئة باستخدام صوتنة (sDRIP-seq) ، مما يسمح برسم خرائط خاصة بالخيط وعالية الدقة لحلقات R. وبالتالي يعالج sDRIP-seq بعض القيود الشائعة لطريقة DRIP-seq من حيث الدقة والجدل ، مما يجعلها طريقة مفضلة لرسم خرائط حلقة R.

المقدمة

حلقات R عبارة عن هياكل حمض نووي ثلاثية الشريطة تتشكل بشكل أساسي أثناء النسخ عند تهجين نسخة الحمض النووي الريبي الناشئ إلى خيط الحمض النووي النموذجي. ينتج عن هذا تكوين هجين RNA: DNA ويسبب إزاحة خيط الحمض النووي غير القالب في حالة حلقة أحادية الشريطة. أثبتت إعادة التكوين البيوكيميائية1،2،3،4 والنمذجة الرياضية5 ، بالاشتراك مع القياسات الفيزيائية الحيويةالأخرى 6،7 ، أن الحلقات R من المرجح أن تحدث في المناطق التي تظهر خصائص مواتية محددة. على سبيل المثال ، المناطق التي تظهر عدم تناسق الخيوط في توزيع الجوانين (G) والسيتوزين (C) بحيث يكون الحمض النووي الريبي غنيا ب G ، وهي خاصية تسمى انحراف GC الإيجابي ، مفضلة لتشكيل حلقات R عند نسخها بسبب الاستقرار الديناميكي الحراري العالي للحمض النووي: هجين الحمض النووي الريبي مقارنة بثنائي الحمض النووي8. المناطق التي طورت انحراف GC الإيجابي ، مثل الأجزاء المبكرة من العديد من الجينات حقيقية النواة4،9،10،11 ، عرضة لتكوين حلقات R في المختبر وفي الجسم الحي3،4،12. يفضل الإجهاد الحلزوني الفائق للحمض النووي السالب أيضا تكوين الهيكل13،14 لأن حلقات R تمتص بكفاءة مثل هذه الضغوط الطوبولوجية وتعيد ألياف الحمض النووي المحيطة إلى حالة استرخاء مواتية5،15.

تاريخيا ، اعتبرت هياكل الحلقة R ناتجة عن تشابكات نادرة وتلقائية للحمض النووي الريبي مع الحمض النووي أثناء النسخ. ومع ذلك ، فإن تطوير الحمض النووي: ترسيب مناعي الحمض النووي الريبي (DRIP) إلى جانب تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية (DRIP-seq) سمح برسم خرائط أول على مستوى الجينوم لحلقات R وكشف أن هذه الهياكل أكثر انتشارا بكثير مما كان متوقعا في الخلايا البشرية4،16. تحدث حلقات R على مدى عشرات الآلاف من النقاط الساخنة المحفوظة والمنسوخة والجينية في جينومات الثدييات ، مع ميل لجزر CpG المنحرفة GC التي تتداخل مع أول إنترون للجينات والمناطق الطرفية للعديد من الجينات17. بشكل عام ، تشغل حلقات R مجتمعة 3٪ -5٪ من الجينوم في الخلايا البشرية ، بما يتفق مع القياسات في الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك الخمائر والنباتات والذباب والفئران18،19،20،21،22.

كشف تحليل النقاط الساخنة التي تشكل حلقة R في الخلايا البشرية أن هذه المناطق ترتبط بتوقيعات كروماتين محددة23. توجد حلقات R ، بشكل عام ، في مناطق ذات إشغال أقل للنوكليوسوم وكثافة أعلى لبوليميراز الحمض النووي الريبي. في المروجين ، ترتبط حلقات R بزيادة تجنيد تعديلين من الهيستون المودعين في النسخ المشترك ، H3K4me1 و H3K36me317. في نهاية الجينات ، ترتبط حلقات R بالجينات المرتبة عن كثب والتي تخضع لإنهاء نسخ فعال17 ، بما يتفق مع الملاحظات السابقة24. كما تبين أن حلقات R تشارك في بدء تكرار الحمض النووي في أصول النسخ المتماثل للعاثيات ، والبلازميد ، والميتوكوندريا ، وجينومات الخميرة25،26،27،28،29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل 76٪ من مروجي جزر CpG البشريين المعرضين لحلقة R كأصول النسخ المتماثل التأسيسيةالمبكرة 32،33،34،35 ، مما يعزز الروابط بين حلقات R وأصول النسخ المتماثل. بشكل جماعي ، تشير هذه الدراسات إلى أن حلقات R تمثل نوعا جديدا من الإشارات البيولوجية التي يمكن أن تؤدي إلى مخرجات بيولوجية محددة بطريقة تعتمد على السياق23.

