تم استخدام طريقة زراعة الأعضاء من نوع Trowell لكشف شبكات الإشارات المعقدة التي تحكم نمو الأسنان ، ومؤخرا ، لدراسة التنظيم الذي ينطوي عليه الخلايا الجذعية لقاطعة الفأر التي تنمو باستمرار. تسهل النماذج الحيوانية الفلورية وطرق التصوير الحي التحليلات المتعمقة للخلايا الجذعية للأسنان وبيئتها المكروية المتخصصة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعتمد نمو الأعضاء ووظيفتها وتجديدها على الخلايا الجذعية ، والتي تتواجد داخل مساحات تشريحية منفصلة تسمى منافذ الخلايا الجذعية. توفر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. توجد الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة الظهارية للقاطعة في الطرف القريب من السن في مكان يسمى حلقة عنق الرحم. أنها توفر تدفقا مستمرا للخلايا لموازنة التآكل المستمر لطرف السن ذاتي الشحذ. يظهر هنا بروتوكول مفصل لعزل وثقافة الطرف القريب من قاطعة الفأر التي تضم الخلايا الجذعية ومكانتها. هذا هو بروتوكول زراعة الأعضاء المعدل من نوع Trowell الذي يتيح زراعة قطع الأنسجة في المختبر (explants) ، بالإضافة إلى شرائح الأنسجة السميكة في واجهة السائل / الهواء على مرشح مدعوم بشبكة معدنية. يتيح بروتوكول زراعة الأعضاء الموصوف هنا التلاعب بالأنسجة غير الممكنة في الجسم الحي ، وعندما يقترن باستخدام مراسل (مراسلين) فلوري ، فإنه يوفر منصة لتحديد وتتبع مجموعات الخلايا المنفصلة في الأنسجة الحية بمرور الوقت ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. يمكن اختبار الجزيئات التنظيمية المختلفة والمركبات الدوائية في هذا النظام لتأثيرها على الخلايا الجذعية ومنافذها. يوفر هذا في النهاية أداة قيمة لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية وصيانتها.
المقدمة
تنمو قواطع الفأر باستمرار بسبب الحفاظ مدى الحياة على الخلايا الجذعية (SC) التي تدعم الإنتاج المستمر لمكونات الأسنان. وتشمل هذه SCs الظهارية ، التي تولد الأرومات المينائية المنتجة للمينا ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تولد الأرومات السنية المنتجة للعاج ، من بين خلايا أخرى1. تم تحديد SCs الظهارية في القواطع المتنامية باستمرار في البداية على أنها خلايا تحتفظ بالتسمية 2,3 ومنذ ذلك الحين ثبت أنها تعبر عن عدد من جينات الجذعية المعروفة ، بما في ذلك Sox24. تشترك هذه الخلايا في سمات مشتركة مع SCs الظهارية في الأعضاء الأخرى وتتواجد داخل مكانة SC تسمى حلقة عنق الرحم الموجودة على الجانب الشفوي من القاطعة. المكانة هي كيان ديناميكي يتكون من خلايا ومصفوفة خارج الخلية تتحكم في نشاط SC5. أظهرت دراسات تتبع النسب أن Sox2+ SCs الظهارية يمكنها تجديد المقصورة الظهارية بأكملها من السن وأنها ضرورية لتشكيل الأسنان المتتالية 6,7. يتم تجنيد MSCs ذات إمكانات إصلاح العاج أو التجدد إلى حد كبير من خارج العضو من خلال الأوعية الدموية والأعصاب8،9،10،11 ، وبالتالي ، توفير نموذج مناسب لدراسة التوظيف والهجرة والإسكان لسكان MSC.
إن دراسة SCs في الجسم الحي ليست ممكنة دائما ، لأن العديد من التلاعب الجيني و / أو الدوائي يمكن أن يؤثر على توازن الأعضاء و / أو يكون له عواقب مميتة. لذلك ، توفر زراعة الأعضاء أداة ممتازة لدراسة تنظيم SCs ومنافذها في المختبر. تم تطوير نظام زراعة الأعضاء الذي يستخدم شبكة معدنية في البداية بواسطة Trowell12 لدراسة تطور الأعضاء وتم تعديله بواسطة Saxen13 لدراسة الإشارات الاستقرائية في تطور الكلى. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه الطريقة في المختبر لزراعة كل أو جزء من العضو بنجاح في مجالات مختلفة. في مجال تطور الأسنان ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأسنان14 وتشكيل الأسنان المتتالية15. أظهر عمل مختبر Thesleff فائدة هذا النظام للتحليل الزمني لنمو الأسنان وتكوينها ، لتحليل تأثير الجزيئات المختلفة وعوامل النمو على نمو الأسنان ، وللتصوير الحي بفاصل زمني لتطور الأسنان16,17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تنظيم SCs القاطعة ومكانتها18،19 ، والتي تم وصفها بالتفصيل هنا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتضمن هذا البروتوكول استخدام الحيوانات وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان الأخلاقية المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها ومرفق الحيوانات في جامعة هلسنكي.
