الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البلعمة هي عملية منسقة تتضمن خطوات متميزة: التعرف والربط والاستيعاب. تأخذ الخلايا البلعمية الاحترافية طفيليات الليشمانيا عن طريق البلعمة ، والتي تتكون من التعرف على الأربطة على أسطح الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة المتعددة. يحدث ارتباط الليشمانيا بأغشية البلاعم من خلال مستقبلات المكمل من النوع 1 (CR1) والمستقبلات المكملة من النوع 3 (CR3) ومستقبلات التعرف على الأنماط. Lipophosphoglycan (LPG) و 63 kDa glycoprotein (gp63) هي الروابط الرئيسية المشاركة في تفاعلات البلاعم والليشمانيا . بعد التعرف الأولي على روابط الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة ، تصبح الطفيليات داخلية وتبقى على قيد الحياة وتتكاثر داخل الفجوات الطفيلية. تتضمن عملية نضج الفجوات التي يسببها الليشمانيا الحصول على جزيئات من الحويصلات داخل الخلايا ، بما في ذلك بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 1 (LAMP-1) ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 2 (LAMP-2) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 (LC3).
هنا ، نصف طرقا لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة باستخدام المجهر البؤري ، بما في ذلك (i) الربط (ii) الاستيعاب ، و (iii) نضج البلعمة. من خلال إضافة مجموعة المعرفة المحيطة بهذه المحددات لنتائج العدوى ، نأمل في تحسين فهم التسبب في عدوى الليشمانيا ودعم البحث النهائي عن أهداف جديدة للعلاج الكيميائي.
المقدمة
داء الليشمانيات هو مرض استوائي مهمل تسببه طفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من المظاهر السريرية في مضيف الفقاريات ، بما في ذلك داء الليشمانيات الجلدي ، داء الليشمانيات المخاطي الجلدي وداء الليشمانيات الحشوي 1. تقدر منظمة الصحة العالمية (WHO) أن أكثر من مليار شخص معرضون للخطر ، مع الإبلاغ عن أكثر من مليون حالة جديدة سنويا2.
الليشمانيا spp. هي بدائيات ملزمة داخل الخلايا التي تعيش داخل الخلايا المضيفة ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والبلاعم والخلايا المتغصنة3. تفاعل الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة تنطوي على مستقبل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على الخلايا من متبرعين أصحاء بعد الموافقة على الإجراءات من قبل اللجان الوطنية لأخلاقيات البحث (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. مزارع الخلايا
- البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية
ملاحظة: للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية للتمايز في المختبر إلى بلاعم ، قم بجمع الدم من متبرعين أصحاء وتنقية خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMC) كما هو موضح من قبل D. English و B. R. Andersen21.- بعد جمع الدم المحيطي (50 مل) ، اسكبه في أنبوب هيبارين ثم قم بتخفيف الدم 1: 1 في محلول عازل للفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة. ضع الدم الهيباريني المخفف برفق فوق وسط تدرج الكثافة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يهدف هذا التقرير إلى تقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة ل L. braziliensis المعزولة من المرضى الذين يقدمون L. braziliensis-LCL أو L. braziliensis-DL شكل CL. باستخدام المجهر البؤري ، قمنا بالتحقيق في الأحداث الرئيسية المرتبطة بالبلعمة للطفيليات: الربط ، والاستيعاب ، ونضج البلعمة. قمنا أولا بتقييم L. braziliensis-LCL أو L. braziliensis-DL وربط البلعمة بواسطة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية. وتبين البيانات أن كلا من L. braziliensis-LCL و L. braziliensis.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التفاعل بين الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة وينطوي على العديد من الخطوات التي يمكن أن تؤثر على تطور المرض5. لفهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها تفاعل الليشمانيا غير المتعثرة والخلايا المضيفة ، وصفنا بروتوكولا يستخدم المجهر الفلوري البؤري لتقييم البلعمة من المراحل المبكرة إلى المتأخرة من عدوى الليشمانيا. يتيح لنا استخدام تقنيات التألق التي تنطوي على اثنين أو أكثر من الفلوروفورات للتحقيق في آليات بيولوجيا الخلية ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية والتعبير عن البروتينات ذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة. يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
ونشكر معهد غونسالو مونيز وفيوكروز باهيا بالبرازيل وقسم الفحص المجهري على المساعدة. تم دعم هذا العمل من قبل INOVA-FIOCRUZ رقم 79700287000 ، P.S.T.V. حاصل على منحة للإنتاجية في الأبحاث من CNPq (305235/2019-2). تم تقديم البلازميدات بلطف من قبل موريسيو تيريبيزنيك ، جامعة تورنتو ، كاليفورنيا. يود المؤلفون أن يشكروا أندريس ك. والتر على مراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير نسخ المخطوطات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488 الماعز المترافق المضاد للأرانب IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 Novus | Biologicals | NB600-1384 | |
| الألبومين المصل البقري (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker أحمر (CMTPX) صبغ | ثيرمو فيشر العلمي | C34552 | |
| Centr & iacute ؛ فوجا | ثيرمو فيشر Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 | Thermo Fisher Scientific | X | |
| مجهر مضان متحد البؤر (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS)مجهر | جيبكو | 10270106 | |
| الفلوري (أوليمبوس Lx73) | أوليمبوس | أوليمبوس Lx73 | |
| جينتاميسين | جيبكو | 15750045 | |
| الجلوتامين | ثيرمو فيشر العلمي | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-هيدروكسي إيثيل بيبرازين -N'-2-حمض الإيثان-سلفونيك) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4< / sub>Cl | Sigma | A9434 | |
| مصل الماعز العادي | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| محلول Nucleofector | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| أسيتات فوربول ميريستات (PMA) | Sigma | P1585 | |
| محلول عازلة الفوسفات (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| مجموعة ProLong Gold Antifade | Life Technologies | P36931 | |
| معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| حشرة متوسطة | سيجما | S0146 | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما | S5761 | |
| بيروفات الصوديوم | سيجما | S8636 | |
| تريتون X-100 | سيجما | إكس |
المراجع
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