في وقت مبكر ، تبين أن حلقات R تتشكل في تسلسلات تبديل الفصل أثناء عملية إعادة تركيب تبديل فئة الغلوبولينالمناعي 3،36،37. يعتقد أن حلقات R المبرمجة هذه تبدأ إعادة تركيب تبديل الفئة من خلال إدخال فواصل الحمض النووي المزدوجة الشريطة38. منذ ذلك الحين ، تم ربط تكوين حلقة R الضارة ، التي يفهم عموما أنها ناتجة عن تكوين حلقة R المفرطة ، بعدم الاستقرار الجيني وعمليات مثل فرط إعادة التركيب ، وتصادمات النسخ والنسخ المتماثل ، والنسخ المتماثل ، وإجهاد النسخ (للمراجعة39،40،41،42،43). نتيجة لذلك ، يمثل رسم الخرائط المحسنة لهياكل الحلقة R تحديا مثيرا وأساسيا لفك تشفير توزيع ووظيفة هذه الهياكل بشكل أفضل في الصحة والمرض.

يعتمد الحمض النووي: ترسيب مناعي الحمض النووي الريبي (DRIP) على تقارب عال للجسم المضاد أحادي النسيلة S9.6 لهجينة الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي44. يسمح DRIP-seq بالتنميط القوي على مستوى الجينوم لتكوين حلقةR 4،45. على الرغم من أن هذه التقنية مفيدة ، إلا أنها تعاني من دقة محدودة نظرا لحقيقة أن إنزيمات التقييد تستخدم لتحقيق تجزئة حمض النووي اللطيفة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوفر DRIP-seq معلومات عن اتجاه تكوين حلقة R. هنا ، نبلغ عن متغير من DRIP-seq يسمح بتعيين حلقات R بدقة عالية بطريقة خاصة بخيوط محددة. تعتمد هذه الطريقة على صوتنة لتجزئة الجينوم قبل الترسيب المناعي ، وبالتالي تسمى الطريقة sDRIP-seq (صوتنة الحمض النووي: ترسيب مناعي الحمض النووي الريبي إلى جانب تسلسل عالي الإنتاجية) (الشكل 1). يسمح استخدام الصوتنة بزيادة الدقة ويحد من تحيزات التجزئة المرتبطة بالإنزيم التقييد التي لوحظت في مناهج DRIP-seq46. ينتج sDRIP-seq خرائط حلقة R تتفق بشدة مع النتائج من كل من DRIP-seq وطريقة DRIPc-seq عالية الدقة الموصوفة سابقا والتي يتم فيها بناء مكتبات التسلسل من خيوط الحمض النووي الريبي لهياكل حلقة R المترسبة المناعية45.