1. إعداد طبق ثقافة الجهاز
- تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء التدفق الصفحي. نظف أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم أدوات وحلول الزجاج المعقم. تعقيم المقص والمعدات المعدنية الأخرى في معقم حبة زجاجية.
- قم بإعداد المرشحات المخزنة عادة في 70٪ من الإيثانول عن طريق غسلها ثلاث مرات في 1x PBS لإزالة الإيثانول (الشكل 1). قطع المرشحات إلى قطع مستطيلة (3 × 3-5 × 5 مم).
ملاحظة: يمكن تخزين قطع الفلتر المغسولة لعدة أيام في 1x PBS عند 4 درجات مئوية. - تحضير وسط الاستزراع (1: 1 DMEM: F12 مكمل ب 1٪ [v / v] 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide في 0.85٪ NaCl ، 10٪ [v / v] FBS ، 150 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.2٪ [v / v] البنسلين [10000 وحدة دولية / مل] والستربتومايسين [10000 ميكروغرام / مل]). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- ضع الشبكات المعدنية مقاس 30 مم (مع فتحات قطرها 1-2 مم تتيح تصوير الأنسجة) في طبق بتري 35 مم. أضف وسائط كافية للوصول إلى سطح الشبكة دون إنتاج فقاعات هواء. قم بتسخين طبق الاستزراع المحضر مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى يتم عزل الأنسجة وجاهزة للثقافة (في حاضنة قياسية بها 5٪ CO2 و 90٪ -95٪ رطوبة).
2. تشريح القاطعة وعزل النهاية القريبة
- التضحية بالحيوانات باتباع بروتوكول رعاية الحيوان المعتمد.
- قطع رأس الماوس وتشريح الفك السفلي. للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة الجلد لفضح الفك السفلي وقطع عضلات المفصل لفصله عن الفك العلوي وبقية الرأس.
- بمجرد عزل الفك السفلي ، قم بإزالة اللسان وأكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
- جمع كل الفك السفلي والاحتفاظ بها في طبق بتري يحتوي على PBS على الجليد ، لأن هذا يعزز صلاحية الأنسجة.
- انقل أحد الفك السفلي إلى طبق بتري زجاجي واستخدم إبر تحت الجلد يمكن التخلص منها 20/26 جم لتشريح القاطعة تحت المجهر المجسم. تقسيم الفك السفلي في خط الوسط ، وقطع من خلال الارتفاق . نظف الأنسجة الرخوة والعضلية بعيدا عن سطح العظام للحصول على تصور أفضل.
ملاحظة: طبق بتري الزجاجي ضروري ، لأن هذا لن يضعف الإبر. - الفك السفلي الذي يتم الحصول عليه من الحيوانات التي تقل أعمارها عن 10 أيام أكثر ليونة وهشاشة ، لذلك ، استخدم إبر تحت الجلد 20/26 جم يمكن التخلص منها لفتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 10 أيام ، استخدم الملقط للإمساك بالفك السفلي وكسر العظم لكشف السن.
- افصل القاطعة برفق عن العظم المحيط واقطع الطرف القريب الذي يحتوي على حلقة عنق الرحم.
- قطع الطرف القريب وإزالة المينا المعدنية ومصفوفة العاج.
- احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني دولبيكو على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع.
3. الثقافة
- ضع بعناية مستطيل مرشح على الجزء العلوي من الشبكة في طبق ثقافة تم تسخينه مسبقا.
- استخدم مجهرا مجسما لتوجيه قطع الأنسجة بشكل صحيح.
- ضعه في حاضنة قياسية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 90٪ -95٪ رطوبة.
- قم بتغيير الوسيط كل يوم واستبدله بوسط جديد ، وتجنب بعناية تكوين فقاعات الهواء. راقب نمو الأنسجة وقم بالتصوير يوميا باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر المجسم.
4. إضافة عوامل قابلة للذوبان في الثقافة
- استكمل وسط الاستزراع بعوامل قابلة للذوبان وجزيئات ذات أهمية لدراسة تأثيرها على تنظيم SCs.
ملاحظة: يعتمد بروتوكول الإدارة لأي جزيء (عوامل النمو ، جزيئات الإشارات ، الأجسام المضادة المانعة ، المركبات الدوائية مثل المثبطات أو المنشطات ، النواقل ، إلخ) على عمر النصف والذوبان. تحدد هذه المعلمات أيضا عنصر التحكم المناسب الذي سيتم استخدامه.
5. التحليلات الجزيئية والنسيجية
- إزالة وسط الثقافة.
- أضف بعناية الميثانول المثلج البارد إلى الأنسجة لمنع الانفصال عن المرشحات.
- اترك الميثانول لمدة 5 دقائق.
- نقل المرشحات التي تحمل الأنسجة إلى أنابيب أخذ العينات.
- ثبت النباتات الخارجية في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- المضي قدما في البروتوكولات المعمول بها للمعالجة النسيجية (البارافين ، المجمدة ، إلخ) أو البقع المناعية.