في مواجهة عدد كبير من الطرق للاختيار من بينها ، قد يتساءل المستخدمون عن النهج المعين القائم على DRIP المفضل لاحتياجاتهم. نحن نقدم النصائح التالية. DRIP-seq ، على الرغم من حدوده ، هو الأسهل من الناحية الفنية وهو الأقوى (أعلى عوائد) من بين جميع الطرق الثلاث التي تمت مناقشتها هنا ؛ وبالتالي تظل مفيدة على نطاق واسع. تم نشر العديد من مجموعات بيانات DRIP-seq ، والتي توفر نقطة مقارنة مفيدة لمجموعات البيانات الجديدة. أخيرا ، يعد خط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية أبسط لأن البيانات ليست متقطعة بالتقطع. يوصى بأن يبدأ المستخدمون الجدد في شحذ مهاراتهم في رسم خرائط حلقة R باستخدام DRIP متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) و DRIP-seq. يمثل sDRIP-seq درجة أعلى قليلا من الصعوبة التقنية: يتم تقليل الغلة بشكل طفيف بسبب صوتنة (تمت مناقشتها أدناه) وتكون عملية مكتبة التسلسل أكثر تعقيدا قليلا. ومع ذلك ، فإن مكاسب التوقف عن السبل والدقة العالية لا تقدر بثمن. يلاحظ أن sDRIP-seq سوف يلتقط كلا من الحمض النووي الريبي ثنائي الشريطة: هجينة الحمض النووي وحلقات R ثلاثية الشريط. نظرا لخطوات بناء المكتبة ، لن يلتقط DRIP-seq هجينة RNA: DNA ثنائية الشريطة. DRIPc-seq هو الأكثر تطلبا من الناحية الفنية ويتطلب كمية أكبر من المواد الأولية. في المقابل ، فإنه يوفر أعلى دقة وتقطعت بهم السبل. نظرا لأن مكتبات التسلسل مبنية من جزء الحمض النووي الريبي لحلقات R أو الهجينة ، فقد يعاني DRIPc-seq من تلوث محتمل بالحمض النووي الريبي ، خاصة وأن S9.6 يمتلك تقاربا متبقيا ل dsRNA19،47،48. يسمح sDRIP-seq برسم خرائط عالية الدقة خاصة بالخيوط دون القلق بشأن تلوث الحمض النووي الريبي نظرا لأن مكتبات التسلسل مشتقة من خيوط الحمض النووي. بشكل عام ، تظل هذه الطرق الثلاث مفيدة وتقدم درجات مختلفة من التعقيد ومحاذير مختلفة قليلا. ومع ذلك ، فإن الثلاثة تنتج مجموعات بيانات متطابقةللغاية 48 وهي حساسة للغاية للمعالجة المسبقة ل RNase H ، والتي تمثل عنصرا أساسيا في التحكم لضمان خصوصية الإشارة45،49. يلاحظ أنه بالنظر إلى اختيار الحجم المفروض على مكتبات التسلسل ، سيتم استبعاد الهجينة الصغيرة (تقدر ب <75 نقطة أساس) ، مثل تلك التي تتشكل بشكل عابر حول مواقع تحضير تكرار الحمض النووي المتأخرة (بادئات أوكازاكي). وبالمثل ، نظرا لأن جميع طرق DRIP تتضمن تجزئة الحمض النووي ، فإن حلقات R غير المستقرة التي تتطلب الالتفاف الفائق للحمض النووي السلبي لاستقرارهاستفقد 5. وبالتالي ، قد تقلل مناهج DRIP من أحمال حلقة R ، خاصة بالنسبة لحلقات R القصيرة وغير المستقرة التي يمكن التقاطها بشكل أفضل باستخدام مناهج in vivo 45،48. يلاحظ أنه يمكن أيضا تحديد حلقات R بطريقة مستقلة عن S9.6 في تغطية عميقة وعالية الدقة وبطريقة خاصة بخيوط على جزيئات الحمض النووي المفردة بعد معالجة ثنائي كبريتيت الصوديوم12. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام استراتيجيات تستخدم إنزيم RNase H1 غير النشط تحفيزيا لتعيين حلقات R الأصلية في الجسم الحي ، مع تسليط الضوء على حلقات R القصيرة وغير المستقرة التي تتشكل بشكل أساسي عند المحفزات المتوقفةمؤقتا 50،51،52.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تحسين البروتوكول التالي لخط خلايا Ntera-2 البشري المزروع في المزرعة ، ولكن تم تكييفه بنجاح دون تعديل مع مجموعة من خطوط الخلايا البشرية الأخرى (HEK293 ، K562 ، HeLa ، U2OS) ، الخلايا الأولية (الخلايا الليفية ، الخلايا البائية) وكذلك في الكائنات الحية الأخرى ذات التعديلات الصغيرة (الفئران ، الذباب).

1. حصاد الخلايا وتحللها

  1. زراعة خلايا Ntera-2 إلى 75٪ -85٪ التقاء. تأكد من أن العدد الأمثل للخلايا هو 5 إلى 6 ملايين خلية مع >90٪ من الأعداد القابلة للتطبيق لبدء أي إجراء DRIP.
  2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS ، وأضف 1.5 مل من Trypsin-EDTA 1x ، ثم احتضن لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا عن الطبق.
  3. أضف 5 مل من الوسائط الدافئة والماصة جيدا لإعادة تعليق الخلايا في معلق خلية واحدة. انقل المحتوى إلى أنبوب جديد سعة 15 مل وقم بتكسير الخلايا برفق عند 300 × جم لمدة 3 دقائق.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 مل من 1x PBS وحبيبات الخلايا برفق عند 300 × جم لمدة 3 دقائق.
  5. أعد تعليق الخلايا بالكامل في 1.6 مل من المخزن المؤقت TE (10 ملي مولار Tris-Cl الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 1 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0). أضف 5 ميكرولتر من البروتيناز K (محلول مخزون 20 مجم / مل) و 50 ميكرولتر من SDS (محلول مخزون 20٪) واقلب الأنابيب برفق خمس مرات حتى يصبح المحلول لزجا. لا تحاول ماصة المحلول ، فقط تخلط عن طريق الانعكاس.
  6. احتضان الأنابيب طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

2. استخراج الحمض النووي

  1. صب محللة الحمض النووي في أنبوب جل قفل الطور عالي الكثافة سعة 15 مل مسبقا وأضف حجما واحدا (1.6 مل) من كحول الفينول / الكلوروفورم إيزوأميل (25:24:1). اقلبها برفق خمس مرات ثم اقلبها لأسفل عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 1/10 حجم من أسيتات الصوديوم 3 M (NaOAc) (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. صب الطور المائي العلوي من أنبوب هلام قفل الطور واقلبها برفق حتى يترسب الحمض النووي بالكامل (حتى 10 دقائق).
  3. قم بتخزين خيوط الحمض النووي باستخدام طرف عريض سعة 1,000 ميكرولتر ونقله إلى أنبوب نظيف سعة 2 مل مع الحرص على عدم حمل المادة الطاففية المتبقية.
  4. اغسل الحمض النووي بإضافة 1.5 مل من 80٪ من الإيثانول واقلب الأنبوب برفق خمس مرات. احتضن لمدة 10 دقائق.
  5. كرر الخطوة السابقة مرتين. لا تستخدم أجهزة الطرد المركزي أثناء خطوات الغسيل. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول بعناية عن طريق سحب العينات بعد الغسيل الأخير مع محاولة عدم إزعاج الحمض النووي.
  6. اترك الحمض النووي يجف تماما في الهواء أثناء عكس الأنبوب. يمكن أن تستغرق هذه الخطوة 30 دقيقة -1 ساعة حسب كمية الحمض النووي.
  7. أضف 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE مباشرة على حبيبات الحمض النووي لتفتيت الحمض النووي من خلال هضم إنزيم التقييد أو 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE لقص الحمض النووي من خلال الصوتنة. احتفظ بالثلج لمدة ساعة واحدة وأعد تعليق الحمض النووي برفق عن طريق سحب العينات عدة مرات بطرف عريض 200 ميكرولتر. اتركيه على الثلج لمدة 1 ساعة قبل البدء في خطوة التجزئة.

3. تجزئة الحمض النووي

ملاحظة: للحصول على تسلسل DRIP-القائم على إنزيم التقييد ، اتبع الخطوة 3.1. بالنسبة إلى DRIP-seq المستندة إلى الصوتنة ، انتقل إلى الخطوة 3.2.