6. ثقافة شرائح الأنسجة
ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات في هذا البروتوكول ، والتي تكون جميعها ناجحة بنفس القدر وهي مسألة اختيار شخصي ، اعتمادا على سرعة ومهارة المستخدم. تشير هذه إلى المخزن المؤقت المستخدم لجمع والحفاظ على صلاحية الأنسجة. لهذا الغرض ، يمكن استخدام Krebs buffer ، PBS المكمل ب 2٪ من الجلوكوز والمضادات الحيوية ، أو PBS. إذا تم استخدام المخزن المؤقت Krebs ، فيجب أن يتم ذلك قبل يوم واحد والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية.
- قبل التجربة ، قم بإعداد 4٪ -5٪ أغاروز منخفض نقطة انصهار عن طريق إذابة 2-2.5 جم من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار في 50 مل من الجلوكوز المغلي 2٪ / PBS ، وبعد ذلك يجب وضع المحلول في حمام مائي 45 درجة مئوية.
- قم بإعداد الاهتزاز ، واغسله بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واملأه بجلوكوز 2٪ / PBS بارد مع المضادات الحيوية (100 وحدة / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين).
- قم بتشريح الأطراف القريبة من القاطعة واجمعها في الجلوكوز البارد 2٪ / PBS المكمل بالمضادات الحيوية.
- ضع نهاية واحدة قريبة من القاطعة في القالب الذي يحتوي على 4٪ -5٪ من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار. تحت المجهر المجسم ، قم بتوجيه القطعة في الاتجاه المطلوب واتركها على الجليد حتى تصلب الأغاروز.
- تقليم كتلة agarose تصلب ووضعها في vibratome. قطع شرائح سميكة (150-300 ميكرومتر).
- اجمع الشرائح في طبق بتري يحتوي على جلوكوز مثلج 2٪ / PBS مكمل بالمضادات الحيوية.
- استخدم ملعقة لنقل الشرائح السميكة على مستطيل مرشح يوضع على الشبكة التي تم تسخينها مسبقا كما في القسم 1.3.
- احتضان الشرائح السميكة في الحاضنة والمضي قدما في التصوير (الشكل 2).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توجد SCs الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، والذي يقع في الطرف القريب من القاطعة (الشكل 3 أ). حلقات عنق الرحم هي هياكل متميزة شكليا تتكون من ظهارة المينا الداخلية والخارجية التي تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض (الشكل 3 ب ، ج). هناك حلقتان عنق الرحم في كل قاطعة (الشكل 3 أ) ، لكن حلقة عنق الرحم الشفوية فقط تحتوي على SCs. يتم توطين SCs الظهارية في الشبكة النجمية وظهارة المينا ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم استخدام زراعة الأعضاء في المختبر على نطاق واسع لدراسة الإمكانات الاستقرائية والتفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأعضاء والتشكل. أظهر مختبر Thesleff كيفية تكييف تعديل Saxén لثقافة الأعضاء من نوع Trowell واستخدامها لدراسة تطور الأسنان14. جعلت الظروف والتطورات القابلة للتكرار في مراسلي الفلورسنت هذه طريقة مفيدة لمراقبة تشكل الأسنان ومجموعات الخلايا المتميزة بداخلها. وصفت هذه الورقة كيفية تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الخلايا الجذعية الظهارية والبيئة المكروية التي تعيش فيها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة جين وآتوس إركو.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محاقن | |||
| يمكن التخلص منها 20/26 قياس إبر تحت الجلد | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Spice Buffered Phosphate-Salter | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn | Scissors FST | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS أمريكا الجنوبية (CE) | LifeTechn. | 10270106 | قسمة في aliquotes ، وتخزينها عند -20 درجة ؛ |
| معقم حبة زجاجية C ، معقم Steri 250 ثانية | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 ملي مولار L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters ، قطر 0،1 um 25 مم | MerckMillipore | VCTP02500 | يخزنها في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. |
| حمض الأسكوبيك | سيجما | A4544-25g | مخفف 100 مجم / مل في MilliQ ، مرشح مفصول ومقسمة إلى 20 & mu ؛ ل Aliquotes ، مخزن في الظلام ، -20 درجة ؛ C |
| شبكات معدنية | |||
| قم بقص القرص بقطر 30 مم تقريبا وثني الحواف لإعطاء ارتفاع 3 مم. استخدم المسامير لعمل ثقوب. | |||
| ملقط دقيق | Medicon | 07.60.03 | |
| بارافورمالدهيد | سيجما-ألدريتش | ||
| بنسلين ستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) سول. | أطباق جيبكو | 15140-148 | |
| بتري ، زجاج صودا - جير | DWK علوم الحياة | 9170442 | |
| بتريديش 35 مم ، مع فتحة تهوية | دوران | 237554008 | |
| بتريديش 90 مم ، بدون تنفيس كلاسيكي | مقص ثيرمو فيشر | 101RT / C | |
| مقص صغير |
المراجع
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963(2020).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