  1. تجزئة إنزيم التقييد (RE)
    1. هضم الحمض النووي الجيني المعلق (لزج جدا) باستخدام مزيج من الطاقة المتجددة وفقا لتعليمات المورد.
      1. أضف 0.1 ملي سبيرميدين إلى التفاعل النهائي. استخدم مزيجا من 4-5 إنزيمات مع 30 وحدة من كل إنزيم بحجم إجمالي 150 ميكرولتر.
        ملاحظة: تم تطوير الكوكتيل الأولي ل DRIP-seq (HindIII و SspI و EcoRI و BsrGI و XbaI)4 لتوليد متوسط طول جزء يبلغ 5 كيلو قاعدة. تجنب أي تدخل في مثيلة CpG وتجنب المناطق الغنية ب GC من الجينوم. الكوكتيلات الأخرى ممكنةأيضا 16). هذه الكوكتيلات مناسبة لكل من جينومات الإنسان والفأر ولكن يمكن تعديلها حسب الحاجة.
      2. احتضان خليط التفاعل طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب ألا يكون خليط الحمض النووي بعد الهضم لزجا. أي لزوجة متبقية في هذه الخطوة تدل على عدم اكتمال الهضم.
      3. إذا لوحظ ، أضف 10 وحدة إضافية من كل إنزيم واحتضن لمدة 2-4 ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: قد لا يقوم المستخدمون بهضم الحبيبات بأكملها في حالة حصاد خلايا أكثر مما هو موصى به هنا.
    2. قم بعمل ماصة الحمض النووي المهضوم طوال الليل برفق (150 ميكرولتر) في أنبوب إضاءة جل قفل الطور 2 مل مغزول مسبقا. أضف 100 ميكرولتر من الماء وحجم واحد (250 ميكرولتر) من كحول الفينول / الكلوروفورم إيزواميل (25: 24: 1). اقلبها برفق خمس مرات وقم بالدوران لأسفل عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق.
    3. أضف 1.5 ميكرولتر من الجليكوجين ، و 1/10 حجم 3 M NaOAc (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ماصة الحمض النووي من أنبوب هلام قفل الطور واخلطه عن طريق عكس خمس مرات. احتضان لمدة 1 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    4. تدور عند 16,000 × جم لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل الحمض النووي ب 200 ميكرولتر من 80٪ إيثانول وقم بالدوران عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. جفف الحبيبات في الهواء وأضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى الحبيبات. اترك الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة وأعد تعليق الحمض النووي برفق.
    6. قم بقياس تركيز (OD260) للحمض النووي المجزأ باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    7. اختياري ولكن موصى به: قم بتحميل 1 ميكروغرام من الحمض النووي المهضوم على جل الاغاروز بنسبة 0.8٪ جنبا إلى جنب مع علامة الحجم للتحقق من اكتمال عملية الهضم. قم بتشغيل الجل لمدة ساعة عند 100 فولت.
      ملاحظة: إذا كان غير مكتمل ، يمكن إضافة إنزيم إضافي. يمكن أن يؤدي الهضم غير المكتمل إلى فقدان الدقة بعد الترسيب المناعي.
    8. بعد هذه الخطوة ، عالج 10 ميكروغرام من الحمض النووي المهضوم ب 4 ميكرولتر من الريبونوكلياز H (RNase H) لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية للتأكد من أن الإشارة المسترجعة عند الترسيب المناعي مشتقة من الحمض النووي: الحمض النووي الريبي الهجين. ثم انتقل إلى S9.6 مناعي الترسيب (الخطوة 4).
      ملاحظة: يمكن حفظ الحمض النووي المهضوم مجمدا عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد دون خسارة كبيرة في المحصول.
  2. صوتنة
    1. قم بتقطيع كل أو جزء من الحمض النووي المستخرج في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل بحجم إجمالي 100 ميكرولتر. قم بإجراء 15-20 دورة من 30 ثانية ON / 30 ثانية OFF على مكبر الصوت (تدور بعد 5 و 10 و 15 دورة لضمان صوتنة متجانسة).
    2. قياس تركيز (OD260) من الحمض النووي الصوتي على مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب أن تختفي لزوجة الحمض النووي.
    3. قم بتشغيل هلام الاغاروز لتأكيد توزيع حجم الحمض النووي الموبعة (300-500 نقطة أساس).
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي الإفراط في صوتنة الحمض النووي إلى انخفاض كبير في العائد الناتج عن كسر وتفكك هياكل حلقة R.
    4. بعد هذه الخطوة ، عالج 10 ميكروغرام من الحمض النووي الموبعة صوتنة مع 4 ميكرولتر من RNase H لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية للتأكد من أن الإشارة المسترجعة عند الترسيب المناعي مشتقة من الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي الهجين. ثم انتقل إلى S9.6 مناعي الترسيب (الخطوة 4).

4. S9.6 الترسيب المناعي

ملاحظة: تتشابه خطوات الترسيب المناعي بغض النظر عما إذا كان الحمض النووي مجزأ من خلال REs أو الصوتنة.

  1. قم بإعداد ثلاثة أنابيب وتناول 4.4 ميكروغرام من الحمض النووي المجزأ في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE لكل أنبوب. وفر 50 ميكرولتر (1/10 من الحجم) من كل أنبوب لاستخدامه لاحقا كإدخال للحمض النووي.
  2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم 10x (100 ملي مولار NaPO4 الرقم الهيدروجيني 7 ، 1.4 M كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ Triton X-100) و 10 ميكرولتر من الجسم المضاد S9.6 (1 مجم / مل) إلى 450 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف.
  3. احتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية على دوار أنبوب صغير عند 7-10 دورة في الدقيقة.
  4. لكل أنبوب ، اغسل 50 ميكرولتر من ملاط حبة البروتين A / G مع 700 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت الملزم عن طريق قلب الأنابيب على دوار صغير عند 7-10 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بتدوير الخرزات عند 1,100 × جم لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  5. أضف الحمض النووي من الخطوة 4.3 إلى 50 ميكرولتر من الخرزات واحتضنه لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية أثناء الانقلاب عند 7-10 دورة في الدقيقة على دوار صغير.
  6. قم بتدوير الخرزات لمدة 1 دقيقة عند 1,100 × جم وتخلص من المادة الطافية.
  7. اغسل الخرزات ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x عن طريق الانقلاب عند 7-10 دورة في الدقيقة على دوار صغير لمدة 15 دقيقة. قم بالدوران لمدة دقيقة واحدة عند 1,100 × جم وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  8. أضف 250 ميكرولتر من مخزن الشطف (50 ملي مولار Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 8 ، 10 ملي مولار ، درجة الحموضة EDTA 8 ، 0.5٪ SDS) و 7 ميكرولتر من البروتيناز K (مخزون 20 مجم / مل) إلى الخرزات واحتضانها مع الدوران عند 55 درجة مئوية (12 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة.
  9. قم بتدوير الخرزات لمدة 1 دقيقة عند 1,100 × جم. انقل المادة الطافية إلى أنبوب إضاءة جل قفل الطور 2 مل مسبقا وأضف حجما واحدا (250 ميكرولتر) من كحول الفينول / الكلوروفورم إيزوأميل (25:24:1). اقلب الأنابيب خمس مرات وقم بتدويرها لمدة 10 دقائق عند 16,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  10. أضف 1.5 ميكرولتر من الجليكوجين ، و 1/10 حجم 3M NaOAc (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ماصة الحمض النووي من أنبوب هلام قفل الطور واخلطه عن طريق عكس خمس مرات. احتضان لمدة 1 ساعة عند -20 درجة مئوية.
  11. تدور عند 16,000 × جم لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل الحمض النووي ب 200 ميكرولتر من 80٪ إيثانول وقم بالدوران عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. جفف الكريات في الهواء وأضف 15 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8) في كل أنبوب. اترك الأنابيب على الجليد لمدة 20 دقيقة ثم أعلقها برفق. اجمع محتويات الأنابيب الثلاثة في أنبوب واحد (45 ميكرولتر).
  13. تحقق من كفاءة DRIP بواسطة qPCR باستخدام 5 ميكرولتر من 45 ميكرولتر من الحمض النووي المعلق (انظر النتائج التمثيلية). خفف 5 ميكرولتر في 10 ميكرولتر من الماء واستخدم 2 ميكرولتر لكل تفاعل.

5. خطوة ما قبل المكتبة للحمض النووي الموفوق الصوتية فقط

ملاحظة: يؤدي صوتنة إلى كسر خيط ssDNA النازح من حلقات R. وبالتالي ، يتم تحويل هياكل حلقة R ثلاثية الشريطة إلى هجينة من الحمض النووي الريبي ثنائي الشريطة: الحمض النووي الريبي عند الصوتنة. نتيجة لذلك ، يجب تحويل هذه الحمض النووي: الحمض النووي الريبي الهجينة مرة أخرى إلى الحمض النووي مزدوج الشريطة قبل بناء المكتبة. هنا ، يتم استخدام خطوة ثانية لتوليف الخيوط النهج البديل الذي تم استخدامه بنجاح هو إجراء ربط الحمض النووي أحادي الشريطة متبوعا بتخليق خيطثان 53.

  1. إلى 40 ميكرولتر من الحمض النووي بالتنقيط من الخطوة 4.12 ، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للخيط الثاني 5x (200 ملي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني 7 ، 22 ملي مولار MgCl2 ، 425 ملي مولار KCl) ، مزيج dNTP 10 ملي مولار (dATP ، dCTP ، dGTP ، و dTTT أو dUTP إذا كان المستخدم يخطط لتحقيق تسلسل DRIP خاص بخيوط ، 1 ميكرولتر 16 ملي مولار NAD ، و 32 ميكرولتر ماء. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 5 دقائق على الثلج.
  2. أضف 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي I (10 وحدات) ، 0.3 ميكرولتر من RNase H (1.6 وحدة) و 0.5 ميكرولتر من بكتريا قولونية DNA ligase. تخلط وتحتضن عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بتنظيف التفاعل على الفور باستخدام الخرز المغناطيسي بنسبة 1.6x. قم بتخطيب الحمض النووي في 40 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-Cl (الرقم الهيدروجيني 8).

6. خطوة صوتنة ما قبل المكتبة للحمض النووي RE فقط

ملاحظة: يؤدي التنقيط إلى استعادة شظايا الطاقة المتجددة التي غالبا ما يكون طولها كيلو قواعد وبالتالي فهي غير مناسبة لبناء المكتبة الفوري.

  1. لتقليل حجم المواد اللازمة لبناء المكتبة ، قم بصوتنة الحمض النووي المرسب المناعي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل. أداء 12 دورة من 15 ثانية ON / 60 ثانية OFF على سونيكاتر (تدور بعد ست دورات لضمان صوتنة متجانسة). انتقل إلى الخطوة 7.
    ملاحظة: لا تزال المادة المترسبة المناعية تحمل حلقات R ثلاثية الشريطة والتي تستجيب للصوتنة بشكل مختلف عن الحمض النووي المزدوج الشريطة.
  2. خطوة اختيارية: لتوحيد ملامح DRIP ، قم بمعالجة المواد المترسبة المناعية ب 1 ميكرولتر من RNase H في 1x RNase H buffer لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية قبل الصوتنة.

7. بناء المكتبة

  1. قم بإجراء الإصلاح النهائي عن طريق إضافة إلى 40 ميكرولتر من الخطوة 4.12 (تجزئة RE) أو الخطوة 5.3 (قص الصوتنة) 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوحدة الإصلاح الطرفية 10x ، و 2.5 ميكرولتر من 10 ملي مولار ATP و 2.5 ميكرولتر من إنزيم وحدة الإصلاح النهائي (إجمالي 50 ميكرولتر). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتضمين 1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخل المعاد هضمه والصوتنة (DRIP) أو صوتنة (sDRIP) لإنشاء مكتبات تسلسل التحكم المقابلة للحمض النووي للإدخال.
  2. قم بتنظيف التفاعل باستخدام حبات مغناطيسية (نسبة 1.6x) وقم بتصفية 34 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8).
  3. قم بإجراء المخلفات A عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2 ، و 10 ميكرولتر من 1 ملي مولار dATP ، و 1 ميكرولتر من Klenow exo- (إجمالي 50 ميكرولتر). تخلط جيدا وتحتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بتنظيف التفاعل باستخدام حبات مغناطيسية (نسبة 1.6x) وقم بإخراج 12 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8).
  5. قم بربط المحولات عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط السريع 2x ، و 1 ميكرولتر من محولات 15 ميكرومتر ، و 2 ميكرولتر من الليغاز السريع (إجمالي 30 ميكرولتر). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بتنظيف التفاعل باستخدام الخرز المغناطيسي (نسبة 1x) وقم بإزالة 20 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8).
  7. إذا تم إجراء قص صوتنة وتم استخدام dUTP في الخطوة 5.1 ، أضف 1.5 ميكرولتر (1.5 U) من Uracil N-glycosylase واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للحصول على DRIP خاص بخيط.
  8. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم 10 ميكرولتر من المكتبة من الخطوة 6.6 أو 6.7. أضف 1 ميكرولتر من برايمر تفاعل البوليميراز المتسلسل 1.0 P5 (انظر جدول المواد) ، و 1 ميكرولتر من برايمر PCR 2.0 P7 (انظر جدول المواد) ، و 15 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 3 ميكرولتر من الماء. اخلط جيدا.
  9. في التدوير الحراري ، قم بتشغيل البرنامج كما هو موضح في الجدول 1.
  10. انتقل إلى تنظيف المكتبة من خطوتين باستخدام الخرز المغناطيسي. استخدم أولا نسبة 0.65x لإزالة الأجزاء التي تزيد عن 500 نقطة أساس. احتفظ بالمادة الطافية. انتقل إلى نسبة 1x على المادة الطافية لإزالة الأجزاء التي تقل عن 200 نقطة أساس. قم بتقطيع 12 ميكرولتر من 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8).

8. مراقبة الجودة

  1. للتحقق من إثراء حلقة R باستخدام qPCR على موقعين سالبين وثلاثة مواقع إيجابية باستخدام طريقة Pfaffl ، استخدم 1 ميكرولتر من مكتبة التنظيف من الخطوة 6.10. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من المكتبة في 10 ميكرولتر من الماء واستخدم 2 ميكرولتر لكل موضع.
  2. تحقق من توزيع حجم المكتبة التي تم تنظيفها من الخطوة 6.10 باستخدام مجموعة DNA عالية الحساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن تحليل DRIP وكذلك sDRIP من خلال qPCR (الشكل 2 أ) و / أو التسلسل (الشكل 2 ب). بعد خطوة الترسيب المناعي ، يجب تأكيد جودة التجربة أولا بواسطة qPCR على مواقع التحكم الإيجابية والسلبية ، وكذلك مع الضوابط المعالجة ب RNase H. يتم توفير الاشعال المقابلة للمواقع المستخدمة بشكل متكرر في خطوط الخلايا البشرية المتعددة في الجدول 2. يجب عرض النتائج من qPCR كنسبة مئوية من المدخلات ، والتي تتوافق مع النسبة المئوية للخلايا التي تحمل حلقة R في وقت التحلل لموض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الموصوفة هنا بروتوكولان لرسم خريطة لهياكل الحلقة R في أي كائن حي محتمل باستخدام الجسم المضاد S9.6. يمثل DRIP-seq أول تقنية لرسم خرائط حلقة R على مستوى الجينوم تم تطويرها. إنها تقنية سهلة وقوية وقابلة للتكرار تسمح للمرء برسم خريطة لتوزيع حلقات R على طول أي جينوم. التقنية الثانية ، المسماة sDRIP-seq ، هي أيضا قوية وقابلة للتكرار ولكنها تحقق دقة أعلى وخصوصية الخيط بسبب تضمين خطوة صوتنة وبروتوكول بناء مكتبة تسلسل تقطعت بهم السبل. كلتا الطريقتين حساستان للغاية لعلاج RNase H قبل الترسيب المناع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم دعم العمل في مختبر Chedin بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM120607).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنبوب عالي الكثافة Maxtract هلام قفلالطور Qiagen129065
2 مل أنبوب قفل المرحلة هلام ضوءVWR10847-800
حبات Agarose A / GThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP الخرزبيكمان كولترA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
محولات الفهرسIlluminaتتوافق مع TrueSeq Single Indexes
Klenow Fragment (3 'to 5' exo-) NewEngland BioLabsM0212S
NEBNext End إصلاح وحدةنيو إنجلاند BioLabsE6050
PCR لتضخيمالمكتبةالتمهيدي 1.0 P5 (5 ' AATGATACGGCGACCACCGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
بادئات PCR لتضخيمالمكتبة PCR التمهيدي 2.0 P7 (5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3')
كحول الفينول / الكلوروفورم إيزوأميل 25:24: 1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash عالي الدقة PCR ماستر ميكسThermoFisher ScientificF548S
طقم ربط سريعنيو إنجلاند BioLabsM2200S
Ribonuclease Hنيو إنجلاند BioLabsM0297S
S9.6 الأجسام المضادةKerafastENH001هؤلاء الثلاثة المصادر مكافئة
للجسم المضاد S9.6Millipore / SigmaMABE1095
S9.6 الجسم المضادAbcamab234957

المراجع

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716(2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781(2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358(2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446(2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282(2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319(2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394(2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079(2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113(2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84(2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793(2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DRIP Seq S9 6 sDRIP Seq DNA
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة